第六章　出血和血栓性疾病的检验技术

第一节　筛选试验检验技术

一、凝血酶原时间测定

凝血酶原时间（prothrombin time，PT）测定是外源凝血系统常用的筛选试验之一，它可反映凝血因子Ⅱ、Ⅴ、Ⅶ、Ⅹ及Ⅰ的活性。

【检验原理】

凝固法：于受检血浆中加入过量的组织凝血活酶和Ca2+，使凝血酶原转变为凝血酶，后者使纤维蛋白原转变为纤维蛋白并使受检血浆凝固，血浆凝固所需的时间即为凝血酶原时间。

【检验方法学】

1.试剂

1）人脑或兔脑浸出液；

2）0.025mol/L CaCl₂。

2.样品采集与制备

于硅化或塑料试管内加入0.109mol/L枸橼酸钠溶液0.2ml，然后加入受检全血1.8ml（1：9抗凝）充分混匀，1 500×g离心10分钟，以此制备乏血小板血浆。

3.样品检验

取玻璃小试管1支，加入血浆和组织凝血活酶试剂各0.1ml，37℃温育30秒，加入0.025mol/L氯化钠溶液0.1ml，立即启动秒表，不断轻轻倾斜试管，记录液体停止流动所需的时间，重复上述步骤2次，取2次结果的平均值，并以正常参比血浆（20份正常人混合血浆）作为对照。

【方法学评价】

1.未按离心要求导致受检血浆中血小板增多使凝血酶原时间假性缩短。

2.样品溶血，因红细胞中含有促凝成分，可使凝血酶原时间假性缩短；脂血可导致结果观察困难，故也影响检验结果的准确性。

【质量保证】

1.正常对照

因每次使用的组织凝血活酶（兔脑、人脑、胎盘、肺组织等的浸出液）的活性不尽相同，且每次检验的条件也各异，故每天均需作正常对照。

2.检验温度

水浴温度应恒定在36～38℃，温度过高或过低均可使凝血酶原时间延长。

3.检验周期

应在采血后4小时内完成检测，否则可使凝血酶原时间假性延长。

4.调整抗凝剂比例

当红细胞比容小于20%或大于50%时，抗凝剂与血液的比例应按下式调整：抗凝剂量（ml）=（100-HCT）×采血量（ml）×0.001 85。

【参考范围】

男性：11～13.7秒；女性：11～14.3秒。受检者的测定值较正常对照值延长超过3秒才有临床病理意义。

【临床意义】

1.PT延长

先天性见于凝血因子Ⅱ、Ⅴ、Ⅶ、Ⅹ缺乏和低（无）纤维蛋白原血症；获得性见于弥散性血管内凝血、维生素K缺乏症、肝脏疾病；血液循环中有抗凝物质，如肝素、FDP，以及循环中存在凝血因子Ⅱ、Ⅴ、Ⅶ、Ⅹ抑制物等。

2.PT缩短

多见于因子Ⅴ增多症、口服避孕药、高凝状态和血栓栓塞性疾病等。

二、活化部分凝血活酶时间测定

活化部分凝血活酶时间（activated partial thromboplastin time，APTT）测定是内源性凝血系统常用的筛选试验之一，它可反映凝血因子Ⅷ、Ⅸ、Ⅺ、Ⅻ及Ⅴ、Ⅹ的活性。

【检验原理】

凝固法：在37℃条件下，以白陶土、硅化土或鞣花酸为激活剂，活化凝血因子Ⅻ和Ⅺ，以脑磷脂（部分凝血活酶）代替血小板提供凝血的催化表面，在钙离子的参与下，观察乏血小板血浆凝固所需的时间。

【检验方法】

1.试剂

1）4%白陶土-脑磷脂混悬液。

2）0.025mol/L CaCl₂。

2.样品采集

受检全血与0.1mol/L草酸钠溶液或0.109mol/L枸橼酸钠溶液作1：9抗凝，充分混匀，1 500×g离心10分钟，以此制备乏血小板血浆。

3.样品检验

取玻璃小试管1支，加入受检血浆、白陶土-脑磷脂混悬液各0.1ml，充分混匀，置37℃水浴3分钟，其间轻轻摇动数次。加入0.025mol/L氯化钙溶液0.1ml，立即启动秒表，将受检样品在37℃水浴中不断轻轻摇动，约30秒时取出，记录受检样品出现纤维蛋白丝的时间，重复上述检测，取平均值。

【方法学评价】

离心时间及特殊的样品类型均会对检测构成影响（详见凝血酶原时间测定。）

【质量保证】

1.正常对照

为保证白陶土（对凝血因子缺乏较为敏感）、硅化土（对狼疮抗凝物较为敏感）或鞣化酸（对肝素较为敏感）的质量，每天应以正常人混合血浆做正常对照。

2.检验温度

水浴温度应恒定在36～38℃，受检血浆温浴时间不得短于3分钟。

3.检验周期

应在采血后4小时内完成检测，否则可使结果假性延长。

4.调整抗凝剂比例

同凝血酶原时间测定。

【参考范围】

男性：（37±3.3）秒；女性：（37.5±2.8）秒。受检者的测定值较正常对照延长超过10秒才有病理意义。

【临床意义】

1.APTT延长

主要见于凝血因子Ⅷ、Ⅸ、Ⅺ、Ⅻ、激肽释放酶原（PK）和高分子量激肽原（HMWK）缺乏症，也可见于凝血因子Ⅴ、Ⅹ、Ⅱ和纤维蛋白原缺乏症及血液循环中存在抗凝物质等。

2.APTT缩短

多见于弥散性血管内凝血（DIC）高凝期、血栓性疾病及血小板增多症等。

三、凝血酶时间测定

凝血酶时间（thrombin time，TT）测定主要用于纤溶治疗的监测；过筛检测纤维蛋白原缺陷、循环中有肝素、类肝素的存在等。

【检验原理】

凝血酶法：在血浆中加入标准化的凝血酶溶液后，使纤维蛋白原转变为纤维蛋白，血浆凝固所需的时间即为凝血酶时间。

【检验方法学】

1.试剂

凝血酶溶液用生理盐水调节至使正常血浆的凝固时间在16～18秒为宜。

2.样品采集

受检全血与0.109mol/L枸橼酸钠溶液或0.1mol/L草酸钠溶液作9：1抗凝，充分混匀，1 500×g离心10分钟，以此制备乏血小板血浆。

3.样品检验

取玻璃小试管1支，加入受检血浆0.1ml，置37℃水浴中，再加入凝血酶溶液0.1ml，立即启动秒表，轻轻摇动试管，记录血浆凝固时间，重复上述检测，取平均值。

【方法学评价】

离心时间及特殊的样品类型均会对检测构成影响（详见凝血酶原时间测定。）

【质量保证】

1.正常对照

每次使用的凝血酶试剂的活性不尽相同，故应以正常人混合血浆作正常对照。

2.检验温度

水浴温度应恒定在36～38℃，温度过高或过低均可使凝血酶时间延长。

3.检验周期

应在采血后4小时内完成检测，否则可使凝血酶时间假性延长。

【参考范围】

16～18秒。

【临床意义】

TT延长指超过正常对照3秒，主要见于肝素或类肝素物质增多，系统性红斑狼疮、肝脏疾病、肾脏疾病、低（无）纤维蛋白原血症、异常纤维蛋白原血症及F（g）DP增多如DIC、原发性纤溶等。

四、D-二聚体测定

D-二聚体（D-dimer，DD）是交联纤维蛋白降解产物之一，为继发性纤溶特有代谢产物。本检测主要反映患者的继发性纤溶状态。

（一）定性试验

【检验原理】

乳胶凝集法。D-二聚体乳胶试剂是一种聚苯乙酰乳胶颗粒，它包被有高特异性的D-二聚体抗体，当血浆中D-二聚体与乳胶试剂混合，可使包被的乳胶颗粒凝聚，凝聚程度与血浆中的D-二聚体含量呈正相关。

【检验方法学】

1.试剂

1）包被D-D抗体的乳胶颗粒。

2）磷酸盐缓冲液，pH 7.35。

2.样品采集与制备

受检全血与0.109mol/L枸橼酸钠溶液作9：1抗凝，充分混匀，1 500×g离心10分钟，以此制备乏血小板血浆。

3.样品检验

取D-二聚体乳胶试剂25µl置瓷板或玻璃板上，加受检血浆10µl，立即用塑料棒（直径不超过1.0cm）搅匀，持板晃动3分钟，于黑色背景下观察有无凝聚出现。同时按上法用缓冲液作阴性对照。乳胶颗粒较阴性对照明显粗大者为阳性。

【方法学评价】

1.离心时间及特殊的样品类型会对检测构成影响（详见凝血酶原时间测定）。

2.受检血浆中存在肝素及类风湿因子可干扰本检验，导致假阴性结果出现。

【质量保证】

1.为确保D-二聚体乳胶试剂的质量，每次检测均应做阴、阳性对照。

2.应在采血后4小时内完成检测，否则可出现假阴性。

【参考范围】

正常人为阴性。

【临床意义】

D-二聚体升高多见于深静脉血栓形成，弥散性血管内凝血、心肌梗死、恶性肿瘤、外科手术、创伤、妊娠、肝脏疾病及肺栓塞等；陈旧性血栓患者D-二聚体并不升高。

（二）定量试验

【检验原理】

双抗体夹心法。将一种单抗包被于聚苯乙烯塑料板上，用另一种单抗标记辣根过氧化物酶，加入待检样品后测定孔内形成特异性的抗体-抗原-抗体复合物，可使底物显色，生色深浅与样品中心的D-二聚体含量成正比。

【检验方法学】

1.试剂和仪器

1）已包被抗体的酶标板。

2）酶标抗体。

3）酶标抗体反应助剂。

4）样品稀释液。

5）D-二聚体标准品。

6）洗涤液。

7）底物：邻苯二胺。

8）底物缓冲液。

9）30% H₂O₂。

10）终止液：3mol/L硫酸。

11）酶标仪

2.样品的采集与制备

受检全血与0.109mol/L枸橼酸钠溶液作9：1抗凝，充分混匀，1 500×g离心10分钟，以此制备乏血小板血浆。

3.标准曲线的绘制

1）用样品稀释液0.5ml将标准品复溶。将已包被有抗体的酶标板揭去封口膜后倾去保护液，并用洗涤液洗涤1次，拍干。

2）在酶标板的右侧两排孔11A～H、12A～H中，11A、12A、11B、12B 加标准品各 100µl。用样品稀释液（各孔 100µl）从11B、12B开始按倍比稀释法进行连续稀释（每一稀释度都是双孔）至 11H、12H，每孔最终体积为 100µl，37℃温育 1.5小时。

3）甩去孔内液体，用洗涤液洗4次，拍干。加酶标记D-二聚体单抗，每孔100µl，37℃温育30分钟。

4）甩去孔内酶标抗体，用洗涤液洗4次，拍干。加底物，每孔 100µl，37℃温育 15 分钟。

5）每孔加终止液50µl，于495nm波长读取吸光度值，空白对照孔调0。

6）在半对数坐标纸上，以D-二聚体含量为纵坐标，吸光度值为横坐标，绘制标准曲线。

4.样品检验

1）检测孔中每孔加90µl样品稀释液、10µl待测样品，加毕轻轻振荡酶标板，使之混匀，37℃温育1.5小时。

2）余同标准曲线绘制步骤“3）～5）”。

3）用样品孔双孔吸光度的平均值，查曲线得D-二聚体含量，乘稀释倍数获最初含量。

【方法学评价】

酶标免疫吸附试验是检测D-二聚体含量的经典方法，具有灵敏度高，特异性好的特点，但因方法学繁琐，检验周期长，故不适合急诊检验。

【质量保证】

1.第一份样品与最后一份样品的加样时间相隔不宜超过15分钟，包括标准曲线在内不超过20分钟。

2.加标准品和待测样品温育1.5小时后，第一次洗涤时，切勿使洗涤液溢出，以免孔与孔之间交叉污染而影响定量的准确性。

3.血浆样品常温下保存8小时，4℃下4天，-20℃以下1个月，临用前37℃复溶。

4.操作过程中尽量少接触酶标板的底部，以免影响板的光洁度而给检测带来误差。读数前用纸轻轻擦去底部水迹。

5.如D-二聚体含量超过标准品上限值，则将样品作适当稀释后再检测，结果则需再乘稀释倍数。

【参考范围】

0～0.25mg/L。

【临床意义】

同D-二聚体定性试验。

五、纤维蛋白（原）降解产物测定

纤维蛋白降解产物（fibrin degradation product，FDP）是反映原发性和继发性纤溶的重要指标。

【检验原理】

乳胶凝集法。用抗纤维蛋白（原）降解产物抗体包被的乳胶颗粒与待检血浆混合，阳性者出现肉眼可见的凝集物。

【检验方法学】

1.试剂及器材

1）鼠抗人FDP单抗包被的乳胶颗粒悬浮液。

2）甘氨酸缓冲液。

3）FDP阳性、阴性对照溶液。

4）专用纸片反应板。

5）混匀用塑料小棒。

2.检验方法

1）样品稀释：

待检样品需先作两个稀释度：①1：2：血浆 50µl加甘氨酸缓冲液 50µl。② 1：8 ：血浆 50µl加甘氨酸缓冲液 350µl。

2）加待检样品：

每个稀释度各取20µl，加于纸片板的相邻环形圈内。

3）加对照品：

各取20µl阴、阳性对照品于各自环形圈内。

4）加单克隆抗体：

每个环形圈内各加20µl单抗抗体。

5）混匀：

每个环形圈各取一根混匀搅拌棒将两液混合，然后轻轻地旋转纸片板3分钟。

3.观察结果

待测样本与阴、阳性对照比较，若2个稀释度均与阴性对照一样不产生凝集，则纤维蛋白（原）降解产物小于5mg/L；若1：2出现凝集而l：8不凝集，则5～20mg/L之间；若2个稀释度均出现凝集，则大于20mg/L。

【方法学评价】

本法的纤维蛋白（原）降解产物检测的阈值为2.5mg/L，超过1：8阳性时，则其浓度大于2.5mg/L×8（稀释倍数）；类风湿因子强阳性时可出现假阳性结果。

【质量保证】

1.试剂

试剂应储存于2～8℃，用前取出置于室温5分钟方可使用；使用包被抗体的乳胶悬液前须充分混匀。

2.样品保存

待检血浆室温保存8小时，2～8℃24小时，-20℃ 1个月。

【参考范围】

＜ 5mg/L。

【临床意义】

FDP增高见于原发性纤溶亢进，也可见于高凝状态、弥散性血管内凝血、肺栓塞、器官移植后的排斥反应、妊娠高血压综合征、恶性肿瘤、心、肝、肾疾病及静脉血栓、溶栓治疗等所致的继发性纤溶亢进。

六、出血时间测定

出血时间测定（bleeding time，BT），本检测反映皮肤与毛细管的相互作用，包括血小板黏附、血小板活化和释放以及血小板聚集等。

【检验原理】

模板刀片法或出血时间测定器法：在上臂加压的条件下，用标准化的出血时间测定器（刀片的长度、宽度及刺入皮肤的深度恒定）在肘部皮肤制造一个标准化的伤口，测定伤口血液自然停止所需要的时间。

【检验方法学】

1.器材

1）血压计。

2）出血时间测定器：双刀片弹簧装置，刀片长6mm，刺入皮肤深约为1mm。

3）洁净滤纸。

4）秒表。

2.操作方法

1）血压计袖带缚于上臂，加压维持在成人5.3kPa（40mmHg），儿童 2.6kPa（20mmHg）处。

2）在肘前窝凹下两横指处作常规消毒，轻轻绷紧皮肤，将出血时间器置于皮肤表面，按其按钮，使刀片刺入皮肤，启动秒表。

3）每隔0.5分钟用洁净滤纸吸取流出的血液，直至出血自然停止，记录出血终止时间。

【方法学评价】

DuKe法不适合作为术前凝血功能筛查的手段，已被废弃；出血时间测定器法因刺入皮肤的长度和深度均固定，能较客观地反映真实情况，故现已被推荐使用。

【质量保证】

1.患者在检测前应休息10分钟，血压计的压力必须维持在要求的水平。

2.刀片的长度与前臂应平行，这样符合前臂神经和血管的解剖。

【参考范围】

（6.9±2.1）分钟。

【临床意义】

1.BT延长

见于血小板数量异常，如血小板减少症和血小板增多症，以及血小板功能异常，如先天性和获得性血小板病和血小板无力症；某些凝血因子缺乏，如血管性血友病（vWD）、低（无）纤维蛋白原血症和DIC等；还可见于血管疾病，如遗传性出血性毛细血管扩张症等。

2.BT缩短

见于某些严重的高凝状态和血栓性疾病时，但不敏感。

七、血小板计数

见血液一般检验技术。

（李　健　张利伟）