第五节　天然抗凝蛋白检测技术

一、抗凝血酶测定

抗凝血酶（antithrombin，AT）是天然抗凝物质之一，是血栓前状态和血栓栓塞性疾病诊断的有效手段之一。

（一）AT抗原检测（AT：AG）

【检验原理】

ELISA法。将AT单克隆抗体包被在固相酶标板上，样品中的AT与包被于固相上的抗体结合，再加入酶标抗体，形成抗体-抗原-酶标抗体的复合物，然后加入显色基质，根据发色的深浅来判断标本中AT的含量。

【检验方法学】

1.试剂与仪器

（1）0.1mol/L碳酸盐缓冲液（pH 9.6）。

（2）抗人AT单克隆抗体。

（3）AT标准品。

（4）酶标抗人AT单克隆抗体。

（5）洗涤液：0.01mol/L PBS（含 0.05% Tween-20）。

（6）样品稀释液：0.25mol/L EDTA-Na₂-PBS（含 2% BSA）。

（7）邻苯二胺溶液（1mg/ml）：用 pH 4.5，0.1mol/L 枸橼酸盐缓冲液配制。

（8）3mol/L硫酸（终止液）。

（9）30%过氧化氢溶液。

（10）酶标仪。

2.检验方法

（1）用碳酸盐缓冲液将抗人AT单克隆抗体配制成适当浓度，加0.1ml至酶标板各孔中，4℃包被过夜。

（2）用洗涤液洗涤3次，甩干。

（3）将经样品稀释液一系列稀释的标准品及受检血浆0.1ml加入含固相抗体的酶标板中，37℃温育2小时，取出用洗涤液洗涤3次。

（4）每孔加0.1ml适当浓度的酶标抗人AT单克隆抗体，37℃温育2小时，取出，用洗涤液洗涤3次。

（5）加新鲜配制的含1mg/ml邻苯二胺、3%过氧化氢的枸橼酸盐缓冲液0.1ml，显色10分钟。

（6）每孔加0.05ml 3mol/L硫酸溶液终止反应。

（7）在酶标仪上于492nm波长测各孔吸光度值。

（8）以标准品的浓度为横坐标，以其对应的吸光度值为纵坐标，在半对数纸上绘制标准曲线。

（9）以待测样本的吸光度值从标准曲线上查出其对应的AT含量，再乘以稀释倍数，即得出样品中的AT抗原浓度。

【方法学评价】

本法灵敏度高，特异性强，已为临床广泛使用。

【质量保证】

1.采血须顺利，分离血浆后应尽快检测，若不能马上检测，则应将血浆置-30℃冻存，临用前将血浆样品融解，切忌反复冻融。

2.受检全血应用0.109mol/L枸橼酸钠作9：1抗凝，切忌使用肝素抗凝。

【参考范围】

（0.29±0.03）g/L。

【临床意义】

1.AT抗原下降

（1）遗传性：

包括交叉反应物质阴性型，表现为抗原和活性均下降和交叉反应物质阳性型，表现为抗原正常，活性下降。

（2）获得性：

包括肝脏疾病、肾病、血栓前状态和血栓性疾病。

2.AT抗原增高

主要见于血友病、口服抗凝剂以及使用黄体酮类药物。

（二）抗凝血酶活性检测（AT：A）

【检验原理】

发色底物法。在待测血浆中加入过量的凝血酶，凝血酶与血浆中的AT形成l：l的复合物，剩余的凝血酶作用于显色肽S2238，裂解出显色基团对硝基苯胺（pNA），显色程度与剩余凝血酶的量呈正相关，而与AT：A呈负相关。

【检验方法学】

1.试剂

（1）标准血浆。

（2）底物 S2238（浓度为 5×10-7mmol/L）。

（3）凝血酶溶液：牛凝血酶用生理盐水配成7.5～7.7U/ml，每10ml溶液中加入聚乙二醇6000 0.5g，混匀。

（4）Tris-肝素缓冲液：0.05mol/L Tris，7.5×10-3mol/L，EDTA-Na₂·2H₂O，1.75×10-4mol/L 氯化钠，用 1mol/L 盐酸调节pH至8.4，每升缓冲液中含肝素3万单位。

（5）50%醋酸溶液。

2.检验方法

（1）将标准及受检血浆按表6-5作系列稀释。

（2）将系列稀释的标准血浆及待测标本与Tris-肝素缓冲液混合，于37℃温育5分钟。

（3）加入凝血酶 50µl，混匀，37℃放置 30 秒。

（4）加底物 150µl，混匀，37℃温育 30 秒。

（5）加50%的醋酸溶液终止反应后，在405nm下测吸光度值。

（6）以标准品抗凝血酶活性为横坐标，以其相应的吸光度值为纵坐标，在半对数纸上绘制标准曲线。

（7）根据受检标本的吸光度值可在标准曲线上查出其AT：A（%），若样品预先经过稀释则必须乘以稀释倍数。

【方法学评价】

本法灵敏度高，特异性强，已为临床广泛使用。

【质量保证】

同AT抗原测定。

【参考范围】

108.5%±5.3%。

【临床意义】

同AT抗原测定。

二、蛋白C测定

蛋白C（protein C，PC）是天然抗凝物质之一，是血栓前状态和血栓栓塞性疾病诊断的手段之一。

（一）PC抗原测定（PC：Ag）

【检验原理】

Laurell免疫火箭电泳法是在含PC抗血清的琼脂板中，加入受检血浆，在电场作用下，抗原和抗体反应形成火箭样的沉淀峰，此峰高度与抗原浓度成正比，因而可以计算出PC抗原的含量。

【检验方法学】

1.试剂和器材

（1）PC抗血清。

（2）PC缓冲液：巴比妥钠1.62g/L，Tris 5.56g/L，甘氨酸7.05g/L，EDTA-Na₂ 1.89g/L，PEG6000 10g/L，pH 8.8。

（3）0.9% 琼脂糖：琼脂糖 0.9g，PC 缓冲液 100ml。将琼脂糖置于PC缓冲液中，加热溶解，趁热用薄棉花过滤后使用。

（4）1%磷钼酸溶液：磷钼酸10g，加蒸馏水至1 000ml，溶解后用滤纸滤过后使用。

（5）U形有机玻璃框：框的内径8cm×8cm，厚1.5cm。

2.检验方法

（1）制板：

将0.9%琼脂糖煮沸溶解后置于50～56℃水浴中备用。取一只小烧杯，根据抗血清的效价，进行适当调整，按每次实验所需的量加入所需的人PC抗血清，倒入上述0.9%琼脂糖，充分混匀，尽量避免气泡。取10cm×10cm玻璃板两块，中间放入上述有机玻璃框，三边用夹子固定，于上口处迅速倒入含抗血清的琼脂糖，每板浇10ml左右，置4℃冰箱10～15分钟，待凝固后除去一块玻璃板，在离玻璃板下缘1.5cm处打10个孔，孔径3mm，孔距5mm。

（2）标准样品的制备：

取30例正常人新鲜或冰冻混合血浆，用 PC 缓冲液作原倍，l：2，1：4.1：8，1：16 稀释。

（3）受检样品的制备：

将受检血浆用TPC缓冲液作1：2稀释。

（4）标准品加样：

每孔加入受检样品10µl，每板均同时各加上述5种不同稀释度的标准样品10µl，制备标准曲线。

（5）电泳：

每侧加入PC缓冲液500～1 000ml，两侧液面应一致，将玻璃板放在两槽之间，孔朝向阴极，火箭方向朝阳极，用两层滤纸搭桥，电桥间距为5.3cm左右；调节电压至110V，电泳18小时。

（6）染色：

电泳完毕后，取出玻璃板，浸入1%磷钼酸溶液中20～30分钟。

（7）测量火箭电泳高度：

用两分规从加样孔上缘至顶峰测量火箭峰高度。用正常人血浆的5个稀释度峰值通过回归得到标准曲线，便可求出受检样品中的PC抗原含量，结果再乘以2（稀释倍数）。

【方法学评价】

本法特异性高，但灵敏度较差，且耗时较长，故限制了临床广泛应用。

【质量保证】

1.受检样品采血须顺利，1 500×g离心10分钟，分离血浆后应立即检测，不能立即检测的应将血浆置-30℃保存备用。

2.含抗血清的琼脂糖制备时琼脂糖的温度应不高于60℃，否则抗血清的活性将受到抑制。

【参考范围】

96.1%±28.3%。

【临床意义】

1.PC减低

（1）先天性减低：

患者表现为反复的无明显原因的血栓形成。Ⅰ型患者表现为PC抗原含量与活性均降低；Ⅱ型者PC抗原正常，而活性下降。

（2）获得性减低：

多见于弥散性血管内凝血、呼吸窘迫综合征、肝功能不全、手术后及口服双香豆素类抗凝剂。

2.PC增高

多见于冠心病、糖尿病、肾病综合征、妊娠后期等，表现为代偿性增加。

（二）蛋白C活性测定（PC：A）

【检验原理】

发色底物法。Protac（从蛇毒中提取）是PC特异的激活剂，活化的PC（APC）作用于发色底物可释放出产色基团对硝基苯胺，显色深浅与PC活性呈线性关系。

【检验方法学】

1.试剂与仪器

（1）缓冲液A：0.04mol/L巴比妥缓冲液，pH 7.4。

（2）Protac激活剂（每瓶 3U）：加缓冲液 A 3ml，分装。置-20℃保存，使用时稀释成0.15U/ml。

（3）显色溶液：用双蒸馏水将Chromogym-PC：A配成1.6mmol/L。

（4）99%冰醋酸溶液。

（5）酶标仪。

2.标准曲线的制备

（1）正常人混合血浆用缓冲液A稀释成活性为100%、80%、60%、40%、20%、10%，并用缓冲液A作空白。

（2）将已稀释的血浆25µl加激活剂100µl，置37℃水浴8分钟，然后加显色液100µl，37℃温育10分钟，加99%冰醋酸溶液50µl，终止反应，于450nm处读取吸光度值。

（3）将所得的吸光度值与相应的血浆稀释度做直线回归处理，或以吸光度为横坐标，血浆稀释度为纵坐标绘制标准曲线。

3.检验方法

将受检样品用缓冲液A作1/2稀释，余同标准曲线。

【方法学评价】

本法操作简便，且灵敏度和特异性均较佳，适合临床广泛应用。

【质量保证】

1.患者全血与0.105mol/L枸橼酸钠作9：1抗凝，1 500×g离心15分钟，分离血浆后应立即检测或置-20℃待检。

2.发色底物分装后必须置-20℃保存，有效期内使用。

【参考范围】

64%～147%。

【临床意义】

同PC抗原检测。

三、蛋白S测定

蛋白S（protein S，PS）是天然抗凝物质之一，是血栓前状态和血栓栓塞性诊断的有效手段。

（一）PS抗原测定（PS：Ag）

【检测原理】

Laurell免疫电泳法。是在含PS抗血清的琼脂板中，加入一定量的受检血浆，在电场的作用下，定量的抗原和抗体反应形成火箭样沉淀峰，此峰高度与PS浓度成正比。血浆总PS（TPS）包括游离 PS（FPS）和与补体 C₄结合的 PS（C_4bp-PS）。

【检测方法学】

1.仪器与试剂

（1）抗人PS血清。

（2）巴比妥钠缓冲液：每升含巴比妥钠10.32g，甘氨酸7.52g，Tris 0.6g，EDTA 1.46g，pH 9.0。

（3）25%聚乙二醇6000。

（4）0.9%琼脂糖：琼脂糖0.9g，加入巴比妥钠缓冲液100ml，加热溶解，趁热用薄棉花过滤后使用。

（5）1%磷钼酸溶液：磷钼酸10g，加水至1 000ml，溶解后滤纸滤过后使用。

（6）有机玻璃框U形：框内径8cm×8cm，厚1.5cm。

（7）电泳仪。

2.标准曲线的绘制

（1）取抗人PS血清，用巴比妥钠缓冲液配制成含1% PS抗血清的琼脂糖凝胶板。

（2）将 TPS 标准血浆稀释成原倍（100%），1：2（50%），1：4（25%），1：8（12.5%），1：16（6.25%）。

（3）每孔加样 10µl。

（4）电泳条件同PC：Ag检测。

（5）FPS：取 2支试管，各加入正常人混合血浆 300µl，并加入聚乙二醇6000 50µl，充分混匀，室温下放置30分钟，然后以1 500×g离心10分钟，取上层血浆，一支作为原倍（100%），另一支作1：2（50%），l：4（25%），1：8（12.5%），1：16（6.25%）稀释。与TPS在同一琼脂板上进行电泳。

（6）染色：将电泳后的琼脂板置1%磷钼酸染色液中5～15分钟（以磷钼酸新鲜度而定），即可见清晰的火箭沉淀峰。

（7）采用直线回归，将测得的峰高与相应的血浆稀释度做直线回归处理，y=bX+a。

3.检验方法

（1）受检血浆用0.13mol/L枸橼酸钠抗凝，FPS处理同标准曲线制作，TPS和FPS均每孔加10µl，余均同标准曲线。

（2）将检测样品峰高值代入公式中X，而Y即为PS值。

【方法学评价】

同PC抗原检测。

【质量保证】

FPS样品制备好的上层血浆应当天检测；一份样品同时做总PS（TPS）和游离PS（FPS），加样时可以单孔为TPS，双孔为FPS，以便分析结果。

【参考范围】

TPS：96.6%±9.8%；FPS：100.9%±11.6%。

【临床意义】

1.PS作为PC的辅因子，对因子Ⅴa和Ⅷa有加速灭活作用，先天性PS缺陷者常伴发严重的深静脉血栓。

2.获得性PS缺陷多见于肝功能障碍、口服双香豆素类抗凝剂等。

（二）PS活性测定（PS：A）

【检测原理】

受检血浆与乏PS血浆混合，然后加入含因子Ⅹa活化的PC及磷脂，温育5分钟后，加入Ca2+，立即计时，记录血浆凝固时间。血浆凝固时间的延长与受检血浆中PS的活性呈正相关。

【检验方法学】

1.试剂

（1）活化剂：

1ml，冻干，内含活化的PC，牛因子Ⅹa和兔脑磷脂。

（2）乏PS血浆：

1ml，冻干。通过羊抗人PS抗体免疫吸附柱而制备。

（3）样品稀释缓冲液（×10）：

含 0.2mol/L NaCl，0.03mol/L Hepes和 0.015mol/L叠氮钠，pH 7.35。缓冲液中还含有聚凝胺（Polybrene），能中和受检血浆中最多1.2U/ml的肝素。

2.试剂制备

（1）活化剂：

加蒸馏水1ml，置室温20分钟，充分混匀，溶解后的活化剂28℃环境中可保存4小时，-20℃可保存30天。

（2）乏PS血浆：

加蒸馏水1ml，置室温20分钟，充分混匀，溶解后的乏PS血浆28℃环境中可保存4小时，-20℃可保存30天。

（3）样品稀释液：

每瓶加蒸馏水25ml，2～8℃保存。

3.检验方法

（1）静脉采血，与0.129mol/L枸橼酸钠作9：1抗凝，1 500×g离心15分钟，分离血浆。取受检血浆0.5ml，加入稀释缓冲液450μl备用。

（2）取乏 PS 血浆 0.1ml，加入稀释的受检血浆 0.1ml，37℃温育2分钟。

（3）加0.1ml活化剂，37℃温育5分钟。

（4）标准曲线的绘制：取至少10个正常人的全血，同患者样品分离血浆，按表6-6制备标准曲线，同受检样品检测，以凝固时间为纵坐标，PS活性百分率为横坐标绘制标准曲线。

（5）结果计算：受检样品凝固时间可以从标准曲线中查得PS活性C（%）。

【方法学评价】

本法灵敏度和特异性均较高，且操作方法简便易行，适合临床使用。本试验当PS活性在正常范围内时的CV为12%，线性范围为12.5%～180%。

【质量控制】

1.当受检血浆中肝素含量大于1.2U/ml或存在狼疮样抗凝物质时，本试验可出现假阳性。

2.当PS活性极度增高时，需将样品稀释后重测，若稀释后仍未按稀释比例下降时，提示受检血浆中含有狼疮样抗凝物质。

3.为保证检测的精密度和重复性，着重强调孵育的时间和温育温度的重要性。

【参考范围】

55%～160%。

【临床意义】

PS活性降低多见于血栓栓塞性疾病。

（李　健　张利伟）