第四节　红细胞酶病检验技术

成熟红细胞没有细胞核，也没有线粒体和核糖体等细胞器。葡萄糖作为红细胞的主要能量来源，通过两种途径代谢：糖酵解途径（EMP）和磷酸戊糖旁路（HMP）。其需要多种酶参与，当红细胞代谢的某种酶由于基因缺陷导致酶活性或酶性质改变，引起以溶血性贫血为主要临床表现的一组遗传性疾病（表5-7），称为红细胞酶病（red cell enzymopathies）或红细胞酶缺乏症（red cell enzymes deficiency）。在所有20多种红细胞代谢酶中，引起红细胞酶病发病率最高的是由于葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（G6PD）、丙酮酸激酶（PK）缺乏。

一、高铁血红蛋白还原试验

葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（glucose-6-phosphate dehydrogenase，G6PD）是红细胞糖代谢磷酸戊糖旁路途径的一个关键酶和限速酶，能催化6-磷酸葡萄糖（G6P）生成6-磷酸葡萄糖酸（6-PGA），同时生成还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）。NADPH不仅是体内多种物质合成的供氢体，也可维持谷胱甘肽的还原状态，保护红细胞免受氧化性损伤，起保护红细胞的作用。红细胞葡萄糖6磷酸脱氢酶缺乏症（glucose-6-phosphate dehydrogenase deficiency，G6PD） 是 指G6PD活性降低或性质改变导致以溶血为主要表现的疾病，是遗传性红细胞酶缺陷病中最为常见的一种。临床可表现为先天性非球形红细胞性溶血性贫血、蚕豆病、药物性溶血、感染诱发溶血及新生儿黄疸等。本病是一种X连锁不完全显性遗传性疾病，全球累计4亿多患者，在我国主要分布在广东、广西、海南、四川、云南和贵州等地。

G6PD缺乏症的实验室检测方法包括酶学方法和基因突变检测方法。G6PD酶活性检测是临床最基本也是最常用的筛查和诊断方法，可应用于新生儿早期诊断、人群G6PD缺乏症患者的筛查、急性溶血患者病因诊断等。常用的酶活性检测方法有高铁血红蛋白还原试验（methemoglobin reduction test）、G6PD荧光斑点试验、G6PD酶活性测定等。

1.检验原理

血液中加入亚硝酸钠使红细胞中的亚铁血红蛋白变成高铁血红蛋白（MHb），正常红细胞的G6PD催化磷酸戊糖旁路使辅酶Ⅱ（NADP+）转变为NADPH，在递氢体亚甲基蓝的参与下，MHb（Fe3+，褐色）还原成亚铁血红蛋白（Fe2+，红色）。当G6PD缺乏时，MHb还原速度减慢甚至不还原，仍保持褐色。MHb在波长635nm处有吸收峰，可用分光光度计进行比色测定。因而本试验是通过测定MHb的还原速度来间接反映G6PD活性。

2.检验方法学

（1）器材和试剂

1）器材：

水浴箱或孵箱、分光光度计。

2）试剂：

①0.18mol/L亚硝酸钠和0.28mol/L葡萄糖混合溶液：亚硝酸钠1.25g，葡萄糖5g，蒸馏水加至100ml，存储于棕色瓶中，2～8℃冰箱中保存，可使用1个月。②0.4mmol/L亚甲基蓝溶液：15mg亚甲基蓝（含3个结晶水）加少量蒸馏水研磨后用蒸馏水溶至100ml。③0.02mol/L磷酸盐缓冲液（pH 7.4）：磷酸氢二钠229.5mg，磷酸二氢钾52.2mg，加蒸馏水溶至 100ml。

（2）操作

1）取1：9枸橼酸钠抗凝血2ml，加入20mg葡萄糖，混匀后以相对离心力（RCF）125×g离心5分钟。弃去部分血浆，调整血细胞与血浆比例1：1后再混匀。

2）取调整比例后的抗凝血1ml，加亚硝酸钠葡萄糖溶液和亚甲基蓝溶液各0.05ml，颠倒混合15次，使与氧气充分接触，加塞后放37℃水浴或孵箱中3小时。

3）孵育后混匀，取血0.1ml，加pH 7.4磷酸盐缓冲液10ml，混匀放置2分钟。以磷酸盐缓冲液调零，用分光光度计在635nm处测定吸光度值，记录为SA。

4）同时将未加亚硝酸钠葡萄糖溶液和亚甲基蓝溶液的抗凝血标本同样放37℃ 3小时，取孵育后标本0.1ml，加入pH 7.4磷酸盐缓冲液10ml，混匀放置2分钟，用分光光度计测定吸光度值，记录为B。再加入亚硝酸钠葡萄糖混合液1滴，混匀5分钟后测定吸光度值，记录为ST（高铁血红蛋白对照）。

5）计算如下：

3.方法学评价

本试验是国内应用较多的方法，简便易行，但操作时间长（3～4小时），试验的敏感性和特异性均不高，G6PD酶缺乏红细胞必须达到30%～40%时才能被检出。因此，仅作为G6PD缺乏的过筛试验。

4.质量保证

（1）分析前

1）标本不应有凝血或溶血。抗凝剂应选用枸橼酸钠或ACD液，标本可保存1周左右。抗凝剂比例应适当，如ACD过量，pH降低可使高铁血红蛋白还原速度减慢，出现假阳性结果。

2）标本有不稳定血红蛋白、HbH、高脂血症、巨球蛋白血症时可出现假阳性结果，可离心取上清液比色以减小影响。

3）脐带血标本也可进行检测，由于脐带血中含有较多的年轻红细胞，因而脐带血高铁血红蛋白还原率比静脉血高。

（2）分析中

1）测定吸光度时分光光度计的波长应准确，一般ST应大于B的8倍以上。

2）贫血患者应将红细胞比容调整到0.35～0.40，比积低于0.30时，高铁血红蛋白还原率显著降低。

3）细菌污染可产生亚硝酸盐而造成假阳性，试管等器材应无菌。

4）吸取孵育后血标本应注意充分混匀，避免出现大于100%的实验结果。

（3）分析后：

与临床沟通，核实实验结果与临床诊断的符合率，特别是高铁血红蛋白还原率低于75%的结果，应详细询问临床症状和家族史，以提高临床诊断性能。

5.参考区间

G6PD正常者外周血高铁血红蛋白还原率 ≥ 75%（脐带血 ≥ 77%）。

6.临床意义

G6PD杂合子中等缺乏者高铁血红蛋白还原率在31%～74%（脐带血41%～76%）之间。G6PD纯合子或半合子严重缺乏者高铁血红蛋白还原率 ＜ 30%（脐带血 ＜ 40%）。

二、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶荧光斑点试验

1.检验原理

在G6P和NADP+存在条件下，G6PD使NADP+还原成NADPH，后者在长波紫外光（260～365nm）下可发出荧光，G6PD活性越强，荧光越强。

2.检验方法学

（1）器材和试剂

1）器材：

水浴箱、长波紫外线灯等。

2）试剂：

①0.01mol/L G6P溶液（3.05mg G6P钠盐溶于1ml蒸馏水），7.5mmol/L NADP+溶液（NADP+ 6mg溶于 1ml蒸馏水），0.25mol/L 磷酸盐缓冲液（pH 7.4），1% 皂素，蒸馏水。②反应液：G6P液1份、NADP+液1份、磷酸盐缓冲液3份、皂素2份、蒸馏水3份混匀后，-20℃可保存2年，-4℃可保存数月。

（2）操作

1）取肝素、ACD或EDTA抗凝全血，或肝素化毛细管末梢手指血或足跟血10μl加入100μl的反应液中，充分混匀，取1滴滴于滤纸上（第一斑点）。

2）将上述混合液置于37℃水浴10分钟，再取1滴滴于滤纸上（第二斑点）。

3）晾干后在暗室内，于长波紫外线灯下（340nm）观察结果，检查有无荧光产生。

3.方法学评价

G6PD荧光斑点试验是国际血液学标准化委员会（ICSH）推荐用于筛查G6PD缺乏的方法，适用于农村偏远地区和大规模人群筛选。该方法操作简单，取血少，直接测定NADPH的量，特异性较好，但需长波紫外光灯，对试剂要求较高，判断结果受主观因素影响较大。荧光斑点法对G6PD活性正常或者重度缺乏者能100%检出，即对于半合子男性和纯合子女性，检测可靠，但对于女性杂合子的检出则不稳定，敏感性只有32%，特异性为99%，因此会遗漏相当大比例的酶活性部分缺乏患者的女性杂合子。且标本保存不当易使荧光信号减弱或无荧光，造成假阳性结果。

4.质量保证

（1）分析前：

ACD、肝素或EDTA抗凝血样本在2～8℃保存时，可保持G6PD酶活性稳定1周。

（2）分析中

1）每次试验应用G6PD正常标本和异常标本做阴阳性对照，第1点可用作自身阳性对照（无荧光或弱荧光出现）。

2）血红蛋白对荧光有淬灭作用，HCT ＞ 0.50时应取标本的半量检测，HCT ＜ 0.20时取标本的两倍量做检测（如贫血严重者取血量需相应加大，或用1份比容红细胞加7份生理盐水的混悬液试验）。

3）为提高检测敏感性，可在反应液中加入1份8mmol/L氧化型谷胱甘肽（GSSG）。因在杂合子病例的标本中残余有G6PD，反应后可产生少量NADPH，GSSG存在时可将其再氧化为 NADP+。

（3）分析后：

与临床沟通，核实实验结果与临床诊断的符合率，特别是30分钟不出现荧光的结果，应详细询问临床症状和家族史，以提高临床诊断性能。

5.参考区间

G6PD活性正常者第二斑点10分钟内出现荧光。

6.临床意义

中间型者10～30分钟出现荧光，严重缺乏者30分钟仍不出现荧光。

三、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶活性测定

1.检验原理

G6PD催化G6P脱氢，转化成6-磷酸葡萄糖内酯（6PG），并将氢传递给NADP+使之变为NADPH。NADPH在340nm处有一吸收峰，通过测定NADP+在单位时间内还原成NADPH的量，换算出红细胞内G6PD的活性。

2.检验方法学

（1）器材和试剂

1）器材：

分光光度计、水浴箱。

2）试剂：

①溶血素，毛地黄皂苷16mg溶于80ml蒸馏水，过滤后加入 NADP+ 1mg。② 3.8mmol/L NADP+，NADP钠盐0.29g加蒸馏水100ml。③0.5mol/L Tris缓冲液（pH 7.5），Tris 6.05g溶解于70ml蒸馏水，以盐酸调节pH，加蒸馏水至1 000ml。④0.63mol/L氯化镁溶液，1.28g氯化镁溶于100ml蒸馏水中。⑤33mol/L G6P溶液，931mg G6P钠盐溶于100ml蒸馏水。

（2）操作

1）将2ml EDTA、ACD或肝素抗凝血以500×g离心10分钟，除去血浆和棕黄层，将红细胞用生理盐水洗涤2次，于第二次洗涤后将红细胞悬浮于等体积生理盐水中，制成红细胞悬液。

2）溶血液制备：吸取0.05ml红细胞悬液加入溶血素0.5ml，混合后放置10分钟，完全溶血后测定溶血液的血红蛋白浓度。

3）应用液：于临用前按表5-8配制新鲜应用液。

4）于1cm光径石英比色杯中加应用液1.0ml，37℃预热，内容物达37℃后加入溶血液0.02ml，混匀，立即于340nm处测定吸光度（以对照管为基准），并开动计时器，每分钟读取吸光度值一次（保持恒温37℃），至少6次。

5）计算如下：

其中：ΔA/min为每分钟吸光度的平均变化值，1 000/6.22为微摩尔消光系数的倒数，1 020/20为总容量与溶血液的量之比，Hb（g/L）为溶血液所测得的Hb浓度。

3.方法学评价

该方法是G6PD缺乏症的确诊试验，可直接测定NADPH的量，对G6PD缺乏症诊断的特异性和敏感性比高铁血红蛋白还原试验和荧光斑点试验高。溶血发作期G6PD酶的活性可以正常或接近正常。

反应过程中生成的6-磷酸葡萄糖（6-PG）很容易氧化成6-磷酸葡萄糖酸（6-PGA），由于红细胞中同时存在6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶（6PGD），能使6-PGA脱羧生成核酮糖-5-磷酸，同时使NADP+还原成NADPH，测定的NADPH假性增高，G6PD出现假性增高的结果。因此有专家建议分别测定G6PD和6PGD的活性，用G6PD/6PGD比值法来反映G6PD的活性。由于6PGD缺乏极为罕见，利用6PGD活性作对照，可放大G6PD活性部分减少时的显色差别，同时减少因标本处置不当带来的误差，如标本放置时间过长、抗凝剂比例不当等。G6PD/6PGD比值法可提高杂合子的检出率，Mosca等报道比值法对于G6PD地中海型杂合子检测的敏感性和特异性分别是85.3%和97.4%，杜传书建立的NBT定量比值法（G6PD/6PGD比值法）可以检出76.9%的杂合子。

4.质量保证

（1）分析前

1）本实验最好的抗凝剂是 EDTA·K₂，ACD、CPD、肝素锂等抗凝剂也可用。在这些抗凝血中，2～8℃保存时，G6PD活性可稳定72小时。如用其他的抗凝剂，如草酸铵等，应在12小时内检测，且检测前保存于2～8℃。

2）标本运输时应采用隔热、冷藏的容器。

3）由于网织红细胞或年轻红细胞的G6PD酶活性是衰老红细胞的5倍左右，因此新生儿，或急性溶血发作期间或溶血刚发生后，血液中含有较高的网织红细胞，酶活性测定值将高于实际结果，可导致假阴性。

4）如果怀疑患者有急性血管内溶血发生时，应该停用所有可能引起溶血的药物，10～15天后复查，如有输血史，则应间隔2个月后复查。

（2）分析中

1）G6PD活性在室温会下降，需用恒温分光光度计检测。溶血液制备后应立即测定，否则应存储于0～4℃，且不超过6小时。如连续6次读取吸光度中，各ΔA/min相差较大，应增加读数次数，至连续5次ΔA/min读数相互之间接近为止。

2）所用试剂应至少为分析纯，且配制好的试剂应冷藏保存。缓冲液的pH、试剂及溶血液加入量、测定时间应准确。

3）G6PD在红细胞中含量最丰富，血清中仅微量。Mg2+是G6PD激活剂，Cu2+、Zn2+对其有轻微抑制作用，Hg2+及对氯化汞苯甲酸能完全抑制其活性，且谷胱甘肽及半胱氨酸不能使其恢复活性。

4）采用去白细胞的抗凝血标本，以防白细胞对比色的干扰，特别是白细胞增高的患者。

（3）分析后：

与临床沟通，应核实实验结果与临床诊断的符合率，特别是G6PD活性减低的结果，应详细询问临床症状和家族史，以提高临床诊断性能。

5.参考区间

健康人G6PD酶活性参考范围（12.1±2.09）IU/g Hb（37℃）。

6.临床意义

WHO根据G6PD的酶活性水平和临床症状，把G6PD变异型分成5类：Ⅰ类酶活性严重缺乏（＜ 1%正常活性），伴有慢性非球形红细胞性溶血性贫血；Ⅱ类酶活性重度缺乏（＜ 10%正常活性），常因蚕豆病或药物引发的急性溶血性贫血；Ⅲ类酶活性轻中度缺乏（10%～60%正常活性），偶发急性溶血；Ⅳ类酶活性正常（60%～90%正常活性），一般无临床症状；Ⅴ类酶活性高于正常（＞ 110%正常活性），一般无临床症状。

1）G6PD酶活性减低：

主要见于G6PD缺乏症患者，纯合子缺乏患者残存的G6PD活性低于正常人的20%，杂合子患者残存的酶活性是正常人的20%～60%。

G6PD缺乏症是X性连锁不完全显性遗传性疾病，男性只有1条X染色体，因而男性都是半合子，要么正常，要么G6PD缺乏。女性有2条X染色体，其中1条在胚胎早期即灭活，若有G6PD缺乏的X染色体被灭活，而携带正常G6PD基因的X染色体保留下来，则此女性杂合子虽有G6PD基因缺陷，但对表型无影响，G6PD活性可完全正常；而若有G6PD基因缺陷的X染色体被保留下来，则G6PD活性可呈不同程度缺乏，这也是女性杂合子漏诊率较高的原因。如果女性2条X染色体均为G6PD基因缺陷，则为纯合子，表现为G6PD严重缺乏。

2）G6PD酶活性增高：

WHO分类中第Ⅴ类G6PD酶活性高于正常，但在临床上还未发现有对应的G6PD基因缺陷类型。G6PD酶活性增高都是由于急性溶血、新生儿等患者体内年轻红细胞增多所引起的。

四、丙酮酸激酶荧光斑点试验

丙酮酸激酶（pyruvate kinase，PK）（EC 2.7.1.40）是糖酵解过程中的一个限速酶，正向催化磷酸烯醇式丙酮酸（PEP）转化为丙酮酸，同时产生一个分子的ATP。PK缺乏症自1961年Valentine首次报道以来，文献中已报道500多例，是发生频率仅次于G6PD缺乏症的一种红细胞酶病，也是糖酵解途径中发生频率最高的红细胞酶病。PK缺乏症是常染色体隐性遗传性疾病，携带者（杂合子）一般无临床症状，纯合子和复合杂合子才出现慢性溶血性贫血。临床表现轻重不一，从完全代偿的溶血性贫血到严重的需要输血依赖的贫血。其他临床症状包括新生儿黄疸、脾肿大、胆石症等，严重者可发生胆红素脑病，需要进行血液置换。PK缺乏症患者的临床表现和实验室检查结果与其他遗传性非球形红细胞性贫血相似，目前主要通过PK荧光斑点试验（fluorescence test for PK）和酶活性测定来进行诊断。

1.检验原理

溶血液中的PK催化PEP转化为丙酮酸，丙酮酸在乳酸脱氢酶（LD）催化下生成乳酸，同时将NADH氧化为NAD+，由于NADH在长波紫外光下可见荧光而NAD+无荧光，因此反应后荧光逐渐消失。

2.检验方法学

（1）器材和试剂

1）器材：

紫外光源（波长365nm）、离心机、水浴箱、滤纸。

2）试 剂：

0.15mol/L PEP溶 液，80mmol/L MgCl₂溶 液，0.25mol/L 磷酸钾盐缓冲液（pH 7.4），15mmol/L NADH 溶液，30mmol/L ADP溶液（称取无水ADP三钠盐14.8mg溶于1ml蒸馏水中，用0.2mol/L NaOH调节pH 7～8，-20℃保存），溶血剂（0.27mol/L EDTA溶液1L中加入β-巯基乙醇0.05ml）。

（2）操作

1）样本：肝素、EDTA及ACD等抗凝静脉血，采用滤过法（等量的α纤维素和微晶纤维素）或离心法制备乏白细胞和血小板的压积红细胞，然后用溶血剂配成1：20的溶血液。

2）配制反应液：将 0.15mmol/L PEP 溶液 30μl，30mmol/L ADP 溶液 100μl，15mmol/L NADH 溶液 100μl，80mmol/L MgCl₂溶液 100μl，0.25mol/L 磷酸钾缓冲液 50μl及蒸馏水 620μl混匀。

3）将溶血液10μl加入到反应液100μl中，充分混合后，取一滴反应液（约0.05ml）在滤纸上点一个小斑点，然后在37℃温育25分钟，再在滤纸上点第2个斑点，晾干后观察。

4）结果判断：在波长365nm紫外线灯下观察荧光点。

3.方法学评价

本法特异性较高，但属定性试验，只能作为PK酶活性缺乏的筛选。在应用PK荧光斑点试验时，首先应使该试验标准化，即用PK酶活性定量法校正筛选法的结果，这样才能保证试验结果的可靠性。

4.质量保证

（1）分析前

1）接受输血的患者检测PK活性时，必须在停止输血后2个月才能进行采血。

2）血标本在检查前放2～8℃冰箱保存。

（2）分析中

1）白细胞和血小板中含有M1和M2型PK酶，白细胞PK酶活性是红细胞的300倍，因而在处理血标本时，应尽量去除白细胞和血小板，一般要求残存的白细胞低于0.1×109/L。

2）每次试验均应用已知PK活性正常的标本作为对照。

3）试验的最佳pH为7～8，因此，试剂如磷酸烯醇式丙酮酸、ADP液、NADH溶液均需用0.2mol/L NaOH将pH调至7～8。

4）NADH配制后不稳定，试验前应以340nm的吸光度进行校正，15mmol/L NADH溶液经1：1 000稀释后在340nm的吸光度约为0.093。

5）制备溶血液时，用低渗反应液破坏红细胞，残留的白细胞和血小板破坏很少，对红细胞酶活性检测影响很小。

6）点样量不宜太大，以免影响荧光的观察。

7）PK酶激活需要Mg2+、K+等阳离子参与，因此试剂中需要MgCl₂和磷酸钾盐缓冲液。

（3）分析后：

与临床沟通，应核实实验结果与临床诊断的符合率，特别是25分钟后荧光仍不消失的结果，应详细询问临床症状和家族史，以提高临床诊断性能。

5.参考区间

正常人：25分钟荧光消失。

6.临床意义

PK缺乏患者：25分钟荧光斑点不消失，杂合子荧光在25～60分钟内消失，如为严重缺乏（纯合子）60分钟荧光仍不消失。

五、丙酮酸激酶活性测定

1.检验原理

溶血液中的丙酮酸激酶催化PEP转化为丙酮酸，丙酮酸在LD催化下生成乳酸，同时将NADH氧化为NAD+，由于NADH在340nm处有一吸收峰，因此，可根据此吸光度的改变换算出PK的活性。

2.检验方法学

（1）器材和试剂

1）器材：

水浴箱，分光光度计，定时器。

2）试剂：

1mol/L Tris-HCl 缓冲液（含 5mmol/L EDTA，pH 8.0），0.1mol/L MgCl₂溶 液，1mol/L KCl溶 液，2mmol/L NADH溶液，30mmol/L 腺苷二磷酸（ADP）溶液，60U/ml乳酸脱氢酶（LD）溶液，10mmol/L果糖-1，6-二磷酸（FDP）溶液，50mmol/L PEP溶液，溶血剂（0.27mol/L EDTA溶液1L中加入β-巯基乙醇 0.05ml）。

（2）操作

1）样本：肝素、EDTA及ACD等抗凝静脉血，采用滤过法或离心法制备乏白细胞和血小板的比容红细胞，用溶血剂配成1：20的溶血液。

2）在1ml反应体系中，按表5-9加入试剂。

3）在37℃恒温下，波长340nm处记录10分钟各管的吸光度变化。

4）计算：红细胞PK活性计算公式

其中：ΔA：在340nm处每分钟吸光度变化；VC：测量体系的总体积；VH：加入溶血素的剂量；Hb：溶血液的血红蛋白浓度；6.22：1mmol/L NADH在340nm处的吸光度值。

3.方法学评价

本方法是PK活性的定量测量，通过标准温度、pH和一定底物浓度下，NADH转化成NAD+的量来换算PK活性，对PK缺乏症的诊断有较高的特异性和灵敏度，可作为确诊试验。

4.质量保证

（1）分析前

1）接受输血的患者检测PK活性时，必须在停止输血后2个月才能进行采血。

2）血标本在检查前放2～8℃冰箱保存。

（2）分析中

1）白细胞和血小板中含有M1和M2型PK酶，白细胞PK酶活性是红细胞的300倍，因而在处理血标本时，应尽量去除白细胞和血小板，一般要求残存的白细胞低于0.1×109/L。

2）试验的最佳pH为7～8，因此，磷酸烯醇式丙酮酸、ADP液、NADH溶液均需用0.2mol/L NaOH将pH调至7～8。

3）NADH配制后不稳定，试验前应以340nm的吸光度进行校正，15mmol/L NADH溶液经1：1 000稀释后在340nm的吸光度约为0.093。

4）每次试验应用已知PK活性正常的标本作为对照。

5）PK酶激活需要Mg2+、K+等阳离子参与，因此试剂中需要MgCl₂和KCl溶液。

（3）分析后：

与临床沟通，应核实实验结果与临床诊断的符合率，特别是PK酶活性减低的结果，应详细询问临床症状和家族史，以提高临床诊断性能。

5.参考区间

成人：（15.0±1.99）U/gHb。低PEP浓度加FDP刺激后正常红细胞PK活性为正常范围的（43.5±2.46）%。

6.临床意义

（1）遗传性PK缺乏症：

红细胞内PK活性减低主要见于遗传性PK缺乏症患者。纯合子PK缺乏活性显著降低，仅为正常人的5%～25%，杂合子则有正常人的25%～50%。

PK缺乏症患者红细胞中残存的酶活性多少不等，与病情的严重程度不相关，也与网织红细胞的含量无关。某些PK缺乏症患者甚至表现出正常或增高的PK酶活性，原因可能为输血引起的红细胞污染；或白细胞、血小板未去除干净；或其他PK同工酶（如PK-M2）的代偿等。此外，有些酶动力学异常的PK突变患者，尽管在体内酶活性减低，但在体外最适的实验室条件下，测得的酶活性正常或增高，但在高低两种不同浓度的磷酸烯醇式丙酮酸条件下，测得的PK酶活性不一。在高浓度的磷酸烯醇式丙酮酸存在时，PK酶活性正常或增高，但在低浓度的磷酸烯醇式丙酮酸条件下，测得的PK酶活性减低。

（2）获得性PK酶活性减低：

再生障碍性贫血、骨髓增殖异常综合征、急性白血病患者，以及化疗后，PK活性也可降低。获得性酶缺乏或减低的原因是多方面的，可能是伴有蛋白质合成异常的骨髓干细胞受损，或是PK酶的翻译后修饰所致。

六、红细胞酶病分子诊断试验

（一）G6PD缺乏症的分子诊断

编码G6PD的基因位于Xq2.8，全长18.5kb，由13个外显子和12个内含子组成，外显子1位于非编码区，其余12个外显子位于蛋白编码区，长度为12～236bp，其cDNA为1 548bp（GenBank：M21238），编码 515 个氨基酸残基。G6PD缺乏症的分子基础是基因点突变导致生化表型的改变并产生临床症状。迄今为止，世界范围内发现的G6PD基因突变类型已超过160种，其中绝大多数是单个碱基置换，造成错义突变，引起单个氨基酸替代，导致蛋白质一级结构改变，从而影响G6PD酶的生物学功能。极少数是小片段缺失导致酶的结构缺陷，启动子区域突变和移码突变各发现1例，未发现大片段缺失的病例报道。G6PD的突变具有民族和种族异质性，中国人群中共发现20多种基因突变，主要存在于汉族、白族、基诺族、傣族和彝族等民族。我国大陆地区的8种主要突变型是 G1376T、G1388A、A95G、C1024T、C592T、A493G、G487A 和 C1360T，分别位于外显子 2、6、9、11、12，其中最为常见突变类型是G1376T、G1388A和A95G。

G6PD基因检测对于疾病的分子诊断、探讨G6PD结构与功能的关系以及完善人类遗传学资料有重要意义。由于G6PD缺乏症绝大多数都是基因点突变引起，因而采取各种检测基因突变的方法，进行分子生物学诊断。应用较为广泛的方法有：等位基因特异性寡核苷酸（ASO）探针斑点杂交法、PCR-反定点杂交（PCR-RDB）、PCR限制性内切酶分析、突变特异性扩增系统（ARMS）、单链构象多态性分析（SSCP）、变性梯度凝胶电泳（DGGE）、基因芯片技术等。

随着科技的发展，出现了很多新的技术用于基因突变分析，包括基于变性高效液相色谱的引物延伸法（primer extention，PE）分析技术，异源双链法分析技术，飞行时间质谱技术等。不同实验室可根据自身条件和检测目的，选择不同的方法或组合。如只需对中国人群常见的几种突变类型进行筛查，可采用PCR-RDB或基因芯片等方法。G6PD基因突变检测的芯片已有国产试剂提供，能检测G1388 A、G1376T、A95G、G392T、C592T、C1024T、G1381A、C1387T 等 8种不同的G6PD点突变类型。应用各种突变检测技术检测到的基因突变，最后都需用序列分析才能确定突变类型及突变位置。随着测序费用的下降，直接测序法将可能成为检测新的突变类型的常用方法。

如需要对某一临床高度怀疑的G6PD缺乏患者（G6PD酶活性减低的男性或女性患者）或女性杂合子进行分子生物学检测，查找基因突变位点，检测流程简述如下：首先用PCRRFLP方法进行筛查；如未筛查到基因突变位点，则对中国人群G6PD基因常见突变区域2、6、9、11、12外显子区域进行筛查；如还是未找到突变位点，则进行其他编码区域序列分析，必要时，进行启动子或内含子区域突变分析，直至找到突变位点。

如果条件许可，采取PCR方法对G6PD基因第2～13外显子进行扩增，直接进行基因测序，这样不仅可以检出绝大多数已知突变，还可以发现新的突变类型（表5-10）。

（二）PK缺乏症的分子诊断

PK是一分子量为60kD由完全相同或基本相同的亚单位组成的四聚体，在哺乳动物组织中有4种异构酶：L、R、M₁和M₂。R型异构酶（R-PK）只存在于成熟的红细胞，L型异构酶（L-PK）只存在于肝脏，L-PK与R-PK非常相似但不完全相同，两者都由PK-LR基因编码。M₁-PK存在于肌肉、心脏和脑，M₂-PK存在于白细胞和血小板，幼稚细胞中也有M₂-PK，两者都由PK-M基因编码。某些PK缺乏症患者的红细胞已发现有M₂-PK的表达，这可以解释PK缺乏症患者的临床表型从可代偿的溶血性贫血到严重输血依赖的大范围变异性。

PK-LR基因定位于1q21，总共12个外显子，长度9.5kb。L型和R型由两个组织特异性启动子进行转录，编码的L型和R型仅只在前2个外显子有差异。外显子1为红细胞系统特有，而外显子2为肝脏特有，外显子3～12为两者共有。Kanno等克隆了人的R型PK基因的cDNA由2 060bp组成，编码1个574个氨基酸的蛋白。在PK-LR基因中，截止到2007年，已报道与非球形红细胞性溶血性贫血相关的基因变异有180多种，其中69%为错义突变，拼接错误和无义突变分别占13%和5%，小片段缺失、插入、移码突变等合计12%左右。在启动子区域仅发现2种突变，即-A72G和-G83C。也有少数大片段缺失的报道，如“Gypsy”缺失1 149个bp，导致外显子11丢失；“Viet”丢失外显子4～10；另一大片段缺失包含5 006bp，导致cDNA水平上4～11外显子全部丢失。

最常见的突变是G1529A和C1 456T，并具有很强的种族和地域背景。G1529A主要分布在美国（42%），北欧和中欧（41%）；而C1456T主要分布在南欧（其中西班牙32%，葡萄牙35%，意大利29%）。其他突变类型，特别是G721T和G994A，在高加索人群中才有较低的发生率。在亚洲最常见的突变为C1468T。

由于PK缺乏症患者的突变或缺失位点可能位于外显子、内含子及启动子区域，因而对于PK缺乏症的分子诊断，一般是将所有外显子、内含子和LR-PK的红细胞特异性启动子区域进行PCR扩增后分别测序，与DNA序列数据库（Genebank）进行比对，以发现突变位点的所在。对于大片段缺失、基因调节区域的突变、激活了隐秘剪接点的内含子突变，则较难识别，通过通用的引物组也不能进行检测。这些情况下，分析先证者双亲和推测处于杂合子状态的其他家庭成员的基因，有助于明确诊断。

（李琳芸　吴新忠）