第四章　结核分枝杆菌的生理生化

【摘要】结核分枝杆菌是结核病的病原菌，深入了解结核分枝杆菌的生理生化特性，是预防控制结核病的基础。近一年来，国内学者在结核分枝杆菌抗原的免疫原性及抗原表位的研究集中在Rv2626c、Rv2654、Rv3621c和ManLAM等对结核分枝杆菌存活的影响。RmlA和AG等被发现是重要的毒力因子，MSMEG_1415在耻垢分枝杆菌持续生存中发挥重要作用，Rv2642（CdiR）和Rv1453的研究同样为揭示结核分枝杆菌耐药机制提供了重要的依据。

【关键词】结核分枝杆菌；免疫原性；抗原表位；毒力因子；持留感染；耐药

结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis，MTB）是缓慢生长菌，有分枝生长的倾向，由于细胞壁内含有大量的分枝菌酸，包围在肽聚糖的外面，而具有抗酸染色特性。MTB的生理生化的特殊性，不仅使其在自然环境中具有较强的抵抗力，如在阴湿处能生存5个月以上；MTB还能通过多种逃逸机制而抵抗宿主细胞的杀伤。由此可见，深入研究MTB的生理生化特性，为更好地理解结核病（tuberculosis，TB）的发病机制和防控提供有利的基础。

一、结核分枝杆菌抗原的免疫原性及抗原表位

Rv2626c基因的表达是MTB处于休眠期的重要标志之一，Rv2626c抗原受控于休眠调节子 DosR（dormancy regulon），编码缺氧反应蛋白 1（hypoxic response protein 1，Hrpl），Hrpl蛋白具有较好的抗原性和免疫原性，能有效刺激机体产生一定的细胞免疫及较高的抗体水平，并且该蛋白易被LTBI患者所识别。刘静等［1］应用生物信息学预测分析Hrpl蛋白结构功能和生物学特性。发现Hrpl蛋白原子总数2 166，等电点4.96，不稳定性指数19.62，脂肪族氨基酸指数100.35，平均疏水性0.042，有跨膜区无信号肽，有1个糖基化位点、6个磷酸化位点，二级结构以α-螺旋为主。其亚细胞定位于细胞质，属于稳定的亲水性蛋白。经预测，Hrbl蛋白含有4个B细胞表位，多个T细胞表位，且其相互作用蛋白分别为Rv2627c、Rv2628、Rvl738、devR、Rv2624c、TB31.7、rip3、pfkB、guaA、hspX，并参与多种生物学过程。因此，HrPl蛋白为稳定亲水性胞浆蛋白，具有良好的抗原表位，为TB诊断及治疗的潜在候选因子，是探索MTB持久性感染机制的重要研究靶标，可作为抗结核多肽疫苗的候选蛋白。李娜等［2］预测与分析了MTB潜伏感染相关抗原Rv2626c的B细胞、CTL及Th细胞表位，最终Rv2626c中的4个B细胞表位肽、8个限制性CTL细胞表位以及5个辅助性Th细胞表位被成功预测。因此，Rv2626c蛋白含丰富抗原表位，具有较强的体液免疫原性和细胞免疫原性，为TB的临床诊断和进一步研制抗结核多表位疫苗奠定一定的理论基础。

陈富超等［3］成功表达MTB抗原Rv2654重组蛋白，以Rv2654重组蛋白作为抗原的ELISA结果显示其与卡介苗接种者或活动期结核患者血清均有反应性。Rv2654重组蛋白免疫小鼠可促进小鼠外周血 IFN-γ、TNF-α、IL-2、IL-4、IL-6和IL-10等多种细胞因子表达（均P ＜ 0.05），流式细胞术结果显示Rv2654重组蛋白可显著刺激CD4+T细胞和CD8+T细胞分化为效应T细胞，这种作用在联合卡介苗应用时更为明显，Rv2654重组蛋白也能刺激小鼠B细胞活化增殖并向记忆细胞分化。因此，他们认为Rv2654重组蛋白可诱导小鼠的细胞免疫应答，而且与卡介苗接种者和活动性肺结核患者血清有较好的结合能力，有望作为结核病免疫学预防和诊断类疫苗的候选抗原。

毛莉蓉等［4］构建MTB感染分泌期表达的RD9区抗原Rv3621c并进行纯化，通过人群外周血试验和小鼠试验检测rRv3621c的特异性和免疫原性，发现在rRv3621c蛋白诱导下，活动性结核（active tuberculosis，ATB）患者外周血淋巴细胞释放的IFN-γ水平明显较高（t=4.813，P ＜ 0.01），且 ATB 患者产生的 IFN-γ水平高于潜伏性结核（latent tuberculosis infection，LTBI）人群（t=4.442，P ＜ 0.01）。BCG+Rv3621c/MTM 组小鼠产生的特异性抗体滴度水平明显高于 Rv3621c/MTM 组（P ＜ 0.01）和 BCG 组（P ＜ 0.01），Rv362lc/MTM 组和BCG+Rv3621c/MTM组小鼠的IgG2a/IgG1比值大于1，明显高于MTM组和BCG组。BCG+Rv3621c/MTM组小鼠均分泌高水平IFN-γ、TNF-α和IL-2。Rv3621c/MTM组小鼠肺脏组织中IFN-γ、TNF-α及iNOS表达水平较高。说明MTB感染者外周血T细胞可特异性识别rRv3621c蛋白。rRv3621c混合佐剂MTM可以诱导较强烈的抗原特异性Thl型免疫应答。

唐晓磊等［5］成功提取并纯化了脂阿拉伯甘露聚糖（ManLAM），并通过气相色谱鉴定其甘露糖和阿拉伯糖的比例约为12.6：9.4。ManLAM通过与肥大细胞的Toll样受体2（TLR2）结合，产生的外泌体中CC趋化因子配体2（CCL2）、IL-4和IL-13水平较高。ManLAM诱导产生的外泌体能够招募巨噬细胞并且促进其高表达M2型标志分子精氨酸酶1、IL-10和发现于炎症区分子1（FIZZ-1）。这些结果表明，ManLAM刺激肥大细胞分泌外泌体间接诱导巨噬细胞向M2型极化使MTB逃避免疫清除。

Rv0446c是一种MTB的保守膜蛋白，王雪枝等［6］利用TE-predict和IEDB在线表位预测软件对Rv0446c上的T细胞表位进行预测，然后通过人群免疫学实验和动物实验对T细胞表位及其免疫特征进行筛选和验证。发现预测的7条表位多肽中，ELISpot试验筛选出4条阳性T细胞表位多肽P120、P121、P122、P123，在结核病患者中检测灵敏度和特异度分别为30.0%、18.0%、6.0%、22.0%和96.8%、98.9%、100%、96.8%。与PBS对照组和血蓝蛋白（KLH）组比较，P120多肽能刺激小鼠产生较高水平的IFN-γ、IL-4、IL-10，P121多肽刺激小鼠产生较高水平的 IFN-γ和 IL-4（均 P ＜ 0.05），P123 多肽刺激小鼠产生较高水平的 IFN-γ（均P ＜ 0.05）。P120、P121、P123 多肽刺激小鼠产生的 IL-2 的水平高于 PBS 组低于 Ag85B-L 组和 Ag85B-H 组（均 P ＜ 0.05），但与 KLH 组差异无统计学意义（均 P ＞ 0.05）。这些结果表明，Rv0446c蛋白及其T细胞表位具有较好的免疫原性及免疫反应性，能刺激机体产生强烈的细胞免疫应答，可用于TB的临床诊断技术研究和新型结核亚单位疫苗的构建。

二、结核分枝杆菌的毒力因子

MTB细胞壁含有多种甘露糖缀合物，包括脂甘露聚糖（LM）和脂阿拉伯甘露聚糖（LAM）。这些脂多糖参与细胞壁的完整性维持，并通过调节宿主的免疫反应在MTB的毒力中发挥作用。GDP-甘露糖是合成脂多糖所必需的，由甘露糖-1-磷酸鸟苷转移酶（ManB）催化。这种酶在原核生物和真核生物中具有类似的功能。然而，ManB的生物学作用及其酶活性在MTB中仍未明确。Taj等［7］通过MTB H37Ra的manB基因敲除菌株来阐明酶的作用，发现敲除manB可抑制细胞生长，并通过改变细胞膜的通透性影响MTB的形态。这些发现提供了对ManB功能的认识，提示ManB可能是新型抗结核药物的潜在靶点。

丝氨酸 /苏氨酸蛋白激酶（serine/threonine protein kinase，STPK）的丝氨酸 /苏氨酸（Ser/Thr）磷酸化在分子调控中发挥重要作用，使分枝杆菌能够根据环境变化调整细胞壁结构。Qu等［8］报道了RmlA，一种关键的L-鼠李糖生物合成酶，是结核分枝杆菌MTB STPK PknB的底物。质谱法分析显示RmlA在Thr-12、Thr-54、Thr-197处被磷酸化，而Thr-12位于RmlA的催化三联体附近。对两个RmlA突变体T12A/T12D的生化和表型分析表明，其活性降低，细胞壁形成受到负面影响。此外，RmlA T12D突变体的毒力在巨噬细胞模型中减弱。因此，这些结果为pknb依赖的RmlA磷酸化在调节MTB细胞壁形成中的作用提供了第一个证据，对致病性具有重要意义。

分枝杆菌阿拉伯半乳聚糖（arabinogalactan，AG）是分枝杆菌细胞壁的重要组成部分，也是抗结核药物开发的常用结构和生物合成靶点。Wu等［9］报告分枝杆菌AG被半乳凝素-9识别并加剧分枝杆菌感染。AG特异性适配子的使用可抑制MTB或牛分枝杆菌BCG引起的细胞浸润，并适度提高MTB感染小鼠或海分枝杆菌感染斑马鱼的存活率。AG以高亲和力与半乳凝素-9的糖识别结构域（carbohydrate recognition domain，CRD）2相互作用，半乳凝素-9通过CRD2与转化生长因子β激活激酶1（TAK1）结合，触发细胞外信号调节激酶（ERK）的激活和基质金属蛋白酶（MMP）的表达。此外，敲除半乳凝素-9或抑制MMP均可阻断AG诱导的小鼠肺部病理损伤，且AG-半乳凝素-9轴加重MTB感染过程。这些结果表明AG是分枝杆菌的重要毒力因子，半乳凝素-9是MTB等分枝杆菌的新型受体，为开发新型有效的TB免疫调节剂铺平了道路。

RimI基因编码的核糖体蛋白丙氨酸乙酰转移酶（ribosomal-protein-alanine acetyltransferase，RimI）为MTB GCN5相关N-乙酰转移酶家族成员。陈润等［10］为探索RimI的生物学特性及其对MTB致病性的影响，构建了过表达MTB rimI基因的重组菌株Msm：：pMV261-rimI。发现相较于对照菌株，过表达rimI的菌株在生长前、中期速率降低，生物膜早期成膜变缓，但不影响生物膜的后期成熟。同时，过表达rimI的菌株抵抗低氧、低pH、H₂O₂等逆环境的能力增强，在巨噬细胞内的存活能力增强。这些结果提示，rimI基因对分枝杆菌的生物膜形成、抗逆性及细胞内生存具有重要作用，可能与MTB的毒力密切相关。

PE_PGRS60蛋白（Rv3652）具备纤维连接蛋白结合特性，通过与宿主的纤维连接蛋白（fibronectin，Fn）有效结合，有利于分枝杆菌发挥毒力作用。沈芯等［11］发现克隆纯化的MTB PE_PGRS60蛋白促进RAW264.7细胞中COX2的显著表达，并活化了MAPK家族的3个主要成员，即细胞外调节蛋白激酶（extracellular regulated protein kinase，ERK）、p38 和 c-Jun氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinase，JNK），但只有 JNK 的抑制剂 JNK-IN-7 可阻断 PE_PGRS60诱导的COX2上调。后续研究发现，COX2在活动性肺结核患者PBMC中的表达也升高。COX2抑制剂塞来昔布可有效阻断PE_PGRS60诱导的炎症因子IL-1β、TNF-α和IL-6表达，并促进巨噬细胞死亡。这些结果提示PE_PGRS60可通过激活JNK/COX2信号轴，促进巨噬细胞释放炎症因子，在COX2的阻止下仍有部分巨噬细胞发生死亡。

过氧化物酶体增殖物激活受体 γ（peroxisome proliferator-activated receptor γ，PPARγ）是一种配体依赖的核转录因子，属于Ⅱ型核激素受体超家族成员。配体激活的PPARγ参与调控免疫炎症反应、脂质代谢、糖稳态等机体众多的生理和病理过程。刘冬梅等［12］发现MTB感染显著升高巨噬细胞中PPARγ表达（P ＜ 0.001）、促进细胞内脂质聚集及CD36表达，降低细胞培养上清中 TC、TG、LDL-C 和 HDL-C 含量（P ＜ 0.001）和细胞增殖率（P ＜ 0.001）。PPARγ激动剂ROZ可显著增强MTB感染所致的细胞内脂质聚集及CD36表达，进一步下调细胞培养上清中脂质水平及各细胞增殖率，而PPARγ拮抗剂GW9662则逆转上述作用。赵晓杰等［13］发现 MTB 显著升高小鼠肺组织 PPARγ表达（P ＜ 0.01）及脂质水平（P ＜ 0.05），并诱导CD36表达，但降低小鼠血浆脂质浓度（P ＜ 0.05）；PPARγ激动剂罗格列酮能够增强MTB所诱导的肺组织脂质水平的升高、血浆脂质浓度的下降及CD36的表达，并且加重肺组织结核性病理改变；PPARγ拮抗剂GW9662则逆转MTB所诱导的上述作用；各组小鼠肺组织 PPARγ表达与荷菌量呈正相关（r=0.812，P ＜ 0.01）。这些结果表明，PPARγ通过 CD36途径影响MTB感染小鼠脂质代谢，MTB诱导的PPARγ表达对MTB是一种逃避机体免疫系统对其进行清除的逃逸机制，而这种逃逸与PPARγ活化所致脂质聚集有关。

何莹等［14］就MTB介导TWIK2-NLRP3通路参与肺泡巨噬细胞损伤的影响进行分析，发现MTB和卡介苗菌株均介导TWIK2-NLRP3通路参与小鼠肺泡巨噬细胞损伤。小鼠体内注入适量MTB可被肺泡巨噬细胞吞噬，MTB可促进肺泡巨噬细胞的凋亡与损伤，其作用机制可能与TWIK2的激活密切相关。

三、结核分枝杆菌的持留

MazEF系统与MTB病原体中“持久细胞”的形成有关。Chen等［15］报告了MTB MazF-mt1和MazF-mt9的共晶体结构，这是两个重要的MazF成员，分别负责特定的mRNA和tRNA剪切，以截短形式与其同源的抗毒肽形成复合物。这些肽与毒素结合，与它们的全长抗毒素有相当的亲和力，这将降低毒素的体外RNA清除能力。在对结合模式进行结构分析后，他们系统测试了截短MazE-mt9肽段中单个残基的取代对其亲和力的影响。此研究为MazE/F-mt TA对之间的结合模式和抑制机制提供了结构上的见解。更为重要的是，通过靶向新型MTB蛋白，有助于未来抗结核肽类抗菌药的设计，并可能缓解耐药问题。

L-精氨酸是一氧化氮（NO）的前体，NO是一种宿主免疫效应物，可对抗包括MTB在内的细胞内病原体。包括MTB在内的病原微生物已经进化出多种针对精氨酸的策略来阻断NO的产生，以更好地生存和增殖。Yan等［16］报告了耻垢分枝杆菌MSMEG_1415（MTB Rv2324的同系物）作为精氨酸响应转录因子调节精氨酸酶途径。在缺乏L-精氨酸的情况下，MSMEG_1415作为阻遏物抑制roc（对于精氨酸、鸟氨酸分解代谢）基因簇的转录，从而关闭精氨酸酶途径。L-精氨酸可以解除MSMEG_1415对roc基因簇的转录抑制作用，激活精氨酸酶途径。而且，L-精氨酸-MSMEG_1415复合物通过识别和结合一个15bp的回文基序，激活roc基因簇的转录，从而阻止L-精氨酸在耻垢分枝杆菌中的过量积累。生理上，MSMEG_1415使分枝杆菌能够抵抗饥饿和氟喹诺酮类药物的暴露，提示其在耻垢分枝杆菌持续生存中发挥重要作用。此研究结果揭示了分枝杆菌中精氨酸代谢的独特调控机制，并确定MTB Rv2324是设计抗结核药物的一个有吸引力的候选靶点。

四、结核分枝杆菌的耐药

为了确定特异性的候选靶蛋白作为诊断标志物或药物靶点，药物敏感（DS）菌株和耐药（DR）菌株之间的蛋白表达差异仍有待研究。Ullah等［17］采用无标记的定量蛋白质组学技术来比较DS、RR、MDR和XDR临床菌株的蛋白质组。发现iniC、Rv2141c、folB和Rv2561在RR和MDR菌株中均表达上调，而fadE9、espB、espL、esxK和Rv3175在DR菌株中表达下调。此外，lprF、mce2R、mce2B和Rv2627c在3株DR菌株中均有特异性表达，而在DS菌株中有41个蛋白未检测到。功能分类显示，这些差异表达蛋白主要参与细胞壁和细胞过程。与 RR 株相比，Rv2272、sMTB、lpqB、icd1 和 folK 均上调，esxK、PPE19、Rv1534、rpmI、ureA、tpx、mpt64、frr、Rv3678c、esxB、esxA 和 espL 均下调。此外，nrp、PPE3、mntH、Rv1188、Rv1473、nadB、PPE36和sseA在MDR和XDR菌株中均有特异表达，而与RR菌株相比，有292个蛋白未被识别。与MDR菌株相比，XDR菌株上调蛋白有52个，下调蛋白有45个。有316个蛋白在XDR菌株中特异性表达，而有92个蛋白在MDR菌株中特异性表达。蛋白质相互作用网络进一步揭示了其参与毒力和耐药性的机制。因此，这些差异表达蛋白对于探索耐药结核病的有效控制策略具有重要意义。

在MTB中，已发现几种转录调节因子在调节其耐药性方面发挥着必不可少的作用。Yang等［18］发现Rv2642（CdiR）编码的ArsR家族转录调节因子对异烟肼（INH）有反应。CdiR负调控自身和邻近基因，包括arsC（砷转运整合膜蛋白ArsC的基因）。CdiR直接与INH和Cd（Ⅱ）相互作用。INH和Cd（Ⅱ）的结合均降低了其DNA结合活性。干扰cdiR基因增加INH的药物敏感性，而过表达cdiR则降低药物敏感性。令人吃惊的是，过表达arsC增加了药物敏感性，同时也增加了cdiR。此外，cdiR和arsC的表达变化均引起了对利福霉素和乙胺丁醇等其他药物的敏感性，其中cdiR缺失株的最低抑菌浓度与arsC过表达株相当，提示CdiR调控耐药的功能主要依赖于arsC。此外，他们还发现Cd（Ⅱ）以CdiR依赖的方式增强了细菌对异烟肼的抗性。因此，CdiR在Cd（Ⅱ）金属离子与分枝杆菌药物敏感性之间的相互作用中起着关键作用。

氯法齐明在耐药结核病的治疗中发挥着重要作用。Li等［19］构建了Rv1453敲除、互补和过表达菌株。采用微量板阿尔玛蓝法（MABA）检测氯法齐明对MTB的最低抑菌浓度（MIC）。采用定量逆转录酶PCR检测Rv1453及其邻近基因的转录水平。用纯化的Rv1453蛋白进行电泳移动性移位试验（EMSA），鉴定Rv1453蛋白的结合位点。发现与MTB H37Rv相比，氯法齐明对Rv1453敲除菌株的MIC增加约4倍，对Rv1453过表达菌株的MIC降低约4倍。进一步分析发现，Rv1453蛋白作为调节蛋白，与qor的RNA聚合酶结合位点结合，阻断转录过程。此研究初步揭示了MTB Rv1453蛋白通过调节qor转录水平影响其对氯法齐明的敏感性，从而为氯法齐明的耐药机制提供了新的线索。

（孔成成　唐神结）

参考文献

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