第六节　病理性抗凝物质检验技术

一、APTT纠正试验

本试验是鉴别凝血因子缺陷和病理性抗凝物质的有效手段。

【检验原理】

APTT测定法。将受检血浆与正常人混合血浆于37℃水浴以1：1共孵，测定APTT。能被APTT纠正者，该受检血浆缺乏凝血因子；若不能纠正者，该受检血浆中存在病理性抗凝物质。

【检验方法学】

1.试剂

（1）正常人混合血浆：取至少30份正常人枸橼酸钠抗凝全血，1 500×g离心15分钟，分离血浆，充分混匀备用。

（2）余同APTT测定。

2.检验方法

（1）受检血浆检测：取玻璃小试管1支，加入受检血浆和正常人混合血浆各0.1ml，37℃水浴2小时。

（2）检测上述血浆的APTT。

【方法学评价】

同APTT测定

【质量保证】

1.正常人混合血浆应至少30人份，新鲜使用。

2.余同APTT测定。

【参考范围】

1.若延长的APTT能被纠正者

提示受检血浆中缺乏某种（些）凝血因子。

2.若延长的APTT未能被纠正者

提示受检血浆中存在某种病理性抗凝物质。

【临床意义】

本检验可区分APTT延长的原因，是血液循环中有无病理性抗凝物质的一项筛选试验。

二、凝血因子Ⅷ/Ⅸ抑制物测定

是血友病A和血友病B循环中有无抑制物的主要筛选试验。

【检验原理】

Bethesda法将受检血浆和正常人混合血浆混合，37℃温育一定时间后，检测剩余的因子Ⅷ/Ⅸ：C，以Bethesda单位来计算抑制物的含量，1个Bethesda单位相当于灭活50%因子Ⅷ/Ⅸ的量。

【检验方法学】

试剂如下：

（1）0.05mol/L 咪唑缓冲液（pH 7.3）：咪唑 0.34g，氯化钠0.585g，加蒸馏水至 100ml。

（2）白陶土-脑磷脂悬液。

（3）缺乏因子Ⅷ或Ⅸ血浆。

（4）正常人混合血浆。

（5）0.025mol/L氯化钙溶液。

【检验方法学】

1.用咪唑缓冲液制备受检者1/2（受检者血浆1份加缓冲液1份）和2/3（受检者血浆2份加缓冲液1份）的稀释血浆。

2.温育混合血浆的制备。正常对照为正常人混合血浆0.2ml加缓冲液0.2ml；受检者1/2稀释血浆0.2ml，加正常混合血浆0.2ml；受检者1/3稀释血浆0.2ml加正常对照血浆0.2ml。

3.将上述3支试管置37℃水浴2小时。

4.取出，检测因子Ⅷ：C或Ⅸ：C水平（方法同Ⅷ：C或Ⅸ：C 检测）。

5.计算如下：

按表6-7将剩余的因子Ⅷ：C或Ⅸ：C换算成Bethesda单位，以Bethesda单位计算因子Ⅷ或Ⅸ抑制物含量。受检血浆稀释度×Bethcsda单位=每毫升血浆中因子Ⅷ或Ⅸ抑制物的Bethesda单位数。

举例：正常人混合血浆温育后的因子Ⅷ：C/Ⅸ：C=55%。

受检血浆与正常混合血浆（1/2）温育后的因子Ⅷ：C/Ⅸ：C=35%。

剩余的因子Ⅷ：C/Ⅸ：C=35/55×100%=64%。

从表6-7中，64%剩余因子Ⅷ：C/Ⅸ：C为0.65 Bethesda单位。

【方法学评价】

同因子Ⅷ：C检测。

【质量保证】

同因子Ⅷ：C检测。

【参考范围】

正常人血浆中无抑制物。

【临床意义】

本检测是患者使用凝血因子制品后观察有无抑制物产生的主要手段，对患者的治疗及血液制品的有效利用具有重要意义。此外，也可见于自身免疫性因子Ⅷ/Ⅸ抑制物升高者（获得性血友病）。

三、狼疮抗凝物质测定

狼疮抗凝物质（lupus anticoagulant，LA）检测是循环血液中狼疮样抗凝物质筛查的主要依据。

【检验原理】

蝰蛇毒法。蝰蛇毒在磷脂和Ca2+存在的条件下，可直接激活因子Ⅹ，最终形成纤维蛋白，使血液凝固。

【检验方法学】

1.试剂

（1）蝰蛇毒试剂。

（2）阴、阳性质控血浆。

（3）正常人血浆。

2.检验方法

取4支玻璃试管，分别加入受检血浆、正常人血浆和阴阳性质控血浆各200µl，置37℃温育2分钟。取出后各加200µl蝰蛇毒试剂至上述样品中，立即启动秒表，轻轻摇动，直至血浆凝固，记录凝固时间，每次检测均需设复管。

3.计算

【方法学评价】

1.由于直接激活绕过接触因子和内源性凝血系统的凝血因子，因此当FⅧ、Ⅸ、Ⅺ、Ⅻ及其抑制物存在时，该试验不受影响。

2.由于试剂中含有特定类型和稀释度的磷脂，使该试验检测狼疮抗凝物质（LAC）的敏感性和特异性均较强。

【质量保证】

1.受检血浆应经1 500×g离心15分钟后的乏血小板血浆，其血小板计数应小于10×109/L，否则将影响结果。

2.血浆肝素水平 ＞ 1.0U/ml时，本检测可出现假阳性。

【参考范围】

。建议各类实验室建立各自的参考范围。

【临床意义】

LAC检测阳性提示患者血浆中存在狼疮样抗凝物质或凝血因子Ⅱ、Ⅴ或Ⅹ缺乏。

四、抗心磷脂抗体测定

抗心磷脂抗体（anticardiolipin antibody，ACA）主要与动静脉血栓形成有关。

【检验原理】

ELISA法。测定样品中ACA的 IgG、IgA、IgM水平。用纯化的抗人ACA IgG、IgA、IgM包被微孔板，制成固相抗体，于微孔中依次加入受检样品、生物素化的ACA IgG、IgA、IgM抗体、HRP标记的亲和素，经洗涤后用TMB显色，TMB在过氧化物酶的催化下显色，并在终止液的作用下最终呈黄色，颜色的深浅与样品中ACA IgG、IgA、IgM含量呈正相关。

【检验方法学】

1.试剂与仪器

（1）预包被抗人ACA IgG、IgA、IgM的酶标板。

（2）样品稀释液 A：10µl/瓶。

（3）样品稀释液 B：10µl/瓶。

（4）样品稀释液：20µl/瓶。

（5）标准品：将抗人 ACA IgG、IgA、IgM 冻干品稀释至1ml，静置10分钟，充分混匀，其浓度分别为100PL U/ml，作系列倍比稀释后，标准品浓度被稀释成100PL U/ml、50PL U/ml、25PL U/ml、12.5PL U/ml、5.25PL U/ml、3.12PL U/ml、1.56PL U/ml，以样品稀释液为 0PL U/ml。

（6）检测溶液A：120µl/瓶。临用前用稀释液A作1：100稀释。

（7）检测溶液B：120µl/瓶。临用前用稀释液B作1：100稀释。

（8）底物溶液：TMB。

（9）浓缩洗涤液：30ml/瓶。临用前用蒸馏水稀释25倍。

（10）终止液：2mol/L硫酸。

（11）酶标仪。

2.检验方法

（1）加样：分别设空白孔、标准孔和受检样品孔，除空白孔外，余各孔分别加标准溶液或受检样品100µl，轻轻混匀，酶标板加盖后37℃温育120分钟。

（2）弃去液体，甩干，不用洗涤。

（3）每孔加检测溶液A工作液100µl，37℃温育60分钟，洗板3次，甩干。

（4）每孔各加检测溶液B工作液100µl，37℃温育60分钟，洗板5次，甩干。

（5）每孔各加底物溶液90µl，37℃避光显色30分钟。

（6）每孔各加终止液50µl，并在酶标仪450nm处检测各孔吸光度值（OD）。

3.标准曲线的绘制

以抗人ACA IgG、IgA、IgM标准品浓度为横坐标，以各孔吸光度值为纵坐标，在半对数纸上绘制标准曲线。根据样品的OD值由标准曲线查出相应的ACL IgG、IgA、IgM浓度。

【方法学评价】

本法灵敏度和特异性较高，与其他相关蛋白质无交叉反应。检测范围为1.56～100PL U/ml。

【质量保证】

1.标本类型。受检样品可用血清或EDTA和肝素抗凝血，采血后1 500×g离心15分钟，备检测用。

2.洗涤必须充分，否则容易造成假阳性。

3.若受检样品中待测物含量过高，应稀释后复测，结果乘以稀释倍数。

4.标准品、检测溶液工作液和底物应用前配制，当天使用。底物溶液应避光保存。

【参考范围】

ACA IgG 0～22GPL U/ml；ACA IgA 0～10APL U/ml、ACA IgM 0～16MPL U/ml。

【临床意义】

ACA增高主要见于动静脉血栓形成、免疫性血小板减少症、反复自发性流产及类风湿关节炎、系统性红斑狼疮等自身免疫性疾病。

五、抗β₂糖蛋白I测定

抗 β₂糖蛋白 I（anti β₂ glycoprotein I，抗 β₂-GPI）测定具体如下：

【检验原理】

ELISA法。用纯化的抗β₂-GPI IgG、IgA、IgM抗体包被微孔板，制成固相抗体，于微孔中依次加入受检样品或标准品、生物素化的抗β₂-GPI IgG、IgA、IgM抗体、辣根过氧化物酶标记的亲和素，洗涤后用TMB显色。TMB在过氧化物酶的催化下显色，并在终止液的作用下呈黄色，颜色深浅与样品中的抗β₂-GPI IgG、IgA、IgM呈正相关。

【检验方法学】

1.试剂与仪器

（1）预包被抗β₂-GPI IgG、IgA、IgM的酶标板。

（2）标准品：将抗 β₂-GPI IgG、IgA、IgM 标准品稀释至1ml，置室温10分钟，充分混匀，其浓度为100U/ml，然后作系列倍比稀释，浓度分别为 100U/L、50U/L、25U/L、12.5U/L、5.25U/L、3.12U/L、1.56U/L，以样品稀释液作为 0U/L。

（3）样品稀释液：20µl/瓶。

（4）样品稀释液 A：10µl/瓶。

（5）样品稀释液 B：10µl/瓶。

（6）检测溶液A：120µl/瓶。临用前用稀释液A作1：100稀释。

（7）检测溶液B：120µl/瓶。临用前用稀释液B作1：100稀释。

（8）底物溶液：10ml/瓶。

（9）浓缩洗涤液：30ml/瓶。临用前用蒸馏水稀释25倍。

（10）终止液：2mol/L硫酸。

（11）酶标仪。

2.检验方法

（1）加样：分别设空白孔、标准孔和受检样品孔，空白孔加样品稀释液100µl，余孔加标准品或受检样品100µl，轻轻混匀，37℃温育2小时。

（2）弃去孔内液体，甩干，不用洗涤。每孔各加检测溶液A工作液100µl，37℃温育1小时。

（3）弃去孔内液体，甩干，洗板3次，甩干。

（4）每孔加检测溶液B工作液100µl，37℃温育1小时。

（5）弃去孔内液体，甩干，洗板5次，甩干。

（6）每孔各加底物溶液90µl，37℃避光显色15～30分钟。

（7）每孔各加终止液50µl终止反应，立即在酶标仪450nm处检测各孔吸光度值（OD）。

3.标准曲线的绘制

以标准品浓度为横坐标，以标准品OD值为纵坐标，在半对数纸上绘制标准曲线。受检样品OD值可从标准曲线中查出待检物的含量。

【方法学评价】

本法灵敏度和特异性较高，与其他相关蛋白质无交叉反应，检测范围为1.56～100U/L。

【质量保证】

1.洗涤过程非常重要，不充分洗涤易造成假阳性。

2.一次加样时间应控制在5分钟内，如样品量多，推荐使用多通道移液器加样。

3.若受检样品中待测物含量过高，应将样品稀释后复测，结果乘以稀释倍数。

4.标准品、检测溶液工作液及底物应用前配制，当天使用。底物应避光保存。

【参考范围】

正常人抗β₂-GPI IgG、IgA、IgM均小于15U/L。

【临床意义】

抗β₂-GPI增高多见于动脉粥样硬化、系统性红斑狼疮、类风湿关节炎、川崎病、习惯性流产和血栓性疾病等。

六、血浆普通肝素和低分子肝素浓度测定

本检测用于普通肝素（unfractionated heparin，uFH）和低分子量肝素（lowmolecular weight heparin，LMWH）的临床用药监测。

【检验原理】

凝固法。AT在肝素的作用下加速对凝血因子Ⅱa、Ⅸa、Ⅹa的抑制作用。在受检血浆中加入过量的纯化因子Ⅹa，部分因子Ⅹa与肝素-AT复合物结合，其余因子Ⅹa继续发挥凝血活性。在检测体系中加入磷脂和Ca2+，在残余因子Ⅹa的作用下可使基质血浆发生凝固。凝固时间与受检血浆中的肝素含量成正比。

【检验方法学】

1.试剂和仪器

（1）冻干人基质血浆。

（2）冻干牛因子Ⅹa制剂（溶解后约为0.3U/ml）。

（3）含Ca2+和磷脂的冻干制剂。

（4）磁珠法半自动血凝仪。

2.样品准备

将患者全血与0.129mol/L枸橼酸钠作9：1抗凝，1 500×g离心15分钟（2～8℃），分离乏血小板血浆。

3.检验方法

（1）标准曲线绘制：

以试剂盒中三种浓度普通肝素制作标准曲线，在双对数纸上以肝素浓度为纵坐标，凝固时间（秒）为横坐标绘制标准曲线。LMWH检测则以三种浓度LMWH按上述方法绘制标准曲线。

（2）样品检测：

见表6-8。

根据血浆凝固时间，从标准曲线中查出相应的普通肝素和LMWH的浓度（U/ml）。

【方法学评价】

本法具有较好的灵敏度和特异性，且操作简便易行，可在临床广泛使用。

【质量保证】

由于血小板第Ⅳ因子是肝素极强的抑制剂，可导致检测结果偏低。故检测时不能使用玻璃试管以避免血小板体外激活。此外，应按要求制备乏血小板血浆，以避免受检血浆中混有血小板。

【参考范围】

正常人血浆中普通肝素和LMWH的含量为0U/ml。

【临床意义】

用于普通肝素和LMWH临床用药的监测。

七、凝血酶-抗凝血酶复合物测定

凝血酶-抗凝血酶复合物（thrombin-antithrombin，TAT）检测是血栓前状态和血栓栓塞性疾病诊断的重要依据。

【检验原理】

ELISA法。将AT包被于固相，待测血浆中的TAT以其凝血酶与固相上的AT结合，然后再加入过氧化物酶标记的抗AT，后者与结合于固相上的TAT结合，并使底物显色。反应颜色的深浅与TAT浓度成正比。

【检验方法学】

1.试剂和仪器

（1）兔抗人凝血酶。

（2）过氧化物酶标记的兔抗人AT。

（3）共轭缓冲液。

（4）人TAT标准血浆S1～S4，浓度范围2～60μg/L。

（5）人TAT质控血浆。

（6）样本缓冲液：Tris缓冲液 100mmol/L，Tween 10ml/L，EDTA 37g/L。

（7）洗涤液：磷酸盐缓冲液90mmol/L，含Tween 18g/L。

（8）底物缓冲液：枸橼酸盐缓冲液，含H₂O₂ 0.3g/L。

（9）底物：邻苯二胺。

（10）终止液：0.5mol/L硫酸。

（11）酶标仪。

2.试剂准备

（1）洗涤液：

将15ml浓缩液稀释至300ml。

（2）工作共轭溶液：

将200µl抗人AT抗体加至11ml共轭缓冲液中，轻轻振荡混匀。

（3）人TAT标准血浆的稀释：

各加1ml蒸馏水至S1～S4中，使其 TAT 浓度分别为 2µg/L、6µg/L、20µg/L 和 60µg/L。

3.检验方法

（1）取适量微量测试排条置托板上，其余测试排条重新封存好，并放干燥剂，于2～8℃保存。

（2）每孔加50µl样本缓冲液，再分别加入50µl标准品、质控品或受检样品，充分混匀。

（3）37℃温育15分钟。

（4）每孔用0.3ml稀释洗涤液洗板2次，甩干。

（5）每孔各加100µl工作共轭溶液。

（6）37℃温育15分钟。

（7）准备底物溶液：每瓶底物加10ml底物缓冲液，充分混匀。

（8）用洗涤缓冲液洗板3次，甩干。

（9）每孔各加100µl新鲜配制的底物溶液。

（10）20～25℃温育30分钟（避光）。

（11）每孔各加100µl终止液，20～25℃温育30分钟。

（12）于492nm处读取各孔的吸光度值。

4.标准曲线的绘制

标准曲线通过标准血浆的TAT浓度（µg/L）对相应的吸光度值作图而得。以标准血浆在492nm处的吸光度值为纵坐标，标准血浆的浓度为横坐标绘制标准曲线。受检血浆的TAT可通过查标准曲线获得。

【方法学评价】

本法灵敏度高，特异性强，适合批量样品检测。

【质量保证】

1.共轭缓冲液、工作共轭溶液和样本缓冲液可在2～8℃中保存4周，稀释洗涤液可在1周内使用。

2.稀释的标准血浆和质控血浆可在15～25℃中放置8小时。工作底物溶液必须避光保存，且在l小时内使用。

3.共轭缓冲液、标准血浆、质控血浆和样品缓冲液在-20℃中可保存3个月。

4.因采血不顺利而导致凝血系统体外活化可出现假阳性结果。溶血、脂血、含类风湿因子样品均可影响结果。

【参考范围】

1.0～4.1µg/L。

【临床意义】

血浆TAT增高主要见于血栓前状态和血栓栓塞性疾病，如DIC、深静脉血栓形成和急性心肌梗死等。

（李　健　张利伟）