第二节　血管内皮细胞检验技术

一、血管性血友病因子抗原测定

血管性血友病因子抗原（von willebrand factor antigen，vWF：Ag）测定主要用于血管性血友病的诊断与分型。

【检验原理】

免疫火箭电泳法。在含vWF：Ag的琼脂板中加入定量的受检血浆（抗原）后，在电场作用下，定量的抗原在含抗体的琼脂板上泳动。在一定的时间内出现抗原抗体反应形成的火箭样沉淀线，沉淀线的高度与抗原的浓度成正比，根据沉淀线的高度计算出血浆vWF：Ag的含量。

【检验方法学】

1.试剂与器材

1）Tris巴比妥缓冲液（pH 8.8）。

2）琼脂糖凝胶的制备：取琼脂0.9g，加Tris巴比妥缓冲液100ml，加热至沸点，待琼脂完全溶解置50～56℃水浴。

3）琼脂板的制备：取人血浆vWF：Ag抗血清16.5µl于50ml烧杯中，置50～56℃水浴。取50～56℃水浴中的琼脂糖凝胶10ml加入烧杯中（稀释600倍），充分混合后迅速倒入8cm×8cm内径的玻璃槽内。当凝胶凝固后，除去一块玻片，打孔共10～12个，孔径为2.5mm，间距约为5mm。

4）标准样品制备：用Tirs巴比妥缓冲液稀释正常混合血浆，比例为原倍、1：2、l：4、1：8、l：16，于 l、2、3、4、5 孔中各加样 10µl。

5）待检样品的制备：将患者全血用0.109mol/L枸橼酸钠作9：1抗凝，1 500×g离心10分钟，分离血浆，然后用Tris巴比妥缓冲液将样品作1：2稀释。按编号，依次加入相应的测定孔中。

2.操作方法

1）每侧电泳槽内加Tris巴比妥缓冲液1 000ml。在加抗原之前，先将打好小孔的琼脂板置于电泳槽内，孔朝阴极，火箭方向为阳极。用8cm宽的双层滤纸作桥，接通电源，用50V左右的电压，然后顺序加入标准样品和受检样品。关闭电泳槽盖，调节电压至110～115V，电流为10～14mA，电泳18小时。电泳槽温度以小于15℃为宜。

2）电泳完毕后，取出凝胶板置生理盐水中，然后再浸入1%磷钼酸溶液中（1g磷钼酸加蒸馏水100ml，过滤后使用）20～60分钟，可见火箭样沉淀线，也可用氨基黑染色保存。

3.测量和计算

1）测量：

从加样孔上缘到峰顶测量火箭峰的高度。标准品的5个读数通过回归方程得出标准曲线。

2）计算：

用上述的方法测量受检样品火箭峰高度，由标准曲线可以求得vWF：Ag的含量，结果再乘以2（稀释倍数）。

【方法学评价】

火箭电泳法虽特异性较低，但灵敏度较高，且操作步骤繁琐，不易在临床广泛使用。

【质量保证】

1.电泳时的电流、电压及电泳槽的温度、湿度要恒定。

2.每侧电泳槽内加Tris-巴比妥缓冲液液面要一致。

3.测量火箭线的高度应从加样孔上缘到火箭沉淀线顶端为准。

【参考范围】

94.1%±32.5%。

【临床意义】

1.vWF：Ag降低

主要见于遗传性血管性血友病（vWD）及其临床分型。

2.vWF：Ag增高

多见于剧烈运动后、妊娠中后期、电休克、胰岛素所致低血糖、注射生长激素后、心肌梗死、心绞痛、脑血管病变、肾小球疾病、尿毒症、肺部疾病、肝脏疾病、糖尿病、妊娠高血压综合征、大手术后、周围血管病变等。

二、血管性血友病因子瑞斯托霉素辅因子测定

血管性血友病因子瑞斯托霉素辅因子（von willebrand factor：ristocetin cofactor，vWF：Rcof）测定是诊断血管性血友病及其分型的重要指标。

【检验原理】

比浊法。在瑞斯托霉素存在的条件下，血管性血友病因子通过与血小板膜糖蛋白Ⅰb相互作用，可使正常血小板发生凝聚。在洗涤并固定的正常血小板加入瑞斯托霉素和待测样品，可以从血小板凝聚的程度来计算样品中血管性血友病因子瑞斯托霉素辅因子的活性。

【检验方法学】

1.试剂和器材

1）甲醛。

2）正常人混合血浆和待测血浆均以0.109mol/L枸橼酸钠9：1抗凝，15 000×g离心10分钟。

3）瑞斯托霉素。

4）牛血清白蛋白（BSA）。

5）血小板聚集仪。

2.操作方法

1）正常人洗涤血小板加等体积2%甲醛（用0.01mol/L TBS，0.01mol/L EDTA，pH 7.5配制），4℃放置18小时。2 500×g离心10分钟，弃去上清液，加上述TBS-EDTA缓冲液洗涤3次，调节浓度至2×108/ml。

2）待测样品0.05ml加血小板悬液0.2ml，以1 000转/min混速搅拌1～2分钟，再加10μl瑞斯托霉素（终浓度为1.25mg/ml），用血小板聚集仪测定其血小板凝聚率。

3）标准曲线的制备：正常人混合血浆用含4% BSA的上述缓冲液以1：32～1：2的比例稀释，与测定样品同样的条件分别检测其血小板凝聚率。

4）计算：以正常人混合血浆的vWF：Rcof为100%。标准曲线各点凝聚率及其对应稀释度在双对数坐标纸上绘制标准曲线，然后以待测标本凝聚率值查出对应的活性。

【方法学评价】

本法正常人血小板的固定及其浓度调节对检验结果影响较大，且操作方法繁琐费时，不适合广泛应用于临床。

【质量保证】

本检验严禁使用EDTA抗凝血，且所用器材均应涂硅或使用塑料制品。

【参考范围】

50%～150%。

【临床意义】

vWF：Rcof下降主要见于血管性血友病患者。

三、血管性血友病因子多聚体分析

本检验是血管性血友病分型的主要依据。

【检验原理】

SDS-琼脂糖凝胶电泳法，血管性血友病因子多聚体按其分子量的大小分成不同的区带，然后转移至硝酸纤维薄膜上，再与特异性抗血管性血友病因子抗体反应后以酶免疫反应显示区带，也可以放射自显影技术显示区带。

【检验方法学】

1.试剂和器材

1）琼脂糖。

2）8cm×10cm平板玻璃。

3）硝酸纤维薄膜。

4）过氧化物酶标记的抗血管性血友病因子单克隆抗体或特异性多克隆抗体。

5）4-氯 -1-萘酚。

6）BSA。

2.样品检验

1）琼脂糖以分离胶缓冲液（0.375mol/L Tris，0.1% SDS，pH8.8）配至适当浓度（低于1.5%为低分辨胶，高于2%为高分辨胶）。沸水浴后取10ml倾倒至水平放置的玻璃板上，凝固后切去10cm×2cm的一条凝胶。

2）另取琼脂糖以浓缩胶缓冲液（0.125mol/L Tris，0.1%SDS，pH 6.3）配至0.8%，沸水浴后取2.5ml在分离胶切除后留下的位置处浇注。冷却后在距两胶分界线0.5cm处开样品槽（6mm×2mm），或在浇注浓缩胶前，先加样品梳。

3）待测样品（患者全血与0.109mol/L枸橼酸钠作9：1抗凝，1 500×g离心10分钟），以样品缓冲液（0.01mol/L Tris，8mol/L 尿素，2% SDS，0.005% 溴酚蓝，pH 8.0）1：5稀释后加样，每孔 20µl。在电泳缓冲液（0.05mol/L Tris，0.384mol/L 甘氨酸，0.1% SDS，pH 8.5）中10℃15mA电泳至蓝色染料泳动至胶边缘时停止电泳。

4）取下凝胶，在转移电泳缓冲液（0.025mol/L Tris，0.129mol/L甘氨酸，20%甲醇，0.0l% SDS，pH 8.3）中浸泡10分钟后，与硝酸纤维薄膜一起装入专用夹具，凝胶置负极，薄膜置正极，以30V 180mA电泳16小时。

5）停止电泳后取下硝酸纤维薄膜，浸入0.5% BSA-TBS中，置室温2小时，然后再浸入酶标记抗血管性血友病因子抗体溶液中，37℃温育2小时。洗涤后浸入底物溶液（4-氯-l-萘酚用甲醇配成3mg/ml，再加5倍体积的TBS和0.01%过氧化氢）显色。

3.结果判断

正常人及Ⅰ型血管性血友病患者多聚体结构为相对分子质量从大至小的序列，可多至15～17条区带；但是，Ⅱ型血管性血友病患者的血管性血友病因子大分子多聚体缺失，而小分子部分正常或增多；Ⅲ型即重型患者的则一般无区带显示。

【方法学评价】

本法是一种酶标自显影的SDS-琼脂糖电泳技术，对试剂配制及电泳技术要求颇高，且繁琐耗时，不适合在临床广泛使用。

【质量保证】

分离胶、浓缩胶及样品缓冲液、电泳缓冲液浓度须精准，电泳时的电压、电流及电泳时间应控制准确。

【参考范围】

见结果判断。

【临床意义】

除根据有无大相对分子质量多聚体可鉴别Ⅰ型和Ⅱ型血管性血友病外，用高分辨技术尚可在Ⅱ型血管性血友病中区分亚型。

四、瑞斯托霉素诱导的血小板凝集试验

瑞斯托霉素诱导的血小板凝集试验（ristocetin induced platelet aggregation，RIPA）是血管性血友病的诊断指标之一。

【检验原理】

比浊法。在特定的搅拌条件下，当于富含血小板血浆中加入诱导剂后，由于血小板发生聚集，悬液的浊度就会发生相应的变化，光电池将光浊度的变化转换为电讯号的变化，在记录仪或电脑专用软件上予以记录，根据描记曲线可以计算血小板聚集程度及速度。

【检验方法学】

1.样品的采集与制备

将患者全血与0.109mol/L枸橼酸钠9：1抗凝，500×g离心5分钟，制备富含血小板血浆，剩余血液1 500×g离心10分钟，制备乏血小板血浆。

2.试剂和仪器

1）试剂：

将瑞斯托霉素稀释至125mg/ml，切忌颠倒混匀和摇晃试剂瓶。

2）仪器：

血小板聚集仪。

3.样品检验

取500µl乏血小板血浆用以校正0点，另取500µl富含血小板血浆，并加入上述瑞斯托霉素溶液4µl，使成终浓度1mg/ml，记录血小板聚集的百分率。

【方法学评价】

本法是血小板功能检查的标准方法，被广泛用于抗血小板药物的研究，方法学比较和临床治疗的监测，同时，本法因分析前影响因素较多，造成了检测结果的不准确性，且重复性也较差。

【质量保证】

1.采血要顺利，避免反复穿刺而将组织液混入血液，不宜使用乙二胺四乙酸和肝素作抗凝剂。

2.待检样品混入红细胞或溶血、脂血等可降低透光度，从而掩盖血小板聚集的变化。

3.当红细胞比容大于55%时，由于枸橼酸钠浓度在血浆中比例增高，可导致聚集率降低，而在贫血患者，则应相应增加抗凝剂的比率。

4.待检血浆血小板数少于100×109/L时，聚集反应降低。采血后应在4小时内完成检测。

5.检测前应停用影响血小板功能的药物，如阿司匹林、双嘧达莫、肝素等，尤其阿司匹林抑制的作用可持续1周。

【参考范围】

1.2µg/ml（59.33±20.37）%。

【临床意义】

瑞斯托霉素诱导的血小板凝集试验降低主要见于血管性血友病患者。

五、凝血酶调节蛋白测定

凝血酶调节蛋白（thrombomodulin，TM）测定，本检测是反映血管内皮细胞损伤的有效手段。

（一）抗原测定（TM：AG）

【检验原理】

放射免疫法。以抗人TM单克隆抗体包被聚苯乙烯放射免疫法小杯，样品中的TM结合于包被的放射免疫法小杯上，加入125I-抗人TM单克隆抗体，根据结合的125I的放射性强度计算出TM的浓度。

【检验方法学】

1.试剂

（1）抗人TM的单克隆（或多克隆）抗体包被液：

将抗人凝血酶调节蛋白单抗用0.1mol/L碳酸盐缓冲液（pH 9.5）稀释至10µg/ml。

（2）缓冲液 A：

0.05mol/L Tris-HCl，0.15mol/L NaCl，2.5mmol/L CaCl₂，肝素 20U/ml，pH 7.4。

（3）缓冲液 B：

0.05mol/L Tris-HCl，0.15mol/L NaCl，2.5mmol/L CaCl₂，5mg/ml BSA，pH 7.4。

（4）人TM标准液：

取人TM标准品，用缓冲液A稀释至500ng/ml。

（5）125I标记的抗人TM单抗：

取125I标记的抗人TM单抗，用缓冲液B稀释至终浓度105cpm/0.2ml。

（6）洗涤液 A：

0.05mol/L Tris-HCl，0.15mol/L NaCl，2.5mmol/L CaCl₂，pH 7.4。

（7）洗涤液B：

洗涤液A含0.05% tween-20。

2.样品检验

（1）样品采集：将患者全血与 2% EDTA·Na₂作9：1抗凝，1 500×g离心10分钟，分离血浆。血管内皮细胞样品，收集细胞培养上清液或红细胞溶解物上清液。尿液检测取24小时尿或早晨第1次尿液。

（2）将200µl抗人TM包被液加入聚苯乙烯放射免疫法小杯，4℃过夜，用洗涤液A洗3次。将待测样品（或标准液）0.25ml与等量缓冲液A混合，每小杯加入200µl稀释样品液（空白管加入 200µl缓冲液 A），37℃水浴 2小时，用洗涤液A洗3次，加入200µl 125I标记的抗人TM单抗，37℃水浴2小时，再用洗涤液B洗6次，γ计数仪测定放射性强度。

3.计算

（1）以正常人混合血浆（或尿液）TM含量为100%，计算待测样品TM抗原的百分率。

（2）标准品的制备：用缓冲液A作倍比稀释，浓度分别为500ng/ml、250ng/ml、125ng/ml、62.5ng/ml、31.25ng/ml、15.6ng/ml、7.8ng/ml、3.9ng/ml和0ng/ml，然后用上述方法检测，以人TM浓度为横坐标，以每分钟的放射性脉冲计数为纵坐标绘制标准曲线，或计算出直线回归方程。

【方法学评价】

本法是TM检测的经典方法，具有灵敏度高，结果准确等优点，但方法学繁琐，耗时较长。

【质量保证】

1.如样品当天暂不测定，应在采样后将血浆立即放-20℃冰箱保存，检测前将冷冻标本放37℃复溶，切忌在室温中复溶，否则会导致TM沉淀。

2.24小时尿液标本宜加0.02%叠氮钠防腐。

3.如样本中TM含量超过标准，则酌情稀释后复测。

【参考范围】

20～35ng/ml。

【临床意义】

TM增高多见于糖尿病、系统性红斑狼疮、DIC、血栓性血小板减少性紫癜。此外，急性心肌梗死、脑血栓、肺栓塞和闭塞性脉管炎患者也可增高。

（二）活性测定（TM：A）

【检验原理】

发色底物法。在体外凝血酶激活蛋白C（APC）的速度十分缓慢，加入TM后，凝血酶激活蛋白C的速率增加1 000～20 000倍。在一定范围内活化的蛋白C生成量与TM：A成正比。活化的蛋白C分解发色底物S2366，释放出的pNA呈黄色，根据405nm的吸光度值可计算出TM：A。

【检验方法学】

1.试剂

（1）平衡缓冲液：20mmol/L Tris-HCl，0.15mol/L NaCl，1mmol/L苯甲醚，0.2% NP-40，pH 7.4。

（2）洗脱液：20mmol/L Tris-HCI，2mol/L NaSCN，0.2% NP-40，pH 7.4。

（3）缓冲液 A：50mmol/L Tris-HCl，0.1mol/L NaCl，3mmol/L CaCl₂，0.1% BSA，pH 7.5。

（4）缓冲液 B：50mmol/L Tris-HCl，0.1mol/L NaCl，0.1% BSA，pH 8.0。

（5）抗 TM IgG-Sepharose 4B 0.5ml/柱。

（6）牛凝血酶（10U/ml）。

（7）水蛭素（100U/ml）。

（8）蛋白 C（0.5mg/ml）。

（9）发色底物 S2366（Glu-Pro-Arg-pNA）：1g/ml溶于缓冲液B中。

2.样品检验

（1）免疫亲和层析浓缩样品：

由于TM在人血浆中含量甚微，先用免疫亲和层析浓缩样品。取血浆（或尿液）3ml加300ml平衡缓冲液于4℃透析4小时，透析后样品过抗人TM IgG-Sepharose 4B柱，上样速度为每小时3ml。上样后用15ml平衡液洗涤，再用洗脱液将TM从柱中洗脱，收集TM洗脱峰0.5ml，加200倍体积的平衡液透析12小时，再加缓冲液A透析4小时。

（2）活性测定：

测定管中加入透析过的TM样品200µl，牛凝血酶 20µl，蛋白 C 20µl。空白管除不加样品，加入 200µl缓冲液A外，其余均同测定管。测定和空白管置37℃水浴30分钟，加入水蛭素20µl混匀，37℃水浴15分钟，加入S2366溶液100µl，37℃水浴30分钟，以空白管校0点，测定405nm处待测样品的光密度值。

3.计算

（1）以正常人混合血浆（或尿液）TM活性为100%，计算待测样品TM：A百分率。

（2）用标准蛋白C制备标准曲线（参见蛋白C活性测定），从标准曲线查出生成活化的蛋白C的量。1个TM：A单位定义为每毫升反应液每分钟产生1nmol/L活化的蛋白C，结果乘以稀释倍数即得样品TM活性单位。

【方法学评价】

本法是TM：A检测的经典方法，但操作繁琐，且检测耗时长，不适宜在临床广泛使用。

【质量保证】

1.测定标本宜新鲜，如低温（-20℃）保存应加1mmol/L苯甲醚。

2.如测定标本活性较低，可适当延长发色底物S2366反应时间。

3.牛凝血酶与人TM和蛋白C的反应速率大于人凝血酶，故以牛凝血酶为宜。

【参考范围】

97%±35%

【临床意义】

同TM：A抗原测定。

（李　健　张利伟）