第三章　结核病疫苗

【摘要】2021年，由我国研究者开发的微卡疫苗正处于Ⅲ期临床试验阶段，亚单位疫苗AEC/BC02正进行Ⅰ期临床试验。此外，我国学者设计研发了多种新型结核疫苗，包括DNA疫苗、重组BCG、重组亚单位疫苗等，并对部分疫苗的免疫原性进行了评估。与此同时鉴定了多种新型结核抗原，在新型佐剂的研发方面也取得了一定成果。

【关键词】亚单位疫苗；融合菌株；新抗原；免疫原性；表位预测

安全有效的结核病疫苗是实现终止结核病策略的重要保障。近1年，我国研究者设计构建了多种结核亚单位疫苗，并进行了初步评价。此外，研究者尝试运用原生质体融合技术构建融合菌株疫苗，为新型疫苗的设计提供了新思路。新型的抗原筛选一直是国内外研究者较关注的方向，我国研究者对一些潜在的结核抗原进行了表位预测等初步分析，为构建新型结核多表位亚单位疫苗打下了一定基础。

一、亚单位疫苗

Ning等［1］设计了一款新型亚单位结核疫苗ESAT-6：c-di-AMP，并评价了其免疫效果。研究者首先进行了体外细胞感染模型实验，还运用BALB/c小鼠进行了动物实验。小鼠共分4组，包括PBS处理组、c-di-AMP组、ESAT-6组和ESAT-6+c-di-AMP组，在第0、2、4周鼻内免疫小鼠，第8周气溶胶感染H37Ra菌株，20周进行解剖并进行CFU计数、血清抗体和细胞因子等检测，分析小鼠的免疫应答情况及对疫苗的免疫保护效果。结果发现ESAT-6：c-di-AMP抑制CD8+T细胞和巨噬细胞的分化，但促进了肺中天然淋巴细胞（innate lymphoid cell，ILC）的分化，此外还增强了成熟肺泡细胞系MH-S细胞中炎性细胞因子的产生。本研究还发现ESAT-6和c-di-AMP可通过调节巨噬细胞的自噬抑制早期感染阶段细胞中MTB生长。ESAT-6：c-di-AMP诱导的ESAT-6特异性免疫应答水平在感染MTB后急剧下降。ESAT-6：c-di-AMP接种组小鼠的肺和脾中的细菌负荷较其他组显著减少。研究结果表明，亚单位疫苗ESAT-6：c-di-AMP可以通过黏膜免疫诱导先天性和适应性免疫反应抵御MTB感染，c-di-AMP作为黏膜免疫佐剂增强了抗原的免疫原性。由于该研究攻毒实验采用的是减毒株H37Ra，没有使用致病性更强的H37Rv等毒力菌株，加上BALB/c小鼠模型的选择，使得该研究结论存在一定的局限性，有待后续开展更进一步的研究来证实该疫苗的免疫保护力。

Han等［2］首次报道了细胞因子和转录因子在延长结核病亚单位疫苗诱导的免疫记忆中的佐剂作用。该研究选用结核亚单位疫苗抗原MH（MTB10.4-HspX）和LT70（ESAT6-Ag85B-MPT64 _{＜ 190-198 ＞} -MTB8.4-Rv2626c），以及复合佐剂 DDA 和 Poly（I：C），制成亚单位疫苗。使用重组腺病毒和慢病毒载体构建了可表达IL-7、EGFP、Id3、Bcl6和Bach2等细胞因子或转录因子的重组病毒载体 rAAV-IL-7、rAAV-EGFP、rLV-EGFP、rLV-Id3、rLV-Bcl6、rLV-rBach2和rLV-Blimp1。在第0、2、4周时与重组病毒载体细胞因子和转录因子联合免疫小鼠，采用皮下注射方式分8组，免疫方案如下：单纯疫苗组、疫苗+rAAV-IL-7、疫苗+rAAVEGFP、疫苗 +rLV-EGFP、疫苗 +rLV-Id3、疫苗 +rLV-Bcl6、疫苗 +rLV-rBach2 和疫苗 +rLVBlimp1，阴性对照组采用PBS。最后一次免疫后25周用BCG攻毒以检测疫苗诱导的免疫应答。结果表明，腺病毒载体表达的IL-7可促进结核亚单位疫苗诱导形成长寿记忆T细胞。同时，IL-7增加了Id3、Bcl6和Bach2的表达，这三种转录因子是产生长寿记忆T细胞的三个关键转录因子。可见转录因子发挥了一定的佐剂效应，转录因子Bcl6和Id3都增加了抗原特异性抗体和长寿命记忆T细胞的产生，其特征是抗原特异性CD4+T细胞和CD8+T细胞的高增殖潜力。再暴露于同一抗原后，CD4+T细胞和CD8+T细胞可分泌高水平IFN-γ。该研究表明，IL-7和转录因子Id3和Bcl6有助于结核亚单位疫苗诱导长期免疫记忆，从而有助于提供针对MTB感染的免疫保护。该研究结论存在一定的局限性，没有将该免疫方案与BCG进行比较，攻毒实验也没有采用临床株或毒力模式菌株H37Rv，因此其保护效果仍有待验证。

Gong等［3］构建了新型结核亚单位疫苗MP3RT并初步评价了其免疫原性。研究者选择了 11 种 MTB 候选蛋白（包括 Mpt51、Mpt63、Mpt64、MTB8.4、PPE18、PPE44、PPE68、RpfA、RpfB、RpfE和TB10.4），预测了可与HLA-DRB1*01：01分子具有高亲和力结合能力的肽段，之后用酶联免疫斑点试验（enzyme-linked immunospot assay，ELISpot）筛选到了免疫应答优势肽，再经亲水性、抗原指数、密码子偏好性等分析，从50种预测肽段中筛选到了6种肽段。经大肠埃希菌表达体系进行异源融合表达和分离纯化，得到一个含283个氨基酸分子量为29.7kDa的蛋白，命名为MP3RT，将30μg该蛋白的纯化物与30μg CpG-ODN2395佐剂混合到100μl PBS溶液中，制备成亚单位疫苗。接着通过小鼠实验评价了其保护效力，选用 C57BL/6野生型和人源化小鼠 C57BL/6（HLA-A11+/+DR1+/+H-2β2m-/-/IAβ-/-）进行实验，各分 4组进行免疫：① BCG组；②佐剂组（100μl PBS+30μg CpG）；③亚单位疫苗组（30μg MP3RT+30μg CpG）；④ ag85ab DNA 疫苗组（100μg ag85ab DNA 疫苗）。除 BCG 组只免疫一次，其他组在第0、2、6周分3次免疫，第8周以H37Rv尾静脉注射方式攻毒，第13周处死小鼠，进行CFU、组织病理学分析、免疫应答分析等，对疫苗的保护效果进行综合评价。使用人源化小鼠模型免疫方案，发现MP3RT亚单位疫苗接种组小鼠肺部CFU、肺损伤面积和炎性细胞数量显著低于PBS免疫组。使用野生型小鼠模型，BCG接种组表现更好。接种MP3RT的人源化小鼠显示IFN-γ细胞因子产生、IFN-γ+T淋巴细胞数量、CD3+IFN-γ+T淋巴细胞数量和MP3RT特异性IgG抗体都有显著增加。该研究再次证明了Th1表位在抗击结核病中的作用以及对于疫苗构建的重要性，这将为未来的疫苗设计提供基础，将人源化的小鼠纳入了结核疫苗评价体系，提高了动物模型实验数据的参考价值。

二、活菌疫苗

邵萌等［4］探讨了新型结核病疫苗菌株（简称B/R菌株）对T淋巴细胞免疫记忆能力的影响。B/R菌株是BCG与H37Ra菌株通过原生质体融合技术获得的融合菌株。该研究选用C57BL/6小鼠进行实验，分为4组，每组各12只：PBS对照组、BCG组、H37Ra组和B/R菌株组。通过皮下免疫方式，免疫后第8、12、16周各取3只小鼠取脾淋巴细胞体外刺激培养，利用流式细胞术检测中央型记忆性淋巴细胞（T_CM）及效应型记忆性淋巴细胞（T_EM），ELISA检测脾淋巴细胞分泌的抗原特异性Th1/Th2型细胞因子（IL-2、IFN-γ和IL-4）水平。此外还检测了CD4+T淋巴细胞增殖率、CD8+T淋巴细胞增殖率。结果发现免疫后8周B/R菌株组CD4+T_EM低于H37Ra组（P ＜ 0.05）；免疫后16周B/R菌株组CD4+T_CM高于其他组（P ＜ 0.05），其 CD4+T_EM 高于 BCG 组（P ＜ 0.05）。免疫后 12 周 B/R 菌株组 CD8+T_EM 高于其他组（P ＜ 0.05）；免疫后 16 周，B/R 菌株组 CD8+T_CM 和 CD8+T_EM 高于 BCG 组（P ＜ 0.05）。免疫后 12周，B/R 菌株组 IFN-γ高于 BCG 组（P ＜ 0.05）；免疫后 16周，B/R 菌株组 IFN-γ和 IL-2高于其他组（P ＜ 0.05）。B/R菌株组的CD4+T淋巴细胞增殖率、CD8+T淋巴细胞增殖率均高于BCG组和H37Ra组（P ＜ 0.05）。该研究表明B/R菌株免疫小鼠后，可促进机体产生更高水平的免疫保护性记忆细胞，且以Th1型细胞免疫应答为主，并可增强T淋巴细胞增殖能力，后续关于该疫苗株更全面的免疫原性评价以及其免疫保护力评价结果值得关注。

三、新型抗原

1.新型抗原的免疫学评价

Jia等［5］基于MTB北京基因型菌株筛选了可用于针对中国人群结核疫苗的抗原表位。本研究基于中国人群特异性等位基因，运用多种生物信息学工具预测了五种保护性抗原中的CD4+T细胞表位。分别使用Vaxijen、AllerTOP、ToxinPred、IFN-γ表位服务器、IEDB和I-TASSER预测抗原性、变应原性、毒性、IFN-γ水平、群体覆盖率和三维结构。从Rv1813c、Rv2608、Rv3131和Rv3628蛋白获得101个混杂表位。在筛选抗原性、致敏性、毒性和IFN-γ水平后，选择来自Rv2608和Rv3131蛋白的七个表位（Rv2608_363-377、Rv2608_365-379、Rv2608_90-104、Rv3131_135-149、Rv3131_134-148、Rv3131_131-145 和 Rv3131_295-309）作为候选疫苗表位。进一步的研究确定了它们的三维结构，这些表位在中国人口中的HLA-Ⅱ覆盖率高达99%。该研究从北京基因型结核分枝杆菌菌株的Rv2608和Rv3131蛋白中预测了7个CD4+T细胞显性表位，为改进基于多表位的结核病疫苗设计提供了参考。

Lin等［6］鉴定了两个MTB耐药相关膜外排泵上的细胞毒性T淋巴细胞（cytotoxic T lymphocyte，CTL）抗原表位。研究者首先使用3种在线抗原表位分析软件SYFPEITHI、BIMAS和NetCTL-1.2预测了结核分枝杆菌ABC/MFS外排泵系统的HLA-A2限制性表位，人工合成相关肽段并通过T2A2细胞结合亲和力分析、肽/MHC（pMHC）复合物稳定性试验和体外免疫活性试验确认候选表位。筛选了2个结核分枝杆菌耐药相关T淋巴细胞表位，命名为Rv1218c-p24和Rv2477c-p182，并在转基因小鼠体内研究了其免疫活性。当佐以完全弗氏佐剂（complete Freund's adjuvant，CFA）时，这两个表位的免疫活性有所提高。该抗原表位有可能为将来开发抵御耐药MTB感染的多表位亚单位疫苗提供依据。

Zhao等［7］将ESAT-6和MTB黄素结核蛋白Dodecin进行了融合表达，并初步评价了其免疫原性。研究者将二者融合表达分离纯化发现，该融合蛋白Dodecin-ESAT-6是一个十二聚体，热稳定性较好，且体外细胞实验发现，该融合蛋白可增加RAW264.7巨噬细胞表面CD80、CD86以及MHCⅡ分子的表达。免疫小鼠实验结果发现，较ESAT-6免疫组相比，融合蛋白Dodecin-ESAT-6可诱导小鼠产生更高水平的抗原特异性CD4+T淋巴细胞和CD8+T淋巴细胞，以及较高水平的脾淋巴细胞增殖和IFN-γ、IL-2分泌，其IL-4分泌水平有所下降。此外，Dodecin-ESAT-6组小鼠IgG、IgG1和IgG2a滴度显著高于ESAT-6组。融合蛋白引发了高IgG2a/IgG1比率，倾向于产生Th1型应答为主的免疫反应。该融合抗原的保护效果仍有待开展攻毒实验进行进一步验证。

陈富超等［8］评价了MTB蛋白Rv2654作为抗结核病候选疫苗抗原的潜力。研究者首先通过异源表达系统表达并分离纯化了重组Rv2654蛋白，采用ELISA方法检测不同人群血清与Rv2654重组蛋白的免疫反应，之后将重组蛋白免疫昆明小鼠，采用细胞因子磁珠阵列法检测小鼠外周血Th1/Th2类细胞因子水平，并通过流式细胞术分析小鼠脾T、B淋巴细胞亚群的分布。发现以Rv2654重组蛋白作为抗原的ELISA结果显示其与卡介苗接种者或活动期结核患者血清均有反应性。Rv2654重组蛋白免疫小鼠可促进小鼠外周血IFN-γ、TNF-α、IL-2、IL-4、IL-6 和 IL-10 等多种细胞因子表达（均 P ＜ 0.05），这些细胞因子多为促炎因子，流式细胞术结果显示该蛋白可显著刺激CD4+T细胞和CD8+T细胞分化为效应T细胞，这种作用在联合卡介苗应用时更为明显。此外Rv2654还可刺激小鼠B细胞活化增殖并向记忆细胞分化。该研究结果提示Rv2654具备了一定结核候选疫苗抗原潜力，其免疫保护性有待进一步开展攻毒实验进行评价。

王雪枝等［9］对MTB Rv0446c蛋白的人T细胞抗原表位进行了鉴定，并初步评价了其免疫原性。利用生物信息学软件预测了Rv0446c蛋白的T细胞表位，通过ELISpot实验分析了该抗原的表位在结核病患者、其他肺部疾病和健康人中的免疫反应性。通过免疫小鼠分析了该抗原不同表位的免疫原性，共免疫3次，每次间隔2周，末次免疫后4周，应用ELISA方法检测各组小鼠脾细胞产生的IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-10细胞因子水平。结果发现预测的7条表位多肽中，通过ELISpot试验筛选到4个阳性T细胞表位多肽P120、P121、P122、P123，在结核病患者中检测灵敏度和特异度分别为30.0%、18.0%、6.0%、22.0%和96.8%、98.9%、100%、96.8%。与对照相比，P120多肽能刺激小鼠产生较高水平的IFN-γ、IL-4、IL-10，P121 多肽刺激小鼠产生较高水平的 IFN-γ和 IL-4（P ＜ 0.05），P123 多肽刺激小鼠产生较高水平的 IFN-γ（P ＜ 0.05）。P120、P121、P123 多肽刺激小鼠产生的 IL-2 的水平高于PBS组但低于Ag85B组（P ＜ 0.05）。该研究表明Rv0446c蛋白及其T细胞表位具有较好的免疫原性及免疫反应性，能刺激机体产生较强的细胞免疫应答，具备了成为新型结核亚单位疫苗候选抗原的潜力，其免疫保护性有待进一步验证。

杨雨婷等［10］初步评价了MTB Rv2626c编码的低氧反应蛋白HRP1的免疫反应性。研究者首先表达纯化了HRP1，之后使其作用于小鼠ANA-1巨噬细胞，用CCK-8法检测ANA-1细胞的增殖活力，流式细胞术检测ANA-1细胞凋亡情况，Griess法及ELISA法分别检测一氧化氮（nitric oxide，NO）产生水平和TNF-α、IL-1β的分泌情况等，结果发现纯化后不同浓度的HRP1蛋白对ANA-1细胞的增殖无影响，但细胞培养上清液中的NO、TNF-α及IL-1β含量均显著增加，且验证了该蛋白是通过NF-κB及MAPK信号通路促进细胞分泌具有抗菌效应的NO及TNF-α，因此认为该蛋白可增强其固有免疫效应，具备成为结核疫苗候选优势抗原的潜力。

2.新型抗原表位预测

刘静等［11］运用生物信息学手段预测了HRP1蛋白的抗原表位。研究者使用TMHMM、NetNGlyc等21种生物信息学软件对HRP1蛋白的理化性质、结构功能、生物学特性、抗原表位及蛋白相互作用进行了预测分析，结果表明该蛋白原子总数2 166，等电点4.96，不稳定性指数19.62，脂肪族氨基酸指数100.35，平均疏水性0.042，有跨膜区无信号肽，含有1个糖基化位点、6个磷酸化位点，二级结构以α-螺旋为主。其亚细胞定位于细胞质，属于稳定的亲水性蛋白。经预测，HRP1蛋白含有4个B细胞表位，多个T 细胞表位，且其相互作用蛋白分别为 Rv2627c、Rv2628、Rv1738、devR、Rv2624c、TB31.7、rip3、pfkB、guaA、hspX，且参与多种生物学过程。经生物信息学分析发现HRP1蛋白为稳定亲水性细胞质蛋白，具有良好的抗原表位。李娜等［12］预测分析了该抗原的B细胞、CTL及Th细胞表位。研究者运用SYFPEITHI在线预测Rv2626c的T细胞抗原表位，利用表位数据库IEDB从抗原性、表面易接近性、亲水性、柔韧性、β转角五个方面在线预测Rv2626c B细胞线性抗原表位。结果发现Rv2626c含有4个B细胞表位肽、8个限制性CTL细胞表位以及5个辅助性Th细胞表位。以上研究表明Rv2626c蛋白含丰富抗原表位，提示其具有成为抗结核亚单位疫苗的候选蛋白的潜力。

刘静等［13］应用生物信息学方法分析了MTB潜伏感染相关蛋白Rv1733c的结构和功能。研究者采用ORF Finder、Interproscan等多种生物信息学软件对结核分枝杆菌Rv1733c蛋白的理化性质、疏水性、信号肽、跨膜区、信号肽、糖基化及磷酸化位点、亚细胞定位、二级结构、B细胞与T细胞抗原表位以及蛋白质的相互作用进行了预测分析。结果发现Rv1733c蛋白由210个氨基酸组成，等电点10.31，不稳定性指数34.84，脂肪族氨基酸指数102.76，平均疏水性0.14。该蛋白有跨膜区，无信号肽，有2个糖基化位点和13个磷酸化位点。该蛋白二级结构以α-螺旋（占41.90%）为主，结构较松散。其亚细胞定位于细胞质，非分泌蛋白，属于稳定的疏水性蛋白。该蛋白含有7个B细胞抗原表位，多个T细胞表位。与 Rv1733c 发生相互作用的蛋白包括 Rv2628、Rv1734c、Rv2627c、Rv0079、Rv1733c、h1rp1、esxA等，并参与多种生物学过程。该研究经生物信息学预测提示Rv1733c为稳定疏水性胞浆蛋白，含有多个T、B细胞抗原表位，能够被磷酸化并与多种蛋白相互作用，具有可作为抗结核亚单位疫苗候选抗原的潜力。

（王伟　卢水华　唐神结）

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