第三节　血小板检验技术

一、血小板聚集仪检验技术

血小板聚集仪检验（platelet aggregation test，PagT）反映血小板的聚集功能。

【基本原理】

比浊法。在特定的连续搅拌条件下，于富含血小板血浆中加入诱导剂，由于血小板发生聚集，富血小板血浆（PRP）的浊度就会发生相应变化，光电池将浊度的变化转化为电讯号的变化，并在记录仪或电脑专用软件上予以记录，根据描记曲线即可计算出血小板聚集的程度和速度。

【主要结构】

血小板聚集仪主要结构包括样品槽及预温装置、搅拌系统、光电转换器、信号放大器、信号监测器、中央处理器和显示器等（图6-1）。

【检测指标】

目前国外先进的血小板聚集仪可同时检测ATP释放、血小板内Ca2+含量、GPⅡb/Ⅲa受体阻断及各种诱导剂（ADP、AA、Epi、Col、Ris、凝血酶等）的血小板聚集试验。

【方法学评价】

1.检测速度快　性能优越的血小板聚集仪有多至8个检测通道，同时检测8份样品只需5分钟。

2.检测项目多　目前市售的血小板聚集分析仪不仅限于检测血小板聚集，还能同时检测血小板的其他功能，如ATP释放、血小板内Ca2+含量、GPⅡb/Ⅲa受体阻断等。

3.用血量少　每份受检样品只需PRP 250µl、贫血小板血浆（PPP）250µl。

4.各检测通道间重复性稍差，要求CV ＜ 15%。

【质量控制】

1.采血须顺利，避免反复穿刺而将组织液混入血液内，导致血小板体外活化。

2.PRP制备完成后30分钟内不能进行检测，因此时血小板反应性较差，但整个检测过程应在2小时内完成。

3.受检样品应置15～25℃室温为宜。

4.血浆pH低于6.4可抑制聚集反应；而高于8.0则可增加聚集反应。

5.当血细胞比容大于55%时，由于枸橼酸钠浓度在血浆中增高，可使血小板聚集反应减弱，尤其是二相聚集反应；而在贫血患者则应增加抗凝剂的量。

6.用于检测的PRP中血小板计数小于100×109/L或高于1 000×109/L时，则聚集反应减弱。

7.溶血和脂血可降低血浆透光率，故可掩盖血小板聚集反应的透光率变化，从而影响检测结果。

8.阿司匹林、双嘧达莫、川芎嗪等药物可抑制血小板聚集反应。

9.应以500×g离心5分钟制备PRP，1 500×g离心20分钟制备PPP。

【参考范围】

各实验室应根据所用仪器及型号建立各自的参考范围。

【临床意义】

1.PagT降低

见于血小板无力症、巨大血小板综合征、储存池病、May-Hegglin异常、低（无）纤维蛋白原血症、肝硬化、尿毒症、细菌性心内膜炎及服用抗血小板药物等。

2.PagT增高

见于糖尿病、急性心肌梗死、动脉血栓形成、高β脂蛋白血症、人工瓣膜、口服避孕药、高脂饮食、过度饮酒及吸烟等。

二、P-选择素测定

本检测反映患者血小板活化的有效指标。

（一）血小板表面P-选择素测定

【检验原理】

放射免疫法法。P-选择素又称血小板颗粒膜蛋白-140（GMP-140）。受刺激的血小板，其α颗粒膜蛋白在血小板膜表面表达。用核素标记的抗P-选择素的单克隆抗体即能与血小板膜表面的P-选择素结合，结合量可通过放射强度的测定而获得。

【检验方法学】

1.试剂

（1）抗凝剂：

50mmol/L EDTA-Na₂溶液。

（2）固定液：

0.2%戊二醛0.011mol/L PBS。

（3）抗体稀释液：

0.35% BSA，0.01mol/L PBS，pH 7.4。

2.检验方法

（1）患者全血以9：1与抗凝剂混合，随后与固定液等量混合，室温下静置30分钟。

（2）抗体稀释液将血液标本中血小板数调至25×109/L。

（3）取100µl上述全血样品用抗体稀释液洗涤1次后，加入 50µl（SZ51，0.1/µg）125I-SZ51。混匀后，室温下静置 30分钟。

（4）非特异吸附标本则在100µl全血标本中加入100倍未标记的SZ51，抗体同时加入反应管内，以稀释液洗涤3次。

（5）样品管和非特异吸附标本管均作双管。

3.计算

根据1个抗体分子仅结合一个P-选择素分子的推算，将结合在血小板上的每分钟脉冲计数换算成每个血小板上P-选择素的分子数。

公式6-1中6.023×1023为IgG在1mol/L时的分子数，IgG相对分子质量为165 000。

【方法学评价】

本法为放射免疫法，具有较高的特异性和灵敏度，且操作简便。

【质量保证】

1.采血必须顺利，避免体外激活血小板。

2.样品必须在采集后24小时内检测。

3.血小板计数必须准确，否则影响计算结果。

【参考范围】

（780±490）分子数/血小板。

【临床意义】

血小板表面P-选择素表达增强发生在血小板被激活时，P-选择素增高多见于血栓性疾病，如急性心肌梗死，脑梗死时。

（二）血浆P-选择素测定

【检验原理】

放射免疫法法。当血小板破坏时，P-选择素进入血浆。用两种抗P-选择素单克隆抗体，定量检测血浆内P-选择素的含量，以此反映血小板活化程度。

【检验方法学】

1.试剂

（1）包被液：

0.1mol/L碳酸盐缓冲液。

（2）洗涤液：

0.05% Tween-20，0.01mol/L PBS，pH 7.4。

（3）单克隆抗体：

SZ5l和 125I-SZ12。

（4）稀释液：

0.35% BSA，0.01mol/L PBS。

2.检验方法

（1）包被：在微孔板中，每孔加入 4µg/ml的 SZ51 100µ1，置4℃过夜。

（2）反应：微孔板用洗涤液洗涤3次后，每孔加受检血浆 100µl，37℃温育 2 小时，洗涤后每孔加入 125I-SZ12 0.1µg，37℃温育l小时。

（3）检测：洗涤后，作每分钟脉冲计数。

（4）非特异吸附样品孔中，以0.35% BSA-PBS替代受检血浆，操作同样品检验。

（5）计算如下：

【方法学评价】

本法为放射免疫法，具有较高的特异性和敏感度，且操作简便。

【质量保证】

同血小板表面P-选择素测定。

【参考范围】

（1.61±0.72）×1010分子数/ml。

【临床意义】

同血小板表面P-选择素测定。

三、血块收缩试验

本检验是反映血小板质与量的指标。

【检验原理】

全血在试管内凝固后，在血小板收缩蛋白作用下，发生血块收缩。血块回缩取决于血小板数及纤维蛋白原含量，血块回缩的定量分析可以通过PRP再钙化后测定凝块质量来达到。

【检验方法】

器材如下：

（1）干净玻璃管（6cm×0.85cm）。

（2）0.05mol/L氯化钙溶液。

（3）抗凝剂：将0.027mol/L EDTA-Na₂溶解在0.7%氯化钠溶液中。

【操作方法】

1.静脉血1.8ml与抗凝剂以9：1混合后颠倒混匀数次，500×g离心10分钟，吸取上层富含血小板血浆，余下标本以1 500×g离心20分钟，取得上层乏血小板血浆。

2.用乏血小板血浆调节富含血小板血浆中血小板数到达200×109/L。

3.取上述样品0.45ml置洁净玻璃试管内，加0.05mol/L氯化钙溶液0.05ml，轻轻混合37℃温育l小时。

4.小心取出凝块，称取血浆凝块质量。

【方法学评价】

本法是血块收缩检测的经典方法，简便易行，适合临床应用。但影响因素较多，重复性较差。

【质量保证】

1.必须严格按照要求分离富含血小板血浆和乏血小板血浆。

2.必须严格按照要求调节受检血浆中的血小板数。

3.采血须顺利，以防体外血小板被激活。

【参考范围】

（56±14）mg。

【临床意义】

血块回缩减少见于血小板无力症、低（无）纤维蛋白原血症、重度血小板减少；纤维蛋白原增高时血块回缩加速。

四、血栓烷B₂测定

血栓烷 B₂（thromboxane B₂，TXB₂）检测是反映血小板环氧化物酶的有效指标。

【检测原理】

放射免疫法法。待测样品中的TXB₂和放射性标记的TXB₂与不足量的抗TXB₂抗体竞争性结合，根据与抗体结合的放射性TXB₂的量推算出待测样品中TXB₂抗原的含量。

【检验方法学】

1.试剂

（1）TXB₂放射免疫分析药盒。

（2）醋酸乙酯（分析纯）：每1 000ml中加无水碳酸钾30g，振荡5分钟，室温过夜，于76～77℃重蒸馏，收集蒸馏液。

（3）石油醚（分析纯）：于30～60℃重蒸馏。

（4）TXB₂系列标准品：浓度为1.6µg/L倍比稀释至25ng/L共7个点。

2.检验方法

（1）样品：

静脉采血 4ml与 0.2ml 50mmol/L EDTA·NA₂抗凝液混匀。4℃，1 500×g离心15分钟。取出上层血浆，立即置-20℃储存。

（2）提取：

1ml血浆中加1mol/L盐酸溶液0.1ml，使pH至3.5。加重蒸馏醋酸乙酯5ml，振荡提取两次，将两次提取液合并，减压干燥，-20℃保存。

（3）复溶：

取出-20℃保存的样品，室温下平衡20分钟，加PBS 1ml使内容物溶解，加入石油醚5ml。洗脱瓶壁后移至提取管中提取，离心。弃去上层石油醚。水相为待测样品。

（4）放射免疫法分析操作：

按表6-1进行。

上述标本于4℃，1 500×g离心15分钟，上清液全部倒入含有11ml闪烁液的测量瓶内，混匀后置室温平衡3小时，在液闪测量仪中进行检测。

3.计算

（标准管计数-空白管计数）/（零标准管计数-空白管计数）的百分比值为纵坐标，TXB₂标准品浓度为横坐标，在半对数坐标纸上绘制标准曲线。被测样品的结合率按上式中将样品管计数替换标准管计数即可，从标准曲线上可查得其相应浓度值，再乘以10，除以0.9（回收率校正），即得每毫升血浆中TX B₂含量。

【方法学评价】

本法具有灵敏度高，特异性强等优点，但操作繁琐，耗时较长。

【质量保证】

1.采血要顺利，避免血小板的体外活化。

2.提取过程要充分，否则将影响检测结果。

【参考范围】

男性：（132±55）ng/L；女性：（116±30）ng/L。

【临床意义】

1.TXB₂增高

见于糖尿病、动脉粥样硬化、急性心肌梗死等疾病。

2.TXB₂减少

见于服用阿司匹林等非甾体抗炎药物或先天性血小板环氧化酶缺陷患者。

五、血小板膜糖蛋白测定

血小板膜糖蛋白（platelet membrane glycoprotein，GP）检测对血小板膜蛋白缺陷所致的血小板功能障碍患者的诊断具有重要意义。

（一）放射免疫法定量测定

【检验原理】

应用抗人GP单克隆抗体与人血小板的特异反应，通过放射免疫分析法可以定量测定血小板膜GP的含量。

【检验方法学】

1.试剂与仪器

（1）单克隆抗体：SZ-2为抗血小板膜GPⅠb单抗，SZ-22为抗血小板膜GPⅡb单抗，SZ-21为抗血小板膜GPⅢa单抗。它们都是IgG，经蛋白A-Sepharose4B亲和层析柱提取纯化，贮存于-40℃。

（2）125I标记抗体：采用Iodogen法。标记的单抗分装后贮存于-20℃备用，或以0.02%叠氮钠防腐后贮存于4℃，可用1个月。

（3）苔氏缓冲液：氯化钠138mmol/L，氯化钾2.9mmol/L，碳酸氢钠12mmol/L，磷酸二氢钠0.4mmol/L，葡萄糖5.75mmol/L，EDTA-Na₂ 5mmol/L，调pH至7.4。临用前加入BSA成0.35%。

（4）抗凝剂 -固定剂溶液：EDTA-Na₂ 10mmol/L，戊二醛0.2%，叠氮钠0.02%，用pH 7.4 PBS配制。

（5）抗凝剂：EDTA-Na₂ 50mmol/L，氯化钠 120mmol/L。

（6）血小板计数液：1%草酸铵。

（7）Tris-甘氨酸溶液：Tris 50mmol/L。甘氨酸 100mmol/L，pH 7.4。

（8）实验器材：用乙醚配制2%的硅油硅化，或用塑料制品代之。

（9）光学显微镜。

（10）X闪烁测定仪。

2.检验方法

（1）患者全血与0.109mol/L枸橼酸钠作9：1抗凝，立即进行血小板计数，然后加入等量的抗凝剂-固定剂溶液，混匀后置4℃冰箱，测定前用0.35% BSA-苔氏液将血小板调至25×109/L。

（2）取 100µl全血标本（含血小板 2.5×106）于试管中。加等量Tris-甘氨酸溶液（中和过量的戊二醛），再加入50µl单抗溶液，含125I单抗每分钟（4～5）×104脉冲计数，未标记单抗0.2µg。混匀后37℃温育30分钟，然后每次用0.35%BSA-苔氏液1ml洗涤，1 500×g离心10分钟，弃上清液，共洗涤3次。测定全血沉淀的放射性强度和总的放射性强度。

3.计算

若一分子单抗只结合血小板膜上的1个GP分子，则按下式计算。

【方法学评价】

本法为放射免疫法，灵敏度高，结果准确，且耗时相对较短。

【质量保证】

1.采血须顺利，避免血小板体外活化。

2.检测必须在24小时内完成。

【参考范围】

每个血小板GPⅠb分子数为（1.54±0.49）×104；GPⅡb/Ⅲa分子数为（5.45±1.19）×104。

（二）流式细胞术法

【检验原理】

将待检样品与荧光标记抗体共孵，然后由压缩氮经硅管送达标本室，再以5 000～10 000个细胞/秒的速率逐个射入光敏感区。在适当波长的激发光作用下，被染色的细胞发射出荧光脉冲信号，探测器收集每个细胞的荧光信号和光散射，传入计算机进行分析，并计算结果。

【检验方法学】

1.试剂与仪器

（1）试剂：

PC5-CD42b（GP Ⅰb），FITC-CD61（备解素 b3），PE-CD62P（P-选择素），4% 多聚甲醛，鞘液。

（2）仪器：

洗式细胞分析仪。

2.检验方法

（1）取 3支试管，分别加入 PC5-CD42b、FITC-CD61和PE-CD62P抗体及同型对照各3µl。

（2）取经500×g 10分钟离心后的富含血小板血浆10µl与上述单克隆抗体混匀，避光室温孵育10～20分钟。

（3）加入鞘液500µl，室温孵育10～20分钟，直接上机检测。若不能直接测定，则以4%多聚甲醛进行固定，置4℃保存。

【方法学评价】

血小板膜糖蛋白的测定对于血小板功能缺陷性疾病具有特异的诊断价值，并具有极高的灵敏度和特异性。由于使用了血小板鉴别单克隆抗体，故结果不受其他类型细胞或碎片的干扰。其次，因同时使用了FITC、PE和PC5三种荧光染色，故可同时检测2个标志物的变化。

【质量保证】

抽血必须顺利，血小板分离过程规范，以避免血小板体外活化，导致假阳性结果。

【参考范围】

CD61阳性细胞数 ＞ 90%，CD62P阳性细胞数 ＜ 5%。

【临床意义】

本检测对血小板膜功能缺陷性疾病如血小板无力症等具有重要价值。

六、血小板抗体测定

血小板抗体（platelet antibody Ig，PAIg）检测对免疫性血小板减少症的诊断具有重要意义。

（一）血小板相关免疫球蛋白的测定

【检验原理】

酶联免疫吸附试验（ELISA）。血小板表面的抗原与包被在微孔板的血小板相关抗体结合，标记辣根过氧化酶的抗人免疫球蛋白与血小板表面的免疫球蛋白结合。底物邻苯二胺在辣根过氧化酶作用下生成发色基团，显色强度与结合在血小板表面的免疫球蛋白的量成正相关。

【检验方法学】

1.试剂与仪器

（1）抗凝剂：67mmol/L EDTA-2Na。

（2）洗涤液：0.01mol/L PBS-67mmol/L EDTA-2Na，pH 6.5。

（3）缓冲液：0.01mol/L PBS-0.05% Tween-20-4% PEG，pH 7.4。

（4）包被液：0.05mol/L碳酸盐缓冲液，pH 9.6。

（5）反应液：0.02mol/L Tris-盐酸缓冲液，pH 7.4。

（6）显色液：0.1mol/L枸橼酸-枸橼酸钠液100ml，加邻苯二胺40mg和30%过氧化氢溶液12µl。

（7）辣根过氧化酶标记的抗人免疫球蛋白：IgG，IgM，IgA，PAC₃。

（8）血小板溶解液（NP-40）。

（9）终止液：2mol/L硫酸。

（10）酶标仪。

2.检验方法

（1）标本制备：

静脉采血9ml与67mmol/L EDTA-Na 1ml混合，500×g离心8分钟，取上层PRP。将PRP以1 500×g离心20分钟，弃去上层液，用洗涤液洗血小板3次，悬浮于少量缓冲液中。调整血小板至10×109/L。以l：100（v/v）NP-40（终浓度为1%）使血小板溶解。置4℃，30分钟，以1 500×g离心10分钟，取上清液供检测用，也可储存在-20℃一周内使用。

（2）包被：

用0.5mol/L碳酸盐缓冲液稀释各种抗体：IgG 5mg/L，IgA 25mg/L，PAC₃ 25mg/L，IgM 5mg/L，在微孔板中加入上述抗体，每孔各加0.01ml。加盖后置37℃3小时，取出后置4℃过夜。次日，用0.02mol/L Tris-盐酸缓冲液洗涤微孔板3次，甩干、室温晾干，密封后4℃储存。

（3）反应：

每孔加入0.1ml待测样品，37℃温育1小时，用洗涤液洗板3次。甩干后，加入0.1ml辣根过氧化酶标记的免疫球蛋白抗体（IgG、IgM、IgA、C3），37℃温育 1小时，洗板3次，加显色剂0.1ml，37℃反应20分钟，加2mol/L硫酸50µl中止反应。

（4）测定：

在酶标仪492nm处测定各孔吸光度值。

（5）标准曲线绘制：

将参考血清稀释成10个浓度段（IgG为 2～1 000ng/0.1ml；IgA、IgM 及 PAC₃ 为 0.49～250ng/0.1ml）替代待测样品，操作过程同上，作双孔测定。以参照品抗体量的对数为横坐标，相对应孔的吸光度为纵坐标，在半对数纸上绘制标准曲线。

（6）结果计算：

从标准曲线中可查到待检样本吸光度值所对应的抗体浓度，结果以ng/107血小板表示。

【方法学评价】

许多疾病如同种免疫性血小板减少性紫癜（多次输血、输血后紫癜），药物免疫性血小板减少性紫癜、恶性淋巴瘤、系统性红斑狼疮、慢性淋巴细胞性白血病、多发性骨髓瘤等血小板相关免疫球蛋白均可增高，敏感性较好，特异性较差，只能作为筛查指标。

【质量保证】

1.皮质类固醇可影响检验结果，故应停药2周后才能检测。

2.血小板计算应准确，否则将直接影响计算结果。

3.玻璃注射器和试管应硅化，或用塑料制品，以避免血小板体外活化，导致血小板聚集，从而影响血小板计数的结果。

【参考范围】

PAIgG：0～78.8ng/107血小板；PAIgA：0～2ng/107血小板；PAIgM：0～7ng/107血小板；PAC3：0～129ng/107血小板。

【临床意义】

免疫性血小板减少性紫癜、胶原性疾病及淋巴系统恶性肿瘤等疾病中，血小板相关免疫球蛋白均可增高。

（二）同种血小板抗体检测

【检验原理】

ELISA法。同种抗血小板抗体是由于不同个体间血小板抗原特异性的不同导致同种免疫而产生的。用一系列已知血小板同种抗原表型的血小板分别包板，加待测血清，再分别与酶标抗人IgG及IgM作用，根据阳性反应的血小板表型组合情况即可鉴别出该同种抗体所针对的同种抗原。

【检验方法学】

1.试剂

（1）系列参比血小板：即 PLA1/1.PLA2/2.Baka/a、Bakb/b、Yuka/a、Yukb/b、Bra/a、Brb/b、Sib a、Nak a等目前已知的血小板同种抗原纯合子（或杂合子）。

（2）酶标记的抗人IgG（或抗人IgM）。

（3）20% 氯喹溶液：20g二磷酸氯喹溶于 100ml PBS，EDTA（0.009mol/L EDTA，0.026 4mol/L Na₂HPO₄，0.14mol/L NaCl，pH 6.8～7.0）中，以 5mol/L NaOH 调 pH 至 5.0。

（4）酸性溶液：0.263mol/L 柠檬酸，0.123mol/L Na₂HPO₄，pH 3.0。

2.检验方法

（1）血小板处理及包被：

采用一系列标准血小板及患者自身血小板［在新生儿同种免疫性血小板减少症（NAIT）时包括其父母亲血小板］。常规分离洗涤血小板后，可用以下两种方法祛除血小板上的HLAⅠ类抗原，①氯喹处理法：1份血小板悬液加4份氯喹溶液，置4℃l小时；②用酸性溶液悬浮血小板，置0℃10分钟后用过剩的柠檬酸缓冲液（pH 6.5）中和。血小板经上述处理后洗涤3次，计数后分别加入酶标反应板孔中，每孔 50µl（血小板数为 106/孔），1 500×g离心 10分钟后加多聚甲醛50µl/孔（终浓度1%）固定10分钟，PBS洗涤3次后晾干干燥保存或加20%小牛血清，PBS 100µl/孔，封闭后冻存待用。

（2）ELISA检测：

取出已包被血小板的反应板，用0.05%Tween-20，PBS 洗涤 2次，加待测血清（1：50）50µl/孔，37℃温育l小时，洗涤6次，加底物溶液100µl/孔，37℃避光反应15～20分钟，用3mol/L硫酸25µl/孔终止反应，于492nm处测定吸光度值。

（3）结果判断：

每块反应板均设阴性及阳性对照孔。若检测孔吸光度值与阳性孔吸光度值之比大于1.5，则判断为阳性，再根据阳性的组合情况判断出抗体相对应的同种抗原。

【方法学评价】

本法灵敏度和特异性均较高，且耗时较短，可为临床常规使用。

【质量保证】

1.严格按照规定程序去除血小板上的HLAⅠ类抗原。

2.血小板计数要求准确，严格按照测定要求，将血小板数调节至106/孔。

【参考范围】

正常人同种血小板抗体为阴性。

【临床意义】

1.对输血后紫癜具有诊断意义。

2.确定同种抗体的抗原后，可选择该抗原阴性的供者血小板或全血进行输注而获得满意的治疗效果。

（李　健　张利伟）