第七节　纤溶功能检验技术

一、优球蛋白溶解时间

优球蛋白溶解时间（euglobulin lysis test，ELT）检测反映总的纤溶活性。

【检验原理】

加钙法。血浆优球蛋白的组分中含有Fg、纤溶酶原和纤溶酶原激活物等，但不含纤溶酶抑制物。在受检血浆中加入醋酸溶液，使优球蛋白沉淀，经离心去除上清液中的纤溶酶抑制物，将沉淀的优球蛋白溶于缓冲液中，再加入适量Ca2+溶液（加钙法）或凝血酶（加酶法），使Fg转变成纤维蛋白的凝块，观察凝块完全溶解所需的时间即ELT。

【检验方法学】

1.试剂

（1）1%醋酸溶液：

用去离子水将醋酸稀释至1%浓度，混匀后备用。

（2）硼酸缓冲液（pH 9.0）：

氯化钠 9g，硼酸钠 1g，加水至1 000ml，充分混匀后备用。

（3）CaCl₂溶液：

0.025mol/L。

2.检验方法

（1）取1支玻璃尖底离心管，加入7.5ml去离子水，再加入0.12ml 1%醋酸溶液，使成pH 7.3，置冰箱保存备用。

（2）取受检血浆0.5ml加至上述尖底离心管中，混匀后置冰浴中10分钟，取出1 500×g离心10分钟。

（3）倾去上清液，管底沉淀即为优球蛋白，将试管倒置于滤纸上，待干。

（4）加入硼酸缓冲液0.5ml，轻轻将沉淀物摇匀。

（5）加入CaCl₂溶液 0.5ml，充分混匀，置37℃水浴，待血浆凝固后开始计时。

（6）每隔5分钟观察一次，直到凝块充分溶解，并记录时间。

【方法学评价】

本法操作简便易行，特异性较高，但灵敏度较差。

【质量保证】

1.采血应顺利，避免因凝血系统体外活化所致的假阳性。

2.受检样品应在4小时内进行检测，否则应将样品置-70～-20℃冰箱中保存，检测前将血浆置37℃水浴中融化。

3.必须在血浆凝固后每5分钟观察一次凝块溶解情况，直至凝块完全溶解。

4.操作步骤（1）和（2）应在15分钟内完成，以避免纤溶酶抑制物中和纤溶酶而导致假阴性结果。

【参考范围】

正常人血浆凝块完全溶解时间为90～120分钟。＜ 70分钟溶解提示纤溶活性明显增强。

【临床意义】

1.ELT缩短

提示纤溶活性增强，见于原发性和继发性纤溶。

2.ELT延长

提示纤溶活性降低，见于血栓前状态、血栓性疾病及使用抗纤溶药等。

二、组织型纤溶酶原激活物测定

组织型纤溶酶原激活物（tissue-type plasminogen activator，t-PA）测定是了解患者纤溶状况的一项重要指标。

（一）t-PA抗原检测（t-PA：Ag）

【检验原理】

双抗体夹心法。将纯化的t-PA单克隆抗体包被在固相载体上，然后加入受检样品，受检样品中的t-PA抗原与固相载体上的抗体形成复合物，此复合物与辣根过氧化物酶标记的t-PA单克隆抗体发生抗原抗体结合反应，形成双抗体夹心免疫复合物，后者可使邻苯二胺基质呈棕色反应，其颜色深浅与样品中t-PA含量呈正相关。

【检验方法学】

1.试剂与仪器

（1）鼠抗人t-PA单抗。

（2）包被液：0.05mol/L 碳酸盐缓冲液，pH 9.6。

（3）辣根过氧化物酶标记的t-PA单抗。

（4）基质：邻苯二胺。

（5）基质缓冲液：0.2mol/L枸橼酸，0.2mol/L枸橼酸钠缓冲液，pH 4.5。

（6）稀释缓冲液：0.49%白蛋白-0.01mol/L磷酸盐缓冲液，pH 7.4。

（7）洗涤液：0.025mol/L氯化钙-Tween20-PBS缓冲液。

（8）t-PA标准品。

（9）0.13mol/L枸橼酸钠溶液。

（10）30%过氧化氢溶液。

（11）终止液：3mol/L 硫酸。

（12）酶标仪。

2.标准曲线绘制

（1）用包被液稀释t-PA抗体后包板，每孔200µl，37℃温育过夜，次日用洗涤液洗3次，甩干。

（2）将 t-PA 标准品稀释成 10、5、2.5、1.25、0.625、0.312 5µg/ml，每孔加200µl（复管），37℃温育1小时后，用洗涤液洗3次，甩干。

（3）用稀释缓冲液稀释辣根过氧化物酶标记的t-PA单抗至应用浓度，每孔加200µl，37℃温育1小时，洗涤3次，甩干。

（4）用基质缓冲液10ml溶解邻苯二胺（1g/L），加入30%过氧化氢溶液 10µl（新鲜配制）后，即刻加入各孔，每孔 200µl，显色10～20分钟。

（5）每孔各加3mol/L硫酸溶液50µl，中止反应，于492nm处读取吸光度值，以稀释缓冲液校正零点。

（6）以吸光度为纵坐标，t-PA标准品浓度为横坐标制备标准曲线。

3.检验方法

（1）取0.13mol/L枸橼酸钠抗凝血浆1份加稀释缓冲液5份，若估计受检样品t-PA升高，则可作1：10稀释，每孔各加样 200µl。

（2）余同“标准曲线绘制”（2）～（5）。

（3）根据受检样品吸光度值查得t-PA含量。

【方法学评价】

本法灵敏度高，特异性强，适合批量样品检测。

【质量保证】

1.采血应顺利，避免凝血系统体外活化而影响结果。

2.黄疸、脂血、溶血样品可能影响检测结果。

3.显色溶液必须新鲜配制，不可重复使用。

【参考范围】

1～12µg/L。

【临床意义】

1.t-PA升高

提示纤溶亢进，见于原发性及继发性纤溶症，如DIC；也见于使用纤溶酶原激活物类药物后。

2.t-PA降低

提示纤溶减弱，见于高凝状态及血栓栓塞性疾病。

（二）t-PA活性测定（t-PA：A）

【检验原理】

发色底物法。在t-PA和共价物的作用下，纤溶酶原转变为纤溶酶，后者使发色底物S2251释放出发色基团pNA，显色的深浅与t-PA：A呈正相关。

【检验方法学】

1.试剂

（1）0.13mol/L枸橼酸钠溶液。

（2）浓酸化溶液：用前用蒸馏水稀释至10ml。

（3）浓缓冲溶液：用前用蒸馏水稀释至25ml。

（4）纤溶酶原。

（5）发色底物 S2251。

（6）共价物。

（7）标准品（10U）。

（8）终止液：3mol/L硫酸。

2.标准曲线的绘制

（1）t-PA标准品用4ml缓冲液溶解，再稀释100倍，即取上述溶解的t-PA标准品50µl，加缓冲液4 950µl，此时t-PA标准品活性为2.5×10-2U/ml，按表6-9再进行稀释，制备标准曲线，然后加入酶标板孔中。

（2）各用缓冲液2ml将发色底物、共价物和纤溶酶原溶解，然后将三者混合，于标准品孔中各加入100µl，置湿盒中37℃温育150～180分钟。

（3）加20µl终止液终止反应，在酶标仪上检测各孔在405nm处的吸光度值，以l号孔调整零点。

（4）以405nm处的吸光度值为纵坐标，t-PA：A为横坐标绘制标准曲线。

3.检验方法

（1）取0.13mol/L枸橼酸钠抗凝血浆200µl，即刻加入等体积酸化溶液，立即混合，2～8℃可保存12小时，0℃可保存1个月，检测前必须摇匀。

（2）用缓冲液将经酸化的受检血浆再稀释15倍，即取酸化血浆 50µl，加缓冲液 700µl。吸取 100µl加至酶标板检测孔中。

（3）余同标准曲线的绘制步骤。

（4）受检样品t-PA：A可从标准曲线中查出，结果乘以稀释倍数，即15×2×1.1。

【方法学评价】

本法灵敏度和特异性均较佳，适合批量样品检测。

【质量保证】

1.采血须顺利，避免凝血系统体外活化而影响结果。

2.黄疸、脂血、溶血样品可影响检测结果。

3.发色底物、共价物和纤溶酶原应新鲜配制，当天使用。

【参考范围】

0.3～0.6U/ml。

【临床意义】

同t-PA抗原测定。

三、尿激酶型纤溶酶原激活物测定

尿激酶型纤溶酶原激活物测定（urokinase-type plasminogen activator，u-PA）主要用于尿激酶用药后疗效观察的指标。

（一）u-PA抗原测定（u-PA：Ag）

【检验原理】

ELISA法。以鼠抗人u-PA单克隆抗体作为捕获抗体包被于固相，与受检样品中的u-PA结合，用生物素标记的第二抗体（检测抗体）识别已结合的u-PA分子，加入辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素形成双抗体夹心酶联免疫复合物。加入底物TMB，溶液呈蓝色。加入硫酸终止反应后，溶液呈黄色，于450nm处读取吸光度值，从标准曲线即可得u-PA抗原含量。

【检验方法学】

1.试剂与仪器

（1）6×16孔预包被鼠抗人u-PA单克隆抗体的微量测试条。

（2）冻干 u-PA 标准品：0～1ng/ml。

（3）冻干检测抗体：生物素标记的抗人u-PA抗体。

（4）酶标溶液：辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素。

（5）酶标稀释液。

（6）底物：TMB。

（7）去污剂：25% TritonX-100。

（8）PBS 缓冲液（pH 7.4）。

（9）酶标仪。

2.试剂准备

（1）标准品：

分别加 1.0ml蒸馏水至含 0.1、0.25、0.5、0.75和1.0ng/ml标准品的瓶中，加2.0ml蒸馏水至0.0ng/ml标准品瓶中，轻摇3分钟。

（2）检测抗体：

每瓶加5.5ml蒸馏水，轻摇3分钟。

（3）酶标物稀释剂：

溶于55ml蒸馏水中，混匀。

（4）洗涤缓冲液：

将1包PBS粉剂溶于900ml蒸馏水中，加4ml 25% TritonX-100，加蒸馏水至1 000ml。

（5）样品缓冲液：

加BSA至洗涤缓冲液中，使之成1%浓度。

3.样品准备

用样品缓冲液作1：20稀释。

4.检验方法

（1）取适量微量测试条，并置于托板上，其余重新封存好，内置干燥剂，保存于2～8℃中。

（2）每孔加100µl u-PA标准品、质控或稀释的受检样品，置湿盒内加盖室温过夜，应设复孔。

（3）用洗涤缓冲液洗板4次，甩干。

（4）每孔加100µl检测抗体，置室温1小时。

（5）用洗涤缓冲液洗板4次，甩干。

（6）在10µl酶标物中加入11ml酶标物稀释剂，各孔加100µl稀释的酶标物，置室温1小时。

（7）用洗涤缓冲液洗板4次，甩干。

（8）每孔加 100µl底物溶液，置室温 20分钟，溶液呈蓝色。

（9）加4.5mol/L硫酸溶液50µl终止反应，充分混匀，溶液将呈黄色。于450nm处读取吸光度值。

5.标准曲线的绘制

以u-PA标准品的平均吸光度值为纵坐标，u-PA标准品的含量为横坐标绘制标准曲线。

6.结果计算

将稀释样品的测定值乘以稀释倍数，即得出受检样品的u-PA浓度。

【方法学评价】

本法为生物素-亲和素捕获的酶联免疫吸附试验，具有极高的灵敏度和特异性，适合批量样品检测。

【质量保证】

1.本法检测下限为10pg u-PA/ml。

2.标准品、检测抗体和酶标稀释剂必须用前配制，当天使用。

【参考范围】

（88±23）ng/L。

【临床意义】

在使用尿激酶治疗血栓性疾病时，血浆u-PA可升高，因此，可作为药物监测的指标。此外，某些肿瘤，如乳腺癌、胃癌等u-PA也可升高。

（二）尿激酶型纤溶酶原激活物活性测定（u-PA：A）

【检验原理】

免疫空斑法。纤维蛋白原和纤溶酶原在凝血酶和Ca2+的作用下，形成富含纤溶酶原的纤维蛋白多聚体。使用琼脂糖凝胶，使该多聚体固定在琼脂糖凝胶平板中，然后加入纤溶酶原激活物如尿激酶于凝胶板孔中。尿激酶立即作用于纤溶酶原，激活的纤溶酶使纤维蛋白多聚体溶解，形成圆形透明斑，空斑直径大小与纤溶酶原激活物活性的对数值成正比。

【检验方法学】

1.试剂

（1）纤维蛋白原：

由Cohn-1沉淀制备，蛋白质含量1.25%，每支0.2ml，冻干。

（2）凝血酶：

2U/0.2ml，冻干。

（3）纤溶酶原：

以新鲜正常人血浆过Lys-sepharose4B亲和层析柱，吸附的纤溶酶原用6-氨基己酸洗脱，洗脱的纤溶酶原用生理盐水透析数次后，每支1ml分装备用。

（4）尿激酶标准品：

每支10 000U。

2.检验方法

（1）取纤维蛋白1支，加生理盐水2ml，加纤维蛋白原1ml，在45℃条件下与2ml 1.6%琼脂糖混合，快速制成8cm×8cm凝胶平板。

（2）取冻干凝血酶1支，用生理盐水稀释至2ml，在45℃条件下与1.6%琼脂糖2ml混合，再均匀覆盖于上述凝胶平面板上，此时形成毛玻璃状的纤维蛋白凝胶。

（3）在纤维蛋白凝胶上打孔，孔内径3mm，每孔各加10μl标准品及受检样品，37℃温育6小时后观察结果。纤维蛋白溶解斑直径与u-PA：A的对数成正比。根据标准品浓度与溶斑直径在半对数纸上绘制标准曲线，受检样品可从标准曲线得出其u-PA：A。

【方法学评价】

本法特异性较好，但灵敏度较差，且操作繁琐，难以在临床推广使用。

【质量保证】

1.制板时温度应控制在45℃左右，不能超过50℃。

2.纤维蛋白原、凝血酶、纤溶酶原及尿激酶标准品应在用前稀释，当天使用。

【参考范围】

正常人u-PA：A为0U/ml。

【临床意义】

同u-PA抗原检测。

四、纤溶酶原测定

纤溶酶原（plasminogen，PLG）检测是了解患者纤溶状态的有效指标之一。

（一）PLG抗原测定（PLG：Ag）

【检验原理】

ELISA法。将纯化的PLG单克隆抗体包被在固相载体上，然后加入受检样品，样品中的PLG抗原与固相载体上的抗体形成复合物，此复合物与辣根过氧化物酶标记的PLG单克隆抗体发生抗原抗体结合反应，形成双抗体夹心免疫复合物，后者可使邻苯二胺基质溶液呈棕色反应，其颜色深浅与样品中PLG含量成正比。

【检验方法学】

1.试剂和仪器

（1）兔抗人PLG抗体。

（2）PLG标准品。

（3）酶标抗PLG单抗。

（4）洗涤液：0.01mol/L PBS，含 0.05% Tween-20。

（5）样品稀释液：0.25mol/L EDTA-Na₂-PBS，含 2% BSA。

（6）邻苯二胺溶液：用0.1mol/L枸橼酸盐缓冲液（pH 4.5）配制成1mg/ml浓度。

（7）终止液：3mol/L硫酸。

（8）30%过氧化氢溶液。

（9）0.05mol/L碳酸盐缓冲液。

（10）酶标仪。

2.检验方法

（1）用碳酸盐缓冲液将抗PLG抗体配制成 100mg/L，每孔各加0.1ml，37℃温育3小时或4℃包被过夜。

（2）用洗涤液洗板3次，甩干。

（3）将经系列稀释的标准品及l：200稀释的待测样品加入包被固相抗体的酶标板中，各加100µl，37℃温育2小时，洗涤3次，甩干。

（4）每孔各加酶标抗体 100µl，37℃温育 2小时，洗板 3次，甩干。

（5）于10ml邻苯二胺溶液（1mg/ml）中加入30%过氧化氢溶液 10µl，每孔各加 100µl，显色 10 分钟。

（6）每孔各加50µl终止液终止反应。

（7）于492nm处读取各孔吸光度值。

（8）以标准品浓度为横坐标，与其对应的吸光度值为纵坐标，在半对数纸上绘制标准曲线。

（9）根据受检样品的吸光度值可从标准曲线中查出PLG浓度，然后再乘以稀释倍数，便可得出受检样品中的PLG含量。

【方法学评价】

本法灵敏度和特异性均较高，但操作烦琐，耗时较长，仅适合于批量样品检测。

【质量保证】

1.采血须顺利，避免凝血系统体外活化而影响结果。

2.PLG标准品、PLG单抗及显色溶液均应用前配制。

【参考范围】

（0.22±0.03）g/L。

【临床意义】

PLG：Ag降低，提示其激活物含量增加，多见于原发性纤溶、重症肝炎、肝硬化、肝叶切除术、门脉高压、肝移植、大型手术、前置胎盘、胎盘早剥、肿瘤转移、严重感染及DIC等。

（二）纤溶酶原活性检测（PLG：A）

【检验原理】

发色底物法。PLG在过量链激酶的作用下转变为纤溶酶，纤溶酶作用于发色多肽S2251的酰胺键，使发色多肽释放出产色基团pNA而显色，颜色的深浅与纤溶酶的量呈正相关。

【检验方法学】

1.试剂

（1）发色底物S2251：用蒸馏水配制成5g/L。

（2）链激酶。

（3）Tris-HCl缓冲液：0.05mol/L，pH 7.4。

（4）正常人混合血浆。

（5）反应终止液：50%醋酸。

2.检验方法

（1）将正常人混合血浆用缓冲液作 1：10、1：20、1：40、1：80稀释，各稀释度取50µl加入96孔酶标板中。将受检样品作1：10稀释后取50µl加入酶标板中。

（2）每孔各加50µl链激酶，37℃温育30分钟。

（3）每孔各加发色底物20µl及缓冲液100µl，置微量振荡器振荡1分钟。

（4）37℃温育l小时，加50%醋酸50µl终止反应。

（5）在酶标仪上405nm处读取吸光度值。

（6）以正常人混合血浆中PLG的活性作横坐标（1：10为100%），以405nm处吸光度值为纵坐标在半对数纸上绘制标准曲线。

（7）受检样品吸光度值可在标准曲线上查得PLG的含量，再乘以稀释倍数，便可得到受检样品的PLG：A。

【方法学评价】

本法为发色底物法，故灵敏度和特异性均较高，且操作简便，耗时短，适合临床应用。

【质量保证】

1.采血须顺利，避免凝血系统体外活化而影响结果。

2.正常人混合血浆应至少为30例样品。

3.发色底物应用前配制，当天使用。

【参考范围】

88.55%±27.83%。

【临床意义】

同PLG：Ag测定。

五、纤溶酶抗纤溶酶复合物测定

纤溶酶抗纤溶酶复合物（plasminogen-antiplaminogen，PAP）检测用于高纤溶血症的诊断和溶栓治疗的临床监测。

【检验原理】

ELISA法。用鼠抗人PAP单克隆抗体包板，使用双抗体夹心法检测血浆中的PAP浓度。

【检验方法学】

1.试剂

（1）12×8孔预包被可拆式反应条。

（2）PAP冻干标准品。

（3）乏PAP血浆。

（4）辣根过氧化物酶标记的抗人PLG抗体。

（5）ABTS底物。

（6）终止液。

（7）洗涤缓冲液（浓缩液）。

（8）稀释液（浓缩液）。

2.试剂准备

（1）洗涤缓冲液：

浓缩液20ml加至230ml蒸馏水中。

（2）稀释缓冲液：

浓缩液20ml加至30ml蒸馏水中。

（3）酶标抗体：

加入1.2ml稀释液，充分混匀，此为10倍浓缩液。

（4）乏PAP血浆：

每瓶加入1.1ml蒸馏水溶解，置室温15分钟，混匀。

（5）PAP标准品：

加入0.1ml蒸馏水，置室温15分钟，混匀。按表6-10用稀释液A和B制备系列浓度的PAP标准品。

3.样品的制备

受检全血用0.129mol/L枸橼酸钠作9：1抗凝（内含终浓度为2 000kU/ml抑肽酶和20mmol/L的benzamidine），在4℃条件下，5 000×g离心10分钟，分离血浆，-70℃冻存，使用前37℃融化。受检血浆用稀释液A作1：10稀释或用稀释液B作1：100稀释后进行检测。

4.检验方法

（1）取适量酶标测试条，多余的重新封存，2～8℃保存。

（2）用缓冲液洗板4次。

（3）每孔加100µl标准品或稀释的血浆标本，4℃加盖过夜。

（4）用洗涤缓冲液洗板4次。

（5）将酶标抗体按 1：10稀释，混匀。每孔各加 100µl，37℃温育2小时。

（6）用洗涤缓冲液洗板4次。

（7）每孔各加100µl底物溶液，置室温30分钟。

（8）每孔各加100µl终止液，于405nm处读取吸光度值。

（9）以吸光度值与对应的PAP标准品浓度绘制标准曲线。稀释样品PAP浓度可从标准曲线中查得，此值乘以稀释倍数即为受检血浆的PAP含量。

【方法学评价】

本法灵敏度和特异性均较好，但操作烦琐，耗时较长，限制了其在临床应用。

【质量保证】

1.酶标板、浓缩液和冻干品应置2～8℃保存，配好的稀释液可在2～8℃中保存1个月。

2.冻干品复溶后若一次不能用完，则可分装为每份100µl，-20℃冻存，再次使用前置 37℃融化。

【参考范围】

0～150ng/ml。

【临床意义】

PAP检测结果可反映纤溶酶血症的程度和出血的可能性。PAP含量增加可提示纤维蛋白形成增加和高纤溶酶血症。

六、血浆硫酸鱼精蛋白副凝固试验

本试验反映FDP（尤其是碎片X）是否存在的指标。

【检验原理】

硫酸鱼精蛋白法。在凝血酶作用下，纤维蛋白原释出肽A、B后转变为纤维蛋白单体（FM），纤维蛋白在纤溶酶降解下产生纤维蛋白降解产物（FDP）。FM与FDP形成可溶性复合物，硫酸鱼精蛋白可使该复合物中FM游离，后者又自行聚合呈肉眼可见的纤维状、絮状或胶冻状。

【检验方法学】

1.试剂

10g/L硫酸鱼精蛋白溶液（pH 6.5），分装后置-20℃备用。

2.检验方法

（1）取经0.129mol/L枸橼酸钠抗凝的乏血小板血浆0.5ml。

（2）置37℃水浴中3分钟。

（3）加10g/L硫酸鱼精蛋白溶液0.05ml，混匀，置37℃ 15分钟，立即观察结果。

【结果判断】

1.阴性

血浆透明、清晰，无不溶解物产生。

2.弱阳性

细颗粒沉淀。

3.阳性

粗颗粒沉淀。

4.强阳性

纤维蛋白丝、纤维蛋白网或胶冻形成。

【方法学评价】

本法灵敏度和特异性均较差，容易出现假阳性和假阴性结果。

【质量保证】

1.不能用草酸盐、肝素和EDTA作抗凝剂。

2.抽血不顺利、抗凝不匀、导管内抽血、样品存放冰箱、未能即时观察结果、贫血及抗凝剂不足等均会造成假阳性结果。

3.若水浴温度未达37℃，或受检样品纤维蛋白原含量过低将会造成假阴性结果。

【参考范围】

正常人为阴性。

【临床意义】

1.阳性

多见于DIC早期或中期。

2.阴性

见于正常人、DIC晚期和原发性纤溶症。

七、血浆纤溶酶原激活抑制物-1测定

血浆纤溶酶原激活抑制物-1（plasminogen activator inhibitor-1，PAI-1），本检测是反映纤溶抑制物的指标。

（一）PAI-1抗原测定（PAI-1：Ag）

【检验原理】

ELISA法。将鼠抗人PAI-1 IgG抗体包被于固相，并与受检血浆共孵，再加入过氧化物酶标记的羊抗人PAI-1 IgG抗体，形成抗原抗体复合物，加入底物使其显色，颜色深浅与PAI-1的含量成正比。

【检验方法学】

1.试剂与仪器

（1）6×16孔预包被PAI-1 IgG抗体的微量测试排条。

（2）PET缓冲液：PBS-EDTA-Tween20缓冲液。

（3）PAI-1 标准品“50”：50mg/ml，含 0.5ml。

（4）PAI-1 标准品“0”：乏 PAI-1血浆，0.5ml。

（5）酶标记抗体：过氧化物酶标记的羊抗人PAI-1 IgG抗体。

（6）终止液：4.5mol/L硫酸。

（7）酶标仪。

2.试剂准备

（1）PET缓冲液：

将PET缓冲液溶解于1升蒸馏水中，搅拌15分钟，2～8℃可保存1个月。

（2）PAI-1标准血浆：

加0.5ml蒸馏水至含PAI-1标准品“50”的瓶中，轻轻振荡3分钟，配成50ng/ml PAI-1。加0.5ml蒸馏水至含PAI-1标准品“0”的瓶中，轻轻振荡3分钟，配成0ng/ml PAI-1。

（3）酶标记物：

加7ml PET缓冲液至酶标记物瓶中，轻摇3分钟。

（4）底物：

将基质溶解于3ml蒸馏水中，混匀，再加2ml蒸馏水，可分装成4瓶，-20℃保存。

3.检验方法

（1）取适量微量测试排条并置于托板上，用PET缓冲液洗去排条中的防腐剂。

（2）PAI-1标准品的制备：按表6-11加PAI-1标准品“50”和 PAI-l标准品“0”，混匀。

（3）受检样品：患者全血用0.129mol/L枸橼酸钠作9：1抗凝，1 500×g离心15分钟，分离乏血小板血浆。受检血浆一般无需稀释，只有当PAI-1大于50ng/ml时，用PAI-l标准品“0”稀释。

（4）样品加样：在第一列各孔加20μl对照血浆，剩余的孔可加等量受检样品，25℃放置l小时，置摇床混匀（400～500转/min）。

（5）酶标记物：每孔加50µl酶标记物，25℃温育l小时，置摇床混匀。

（6）洗涤：用PET缓冲液洗板4次，甩干。

（7）底物：如分装底物溶液 4ml，加 30% H₂O₂ 3～5µl，每孔加200µl底物，置摇床混匀。

（8）终止液：显色10分钟后加50µl终止液终止反应。

（9）在492nm处检测吸光变值。以PAI-1：Ag含量（ng/ml）为横坐标，其相应的492nm处的吸光度值为纵坐标绘制标准曲线。

【方法学评价】

本法灵敏度和特异性均较高，但操作烦琐，仅适合于批量样品检测。

【质量保证】

1.乏血小板血浆的制备必须规范，血浆中不得污染过多的血小板，否则将影响结果。

2.PAI-l水平在每天15时左右最低，故采样时应特别注意。

3.酶标记物可在2～8℃保存1个月，底物经分装后可在-20℃保存1个月。

4.防腐剂可抑制过氧化物酶活性，因此在加标记抗体前必须用PET缓冲液洗净各检测孔。

【参考范围】

4～13ng/ml。

【临床意义】

1.PAI-1：Ag增高

见于深静脉血栓、心肌梗死和败血症等。在妊娠后期，PAI-1：Ag可比正常增高3～6倍。

2.PAI-1：Ag降低

多见于原发性和继发性纤溶。

（二）PAI活性测定（PAI：A）

【检验原理】

发色底物法。过量的t-PA加入到受检血浆中，部分与PAI作用，形成无活性的复合物，剩余的t-PA作用于PLG，使其转化为纤溶酶，后者水解发色底物S2251，释放出pNA，生色强度与PAI：A成反比。

【检验方法学】

1.试剂和仪器

（1）浓缩缓冲液：用前用蒸馏水作l：24稀释。

（2）纤溶酶原。

（3）共价物。

（4）发色底物 S2251。

（5）标准品（10.0U）：使用前用缓冲液稀释至 t-PA：A 5.0×10-2U/ml。

（6）终止液：3mol/L硫酸。

（7）酶标仪。

2.标准曲线的绘制

（1）取活性为 5.0×10-2U/ml的 t-PA 500µl，加入等量缓冲液，混匀，使t-PA活性为2.5×10-2U/ml。此时PAI的相对活性为0任意单位（arbitrary unit，AU）。任意单位是PAI的活性单位，其定义为在25℃，20分钟内抑制1.0U t-PA的PAI酶量即为1.0AU。按表6-12加至酶标板上。

（2）各用缓冲液2ml将发色底物、共价物、纤溶酶原溶解，然后将三者混合，每孔各加100µl，将酶标板置湿盒中保温150～180分钟（以3号孔405nm吸光度值为0.8左右为准）。

（3）于405nm处读取吸光度值，用1号孔调零点。

（4）以405nm吸光度值为纵坐标，PAI相对活性为横坐标绘制标准曲线。

3.检验方法

（1）受检血浆用缓冲液稀释20倍（取血浆50µl，加缓冲液950µl），吸取其中 200µl，与等量活性为 5.0×10-2U/ml的标准t-PA混合，置25℃20分钟，吸取100µl加入至酶标板孔中。

（2）余同标准曲线绘制步骤2～3。待测样品PAI活性可以从标准曲线中查得，将查得结果乘以40，再乘以1.1（抗凝剂与静脉血1：9稀释）即可。

【方法学评价】

本法灵敏度和特异性均较佳，但检测的线性范围较窄，极高活性样品必须稀释后重测。

【质量保证】

1.试剂一旦溶解应一次用完，不能贮存。

2.温育时间视标准品的显色程度作适当选择。

3.血浆样品于-20℃中可保存1个月。

【参考范围】

0.1～1AU/ml。

【临床意义】

同 PAI-l：Ag 检测。

八、α₂-纤溶酶抑制物测定

α₂-纤溶酶抑制物测定（α₂-plasminogen inhibitor，α₂-PI）是反映纤溶抑制物的指标。

（一）α₂-PI抗原测定（α₂-PI：Ag）

【检验原理】

ELISA法。将α₂-PI：Ag抗体包被固相载体，然后加入标准品和受检样品，最后加入酶标α₂-PI：Ag抗体，检测受检血浆中的α₂-PI：Ag浓度。

【检验方法学】

1.试剂和仪器

（1）抗α₂-PI单克隆抗体。

（2）α₂-PI标准品。

（3）酶标α₂-PI单克隆抗体。

（4）0.01mol/L PBS（含 0.05% Tween-20）。

（5）样品稀释液：0.25mol/L EDTA-Na₂-PBS（含 2% BSA）。

（6）邻苯二胺溶液（1mg/ml）：用 pH 4.5，0.1mol/L 枸橼酸盐缓冲液配制。

（7）30%过氧化氢溶液。

（8）0.05mol/L 碳酸盐缓冲液，pH 9.6。

（9）3mol/L硫酸终止液。

（10）酶标仪。

2.检验方法

（1）用碳酸盐缓冲液稀释α₂-PI单克隆抗体，每孔各加0.1ml，4℃包被过夜。

（2）用含Tween-20的PBS洗板3次，甩干。

（3）将经系列稀释的标准品及稀释的受检样品各0.1ml于酶标板孔中，37℃温育2小时，洗板3次，甩干。

（4）每孔各加0.1ml酶标抗体，37℃温育2小时，洗板3次，甩干。

（5）加入新鲜配制的底物溶液（含1mg/ml邻苯二胺、3%过氧化氢）0.1ml，显色10分钟。

（6）每孔各加3mol/L硫酸溶液50µl终止反应。

（7）于酶标仪492nm处读取各孔吸光度值。

（8）以标准品浓度为横坐标，以其相应的吸光度值为纵坐标，在半对数纸上绘制标准曲线。

（9）根据待检样品的吸光度值可从标准曲线中查出其对应的α₂-PI：Ag值，再乘以稀释倍数，即可得出受检样品中实际的 α₂-PI：Ag 浓度。

【方法学评价】

本法灵敏度和特异性均较佳，但耗时较长，仅适合于批量样品检测。

【质量保证】

1.酶标板及各种检测用试剂应在2～8℃中保存，临用前按需取出。

2.标准品、酶标抗体及底物溶液应临用前配制，当天使用。

【参考范围】

（66.9±15.4）mg/L。

【临床意义】

用于α₂-PI缺乏症的分型。当α₂-PI：Ag抗原和活性均下降时为CRM-，而当α₂-PI：Ag抗原正常但活性下降时为CRM+。

（二）α₂-PI活性测定（α₂-PI：A）

【检验原理】

发色底物发。在受检样品中加入过量纤溶酶，纤溶酶与样品中的α₂-PI结合形成复合物，剩余的纤溶酶水解发色底物S2251，使后者释放出对硝基苯胺（PNA）而显色，显色深浅与α₂-PI：A 成反比。

【检验方法学】

1.试剂

（1）纤溶酶。

（2）发色底物 S2251。

（3）标准血浆：20例以上正常人混合血浆。

（4）终止液：2mol/L硫酸。

2.检验方法

（1）标准品的稀释：将标准血浆稀释10倍，设此时的α₂-PI活性为200%，按表6-13加入至酶标板中。

（2）将待测样品用缓冲液稀释20倍，取100µl加至酶标板中，37℃温育10分钟。

（3）将发色底物及纤溶酶分别用1ml缓冲液溶解，37℃温育30分钟。

（4）取50µl纤溶酶加至各受检样品中，37℃温育2分钟。

（5）取50µl发色底物加至上述各孔中，混匀，置室温中1分钟，加入终止液20µl，于酶标仪405nm处检测吸光度值。

（6）以标准品405nm处吸光度值为纵坐标，以α₂-PI：A为横坐标绘制标准曲线。

（7）根据待测样品的吸光度值在标准曲线上查出α₂-PI：A，再乘以稀释倍数便可得到受检样品的α₂-PI：A。

【方法学评价】

具有很高的敏感性和特异性，且操作简便，耗时短，适合临床应用。

【质量保证】

1.试剂溶解后应一次用完，不得贮存。

2.样本稀释度应视显色深浅作适当调整。

3.底物的作用时间应根据标准曲线各孔的显色程度而定。

4.所有试剂均应新鲜配制。

（李　健　张利伟）