第五节　抗体、补体所致溶血病检验技术

免疫性溶血性贫血是红细胞抗原与抗体结合和/或补体介导，致使红细胞溶解或被吞噬而导致的贫血，以自身免疫性溶血性贫血（autoimmune hemolytic anemia，AIHA）与阵发性睡眠性血红蛋白尿症（paroxysmal nocturnal hemoglobinuria，PNH）居多。AIHA根据抗体作用于红细胞所需温度的不同分为温抗体型AIHA和冷抗体型AIHA两类。温抗体型AIHA自身抗体在37℃时呈现最大活性，绝大多数为IgG，具有或不具有补体结合能力，极少数为IgM。冷抗体型AIHA较温抗体型少见，包括冷凝集素综合征（cold agglutinin syndrome）和阵发性冷性血红蛋白尿症（paroxysmal cold hemoglobinuria）。冷凝集素绝大多数为IgM抗体，可结合补体，在28～31℃即可与红细胞反应，0～5℃表现为最大反应活性。阵发性冷性血红蛋白尿症比较少见，其自身抗体是IgG型，又称为D-L抗体。D-L抗体在0～4℃与红细胞结合，当温度升高至37℃时，补体激活，导致溶血。PNH中，主要表现为受累红细胞对补体介导的溶血敏感性增高，从而导致红细胞破坏增加。

抗体、补体所致溶血病的常用检验技术包括抗球蛋白试验、红细胞相关抗体分型试验、红细胞相关抗体测定、冷凝集素测定、双相溶血试验和酸溶血试验等。近年来，随着免疫学、分子生物学以及流式细胞术等技术的发展以及在实验室的广泛应用，相关检测技术也得到了较大发展，借助流式细胞术和聚合酶链技术检测细胞膜表面CD55和CD59以及PIG-A基因突变已成为PNH诊断鉴别和疗效观察的可靠手段。

一、抗球蛋白试验

1945年，英国免疫学家Coombs等人发明了能检测红细胞表面抗体的一种新试验，即抗球蛋白试验，亦称Coombs试验，是诊断免疫溶血性贫血的主要方法。

（一）检验原理

温抗体型AIHA的自身抗体为IgG。在AIHA的患者中，此种抗体可以与红细胞表面的相应抗原结合，使得红细胞致敏但不发生凝集，待加入抗球蛋白血清后，则与红细胞上IgG结合，使得红细胞发生凝集反应，此为直接抗球蛋白试验（direct antiglobulin tests，DAT）。如果患者血清中存在游离抗体，则可以用Rh阳性O型正常人红细胞加以吸附，以此红细胞与抗球蛋白血清作用，致使红细胞发生凝集，此为间接抗球蛋白试验（indirect antiglobulin tests，IAT），是一种检测血清中不完全抗体或补体的方法。

（二）检验方法学

1.直接抗球蛋白试验

（1）主要器材和试剂：

①抗球蛋白血清；②不完全抗D致敏的5% Rh（D）阳性红细胞悬液（阳性对照）：取3个人的O型红细胞，混合，经盐水洗涤后取压紧的红细胞，加等量的抗D血清，置37℃水浴致敏30分钟，取出后离心去除上清液，用盐水洗涤3次，最后再用盐水配成5%红细胞悬液。③正常人5% D阳性红细胞悬液（未致敏，阴性对照），除不用抗D血清致敏外，按上法配制。④水浴箱、离心机、试管。

（2）操作：

主要步骤如下。

取受检者红细胞，以生理盐水充分洗涤3次，末次洗涤后将上层盐水倒尽，以滤纸将管口残余的盐水吸去，再配成5%红细胞盐水悬液。

取上述5%受检者红细胞盐水悬液1滴，移入试管内，加入抗球蛋白血清1滴，混匀。

阳性对照：用不完全抗D血清致敏的5%（D）阳性红细胞悬液1滴，加入抗球蛋白血清1滴，混匀。

阴性对照：正常人5% D阳性红细胞悬液1滴，加入抗球蛋白血清1滴，混匀。

受检管，阳性对照管及阴性对照管同时以1 000r/min 离心1分钟，轻轻侧动，观察结果。

判断结果：如阳性对照管凝集，阴性对照管不凝集，受检红细胞凝集者为阳性，不凝集者为阴性。

2.间接抗球蛋白试验

（1）主要器材和试剂：

①抗球蛋白血清。②受检血清，或已知抗体的血清。③5%已知抗原的红细胞悬液，或5%受检红细胞悬液。④不完全抗D血清。⑤AB型血清。⑥5%D阳性红细胞悬液。⑦水浴箱，离心机，试管。

（2）操作：

主要步骤如下。取3支试管，标明受检管，阳性对照管及阴性对照管。按表5-11将各反应物加入相应试管内。

混匀，置37℃水浴1小时，用生理盐水洗涤3次。末次洗涤后，去除上清液，以滤纸将管口残余的盐水吸去。每管再各加生理盐水1滴。

每管各加适当浓度的抗球蛋白血清1滴，混匀，1 000r/min离心1分钟，观察结果。

判断结果：阳性对照管呈现凝集，阴性对照管不凝集，受检管出现凝集为阳性，表示受检血清中有不完全抗体，或受检红细胞上有相应抗原。如阳性或阴性对照出现不规则结果，应分析原因，重做。

（三）方法学评价

Coombs试验是诊断AIHA的关键性检查。可分为DAT和IAT。前者是检查被检红细胞膜上有无不完全抗体，后者是检查血清中有无游离的不完全抗体。DAT较IAT对AIHA更有诊断价值。DAT操作简单，特异性强，不足之处是其灵敏度较低。DAT是否阳性不仅仅取决于红细胞膜上抗体的量，而且受红细胞特性、红细胞抗体类型、试验所用的抗免疫球蛋白血清质量和试验操作方法等因素影响。一般认为，应用质量可靠的商品化试剂，当每个红细胞膜上有300～500个抗体分子时，经典DAT可呈阳性反应，如免疫球蛋白分子低于此值，则DAT为阴性。经典DAT的另一不足是特异性差，如冷凝集素综合征或阵发性睡眠性血红蛋白尿症时，激活的补体在红细胞膜上附着，可出现抗人全血清的Cooms试验假阳性。同时，传统的DAT不能够将红细胞抗体进一步分型。

（四）质量保证

1.分析前

标本采集顺利，混匀时动作轻柔，避免发生溶血和破坏红细胞，采集后尽快送检，放置过程中可使抗体从细胞上丢失或结合上非特异性补体，造成假阴性或假阳性结果；试验所用器械必须清洁；生理盐水pH不宜过低；抗球蛋白血清应当新鲜，效价标准。

2.分析中

红细胞洗涤应充分，除去多余的抗球蛋白血清；离心速度和时间应适宜，避免破坏红细胞；观察红细胞凝集时，动作应轻柔，切忌用力过猛；应在显微镜下证实红细胞凝集状态，避免红细胞凝集很弱时的假阴性结果。

3.分析后

确认检测过程正确无误，并结合患者病史和用药史以及其他检测结果等综合分析，及时与临床医生进行沟通，保证检测结果的正确性。

（五）参考区间

阴性。

（六）临床意义

本试验阳性结果主要见于下列几种情况：

1.自身免疫性贫血（IgG）型引起的溶血性贫血

本试验直接反应常呈强阳性，间接反应大多阴性，但亦可阳性。

2.药物诱发的免疫性溶血性贫血

①α-甲基多巴型：直接及间接反应均阳性。②青霉素型：直接反应阳性，间接反应阴性，以上二型如以正常红细胞先与有关药物于37℃培育后再加患者血清、间接反应均为阳性。③福阿亭型：（奎宁等药物）抗体通常为IgM，偶有IgG型者，直接反应为阳性，间接反应阴性，但如用IgG抗血清做试剂则结果大部分均为阴性，但如培育时加入新鲜正常人血清（供应补体）则结果为阳性。

3.冷凝集素综合征

直接反应阳性，间接反应阴性（试验需在37℃下进行）。由于本病红细胞膜附着的是补体C4和C3而不是IgG或IgM，如果用抗IgG或抗IgM抗血清做试验时，则结果阴性，如以抗补体的抗血清做试验则直接反应阳性。

4.新生儿同种免疫溶血病

因Rh血型不合所致溶血病，直接及间接反应均强阳性，持续数周、换血输血后数天内可变为阴性，由于“ABO”血型不合引起的溶血病，结果常为阴性或弱阳性。

5.红细胞血型不合引起的输血反应

ABO或Rh血型不合输血，供者的红细胞被受者的血型抗体致敏，在供者被致敏的红细胞完全破坏以前，直接反应阳性，Rh阴性者如过去不曾接受过Rh阳性者的血或曾妊娠胎儿为Rh阳性者，间接反应阳性，如无上述接触，第一次输血后（Rh阳性的血），数天之内间接反应也会变为阳性。

6.其他

在传染性单核细胞增多症、SLE、恶性淋巴瘤、慢性淋巴细胞白血病、癌肿、铅中毒、结节性动脉周围炎、Evan综合征等中，患者直接反应亦可阳性，阵发性寒冷性血红蛋白尿症患者中，急性发作后用抗补体血清做试验直接反应常为阳性。

二、红细胞相关抗体分型试验

随着血清学和免疫学的发展，发现AIHA患者红细胞自身抗体存在不同的类型，进行自身抗体的免疫学分型，对阐明红细胞破坏机制，判断疾病严重程度和指导治疗都有重要意义。

（一）检验原理

利用单特异性抗免疫球蛋白抗血清可与体内已被不完全抗体或补体致敏红细胞产生凝集反应，可检查红细胞是否已被不完全抗体所致敏，根据单特异性抗免疫球蛋白抗血清（包括抗IgG、IgM、IgA）及或补体C3的不同，对红细胞上结合的自身抗体进行分型，此为改良法的直接抗球蛋白试验。

（二）检验方法学

1.主要器材和试剂

①单特异性抗免疫球蛋白抗血清。②抗C3试剂。③试管，离心机。

2.操作

主要步骤如下。

标本准备：EDTA或枸橼酸钠抗凝全血 ＞ 1.0ml。

抗凝全血用新鲜的生理盐水洗涤3～4次，转速为2 000～2 500r/min。

将全血红细胞配成浓度为5%的受检细胞悬液。取数支小试管，分别加入50µl受检细胞悬液。

每管中分别加入单特异性抗免疫球蛋白抗血清及抗C3试剂各50µl，1 000～1 500r/min离心5分钟，观察结果。

判断结果：4+：红细胞凝集成一大块或小块，几乎没有游离红细胞；3+：虽红细胞凝集成一大块或小块，但约有1/4红细胞游离；2+：有小凝集块，但约有1/2红细胞游离；1+有小凝集颗粒，大部分为游离红细胞；±：显示有小凝集，但不及“+”者；阴性：未见凝集，全为游离红细胞。

（三）方法学评价

经典的抗球蛋白试验所用的抗球蛋白血清为抗人所有种类免疫球蛋白的混合血清，不能鉴别AIHA红细胞上自身抗体的类型。随着免疫学的发展，单特异性抗免疫球蛋白抗血清被提纯，包括抗IgG、IgM、IgA 和/或补体（C）用于DAT，提高了试验的阳性率，而且还可鉴定红细胞上结合的自身抗体类型。本试验即为改良的抗球蛋白试验。

大多数AIHA患者，红细胞上结合的自身抗体的基本分三类：单纯IgG型，IgG+C，单纯C型，而IgM型较少，IgA型罕见。原发性AIHA以IgG和IgG+C为多，继发于系统性红斑狼疮（SLE）的AIHA则主要为IgG+C和C型。AIHA患者溶血的严重程度与红细胞上抗体的类别相关，各型抗体造成红细胞破坏的免疫学机制不同，因此对红细胞自身抗体的分型有重要临床意义。利用改良的DAT对AIHA患者进行免疫性抗体分型，即可检出红细胞相关IgG、IgA和IgM，避免遗漏具有IgM或IgA自身抗体的AIHA，同时检测抗C血清，使得AIHA分型更为准确。

近年来，随着对AIHA的深入研究，用单克隆IgG亚型的抗体（亚型特异性抗球蛋白试剂）还可对AIHA IgG亚型进行分类。IgG亚型是决定红细胞破坏机制和临床表现的一个重要因素，与溶血的程度和疾病预后密切相关。因为红细胞溶解取决于补体的结合，只有IgG3具有较强的结合补体能力，IgG1结合补体的能力较弱，而IgG2仅有轻微的结合补体的能力，IgG4 则不能结合补体；而且单核巨噬细胞仅有针对IgG1和IgG3的Fc段的受体。因此，IgG3和IgG1对红细胞的破坏作用大于IgG2，而IgG4抗体并不引起红细胞的破坏。临床上IgG3型患者都有明显溶血征象，而单独IgG1型仅65%有溶血，IgG4型几乎无溶血反应。

利用生物素亲和素系统-抗球蛋白试验（BAS-Coombs试验）可以检测红细胞膜表面结合的IgG、IgM、IgA。红细胞上结合的自身抗体，该方法可精确检测出致敏红细胞上的自身抗体，比经典DAT敏感。流式细胞术（FCM）也可用于检测红细胞相关抗体，但该实验的难点是如何调整抗抗体浓度和红细胞浓度，使带荧光的抗抗体既结合了膜上有自身抗体的红细胞，又不使红细胞聚集成团，使之适合流式细胞仪检测。

（四）质量保证

1.分析前

某些药物可能对试验产生影响，如有可能应在治疗前或停用相关药物后检查；标本采集顺利，混匀时动作轻柔，避免发生溶血和破坏红细胞，采集后尽快送检，放置过程中可使抗体从细胞上丢失或结合上非特异性补体，造成假阴性或假阳性结果；试剂开启后需在规定条件下保存和使用。由于各商品试剂效价不一，在启用前用提供的阴性、阳性对照或其他标本进行验证，如有可能，每次检测时应做阴性或阳性对照。

2.分析中

红细胞洗涤应充分，离心速度和时间应适宜，避免破坏红细胞和影响检测；受检细胞悬液的浓度应适宜，保证抗原抗体反应量适合，观察红细胞凝集时，动作应轻柔，切忌用力过猛；应在显微镜下证实红细胞凝集状态，避免红细胞凝集很弱时的假阴性结果。

3.分析后

确认检测过程正确无误，并结合患者病史和用药史以及其他检测结果等综合分析，及时与临床医生进行沟通，保证检测结果的正确性。

（五）参考区间

阴性。

（六）临床意义

AIHA溶血的严重程度与红细胞上抗体的类别有关。各型抗体造成红细胞破坏的机制不同：

1.IgG致敏的红细胞，其溶血场所主要在脾脏，红细胞破坏主要是通过脾脏巨噬细胞介导，被覆在红细胞膜上的IgG的Fc片段与巨噬细胞的受体结合，引起红细胞被吞噬和破坏，但抗体依赖细胞毒作用也起重要作用，即巨噬细胞与抗体结合后释放溶酶体酶，在细胞外溶解红细胞。这两种作用都造成血管外溶血。

2.IgG+C3型AIHA的致敏红细胞分别与巨噬细胞的Fc受体和C3b受体结合，两者协同作用，且不易受血浆中游离IgG的竞争性抑制，使红细胞的破坏大大加强，患者贫血常较重。溶血主要发生在肝脏和骨髓。

3.巨噬细胞膜上并无IgM-Fc受体，但IgM可激活补体（C3b），吸附C3b的红细胞主要在血液循环丰富、巨噬细胞数量较多的肝脏内破坏，较罕见的是IgM可能是温性溶血素，激活补体，形成攻击膜复合物而直接造成血管内溶血，所以具有IgM者一般溶血都较重。

4.单纯补体C3型，其红细胞的破坏也是单核巨噬细胞介导，破坏的方式不是通过吞噬作用，而是通过溶酶体酶的释放在细胞外溶解，破坏场所主要在肝脏，溶血并不明显。

三、红细胞相关抗体测定

（一）检验原理

将人血清免疫球蛋白IgG包被在酶标反应孔内，加入等量系列稀释人标准血清IgG（或待测红细胞悬液）和生物素化鼠抗人IgG（b-MAHG），人标准血清IgG（或待测红细胞相关IgG）竞争抑制部分b-MAHG与固相人血清免疫球蛋白IgG结合。结合于固相的b-MAHG连接亲和素化辣根过氧化物酶复合物（ABC），后者作用于底物显色，其色泽深度与系列标准人IgG成反比。

（二）检验方法学

1.器材和试剂

①人血清免疫球蛋白标准血清：以蒸馏水0.5ml复溶后，分装于带盖塑料小杯内，封口后，置-20℃保存。②生物素化鼠抗人IgG（b-MAHG），临用时以1：2 000稀释，含10%小牛血清。③红细胞洗涤液：称取NaCl 8.0g，Na₂HPO₄·12 H₂O 2.9g，KCl 0.2g，KH₂PO₄ 0.2g，蒸馏水 1 000ml溶解后，即成。④包盖液：称取Na₂CO₃ 0.80g，NaHCO₃ 1.46g，蒸馏水500ml溶解，4℃冰箱保存。⑤反应洗涤液：pH 7.4，0.1mol/L磷酸盐缓冲液，含0.5ml/L吐温-20。⑥基质缓冲液：称取磷酸氢二钠3.2g，柠檬酸1g，加入蒸馏水200ml，溶解后，4℃冰箱保存。⑦底物液：临用时配制。10ml基质缓冲液中加入5mg邻苯二胺，完全溶解后，置4℃冰箱保存，临用前加入0.05ml H₂O₂混匀。⑧终止液：2MH₂SO₄。⑨ABC：以1：200稀释，含10%小牛血清。

2.操作

主要步骤如下：①包被人IgG（20ng/孔）于酶标板微孔，置于4℃过夜，洗涤4次。②红细胞的处理：取EDTA或枸橼酸抗凝血，将抗凝血离心，以红细胞洗涤液洗涤红细胞4次，配成浓度为0.1×1012/L的红细胞悬液。③酶标反应板：A，B两排每孔加入100μl待测红细胞悬液（双孔），C、D两排加入倍比稀释的人血清免疫球蛋白标准品，每孔加100μl。然后各孔加入 100µl b-MAHG（以 1：2 000稀释，含10%小牛血清），在微量振荡器振摇30秒，置37℃恒温箱中45分钟，每15分钟振摇一次。④同上洗板4次后，每孔各加100μl ABC，置于37℃反应30分钟。⑤同上洗板4次，各孔均加入100µl底物液，置暗处待显色充分。⑥用2mol/L H₂SO₄终止反应。⑦以492nm波长比色，读取吸光度绘制标准曲线，以系列倍比稀释标人血清免疫球蛋白标准品为横坐标，相应吸光度值为纵坐标，在半对数纸上绘制标准曲线。⑧判断结果：以样品吸光度均值查标准曲线，即可求得红细胞相关IgG的含量（EAIgG）。

（三）方法学评价

DAT结果取决于红细胞膜上抗体的含量，只有当每个红细胞膜结合的IgG量 ＞ 300～500个分子，DAT才呈现阳性反应。而当红细胞上抗体浓度不能够达到抗球蛋白试验所能检测的阈值范围时，其则表现为阴性。亲和素生物素化酶复合物酶联免疫分析法（ABS-ELISA法）较DAT具有较高的敏感性。利用ABS-ELISA法可以检测出DAT阴性的AIHA患者红细胞相关IgG的含量，避免了AIHA的漏诊。同时，动态观察红细胞相关IgG的含量，联合血红蛋白浓度、网织红细胞的变化情况可以评价AIHA的治疗效果和预后。

（四）质量保证

1.分析前

标本采集顺利，混匀时动作轻柔，避免发生溶血和破坏红细胞；采集后尽快送检，放置过程中可使抗体从细胞上丢失或结合上非特异性补体，造成假阴性或假阳性结果；试剂开启后需在规定条件下保存和使用。由于各商品试剂效价不一，在启用前用提供的阴性、阳性对照或其他标本进行验证，如有可能，每次检测时应做阴性或阳性对照。

2.分析中

人血清免疫球蛋白标准血清IgG包被在酶标反应孔内的时间不能过长；红细胞洗涤后，应尽快测定；β-MAHG、ABC应用浓度必须适当；每次测定都必须在同一酶标板上作双标准曲线；底物液必须临用时配制，加入的邻苯二胺要适量，使用前置4℃冰箱保存，避免发生颜色改变，影响结果判断。

3.分析后

确认检测过程正确无误，并结合患者病史和用药史以及其他检测结果等综合分析，及时与临床医生进行沟通，保证检测结果的正确性。

（五）参考区间

IgG ＜ 0.54fg/RBC。

（六）临床意义

EAIgG含量增高见于自身免疫性疾病，尤其是对于抗球蛋白试验阴性的免疫性溶血性贫血有诊断意义。

四、冷凝集素测定

冷凝集素（cold agglutinin）是冷反应型抗红细胞抗体，在0～4℃时最易和红细胞膜抗原结合，是IgM型，是一种可存在于正常人血清中的抗体，低效价一般没有临床意义。

（一）检验原理

冷凝集素是一种自身抗体，此抗体为IgM，通常具有抗I特性，少数情况下具有抗i特性。可使自身红细胞，O型红细胞或与受检者同型红细胞发生凝集，凝集反应常低于30℃，最高滴度多在4℃出现。凝集反应具有可逆性，若将已凝集的红细胞再放回37℃时，凝集现象即消失。

（二）检验方法学

1.器材和试剂

①生理盐水；②试管及离心机；③水浴箱；④冰箱；⑤试管。

2.操作

主要步骤如下。①抽取静脉血4～5ml，立即置于37℃水浴箱中。②待血块收缩后，离心分离血清，置于清洁试管中。③将0.5ml血清加入第一支试管，2～17支试管中各加生理盐水0.5ml；第2支试管加血清0.5ml，成两倍稀释，混匀后取0.5ml加入第3支试管一次进行稀释至第16管。第17管为生理盐水对照。④每管各加0.025ml红细胞悬液，混匀后置于冰箱（4℃），2小时后取出，立即观察凝集现象，并记录效价。然后再放入37℃水浴箱中温育2小时，观察凝集现象是否消失。⑤判断结果：观察试管内红细胞有无凝集现象。

（三）方法学评价

试管法、聚合酶链反应（PCR）等方法均可以用来检测冷凝集素。试管法简便，快速，价格适宜，但敏感性不如PCR法，可用于早期筛查。

（四）质量保证

1.分析前

某些药物可能对试验产生影响，如有可能应在治疗前或停用相关药物后检查。

2.分析中

观察红细胞凝集时，动作应轻柔，切忌用力过猛。

3.分析后

确认检测过程正确无误，并结合患者病史和用药史以及其他检测结果等综合分析，及时与临床医生进行沟通，保证检测结果的正确性。

（五）参考区间

＜ 1：16。

（六）临床意义

1.冷凝集素效价增高主要见于原发性冷凝集素综合征，其效价可高达1：1 000以上，而轻度增高常见于非特异性炎症，间质性肺炎，自身免疫性疾病，多发性骨髓瘤，非霍奇金淋巴瘤等。

2.冷凝集素测定效价明显升高并伴有血清触珠蛋白降低和血清乳酸脱氢酶浓度升高为典型的冷凝集素综合征，但并不是与其他感染和肿瘤严格区分的指标，尤其是不能以此与淋巴细胞增殖性疾病区别。

3.冷凝集素效价过高，可以导致血交叉配血不合，需要经37℃温浴后输给受血者。

五、双相溶血试验

在阵发性冷性血红蛋白尿患者中存在一种特殊的冷抗体，在低于20℃下时吸附在红细胞膜上，当温度升高后立即与红细胞分离，称为冷热抗体，亦称D-L抗体。

（一）检验原理

D-L抗体在37℃时不能与红细胞牢固结合，当温度降至20℃以下（常为0～4℃）时，D-L抗体开始结合于红细胞表面，如果有补体存在可加强其结合。当温度再增高至37℃时，补体被激活并参与反应，致使红细胞膜破损发生溶血。

（二）检验方法学

1.器材和试剂

①水浴箱；②冰箱；③试管。

2.操作

主要步骤如下：①取血约3ml，加到3只已经预温至37℃的小试管中，每管约1ml，分别标记为A、B、C；②A管血凝固后静置于37℃1小时，B管血凝固后静置于4℃1小时，C管先置于4℃30分钟，再置于37℃1小时，各管均不可搅动；③判断结果：如仅C管溶血，A、B管不溶血，结果为阳性。

（三）方法学评价

双相溶血试验主要见于阵发性冷性血红蛋白尿症（PCH）。分为直接法与间接法，其中间接法较为敏感。

（四）质量保证

1.分析前

患者准备：了解患者最近是否有溶血发作，如患者近期处于溶血发作，由于补体消耗，可得出假阴性结果。

2.分析中

不宜使用抗凝血，以玻璃珠去纤维蛋白。

3.分析后

确认检测过程正确无误，并结合患者病史和用药史以及其他检测结果等综合分析，及时与临床医生进行沟通，保证检测结果的正确性。

（五）参考区间

阴性。

（六）临床意义

1.冷热溶血素试验是诊断阵发性冷性血红蛋白尿症（PCH）的主要指标。这种罕见的自身免疫性溶血是起因于存在血液P抗原组冷反应抗体IgG介导的红细胞破坏。这种非凝集的自身IgG能有效地激活补体，而发生血管内溶血。

2.阳性反应主要见于阵发性寒冷性血红蛋白尿，冷热溶血素试验是确诊阵发性寒冷性血红蛋白尿最有用的试验。

3.在某些相关疾病的各种阶段和病理生理反应时都会有冷热溶血素试验的阳性，如三期梅毒，传染性单核细胞增多症，麻疹和流行性腮腺炎。

六、酸溶血试验

PNH是一种后天获得性红细胞膜缺陷引起的溶血病，临床上可表现血管内溶血、栓塞、全血细胞减少等，有时可出现骨髓衰竭。酸溶血试验（Ham test）为其经典的诊断方法。

（一）检验原理

PNH患者红细胞由于自身缺陷，对补体敏感性增高，在酸化的正常血清中（pH 6.6～6.8）经37℃孵育，易破坏溶血。如血清经56℃加热30分钟，使补体灭活，患者红细胞不溶解。

（二）检验方法学

1.器材和试剂

①0.2mol/L盐酸；②0.9%生理盐水；③试管；④离心机；⑤水浴箱；⑥冰箱。

2.操作主要步骤

①红细胞的处理，取患者及正常同型对照者不抗凝全血5ml置入离心管内，用玻璃珠搅动以脱去纤维蛋白。加入3倍生理盐水洗涤，再离心5分钟后去上清，重复洗涤红细胞3次，最后1次洗涤红细胞后，尽量弃上清液，按压实红细胞，加入等体积的生理盐水，配成50%的红细胞悬液。②取正常人不抗凝全血10ml置于37℃水浴，待自然分离后，以2 500r/min离心10分钟，分离血清。③取2支试管，分别标明测定管和对照管，分别加入正常人血清0.5ml。④在测定管中加入患者50%的红细胞悬液0.025ml，对照管中加入正常人50%的红细胞悬液0.025ml。⑤两管中分别加入0.2mol/L盐酸0.05ml；将管口用封口膜封口后，置于37℃水浴箱中孵育1小时。⑥判断结果：对照管不溶血，测定管溶血为阳性；测定管不溶血为阴性。

（三）方法学评价

酸溶血试验操作简单，特异性强，为PNH最为经典的诊断方法。但该试验敏感性较差，不利于PNH的早期诊断。随着流式细胞术及PCR技术的发展与应用，CD55，CD59及造血干细胞糖化肌醇磷脂基因（PIG-A）突变的检测已成为确诊PNH的主要手段，但CD55，CD59及PIG-A基因突变的检测需专用的设备和技术。对基层单位而言，酸溶血试验仍不失为PNH较为理想的诊断方法，与尿含铁血黄素试验联合应用，对PNH的诊断具有较高的意义。

（四）质量保证

1.分析前

标本采集顺利，混匀时动作轻柔，避免发生溶血以免影响结果判断；一切用具要干燥，避免溶血。

2.分析中

抗凝剂可影响血液pH，均不宜采用，但可用脱纤维蛋白全血；酸化后的试管必须封口后孵育。

3.分析后

确认检测过程正确无误，并结合患者病史及其他检测结果等综合分析，及时与临床医生进行沟通，保证检测结果的正确性。

（五）参考区间

阴性。

（六）临床意义

1.本试验阳性结果主要见于阵发性睡眠性血红蛋白尿症的患者。

2.本试验为阴性结果时也不能排除阵发性睡眠性血红蛋白尿症，当发生严重的溶血后，补体敏感细胞比例下降，可以导致本试验阴性。

3.骨髓增生不良时，补体敏感细胞生成减少，可导致本试验假阴性。

七、尿含铁血黄素试验

当血管内红细胞被大量破坏（即溶血）时，产生过多的血红蛋白，血红蛋白从肾脏滤出，大部分从尿中排出，即为尿含铁血黄素。

（一）检验原理

尿含铁血黄素试验（rous test）原理：当血红蛋白通过肾滤过时，部分铁离子以含铁血黄素的形式沉积于上皮细胞，并随尿液排出。尿中含铁血黄素是不稳定的铁蛋白聚合体，其中的高铁离子与亚铁氰化钾作用，在酸性环境下产生普鲁士蓝色的亚铁氰化铁沉淀。尿沉渣肾小管细胞内外可见直径1～3μm 的蓝色颗粒。

（二）检验方法学

1.器材和试剂

①亚铁氰化钾溶液：200g/L亚铁氰化钾5份和浓盐酸1份混合，按需要量临时配制；若出现白色浑浊，则以3 000r/min离心10分钟，取上清液应用。②盐酸溶液：取2ml浓盐酸与98ml蒸馏水混合。

2.操作主要步骤

①标本采集：新鲜尿液10ml于尿试管中；②将标本以2 000r/min离心5分钟，弃去上清液；③在沉淀中加入20g/L亚铁氰化钾溶液和盐酸溶液各2ml，混匀后室温下静置15分钟；④再以2 000r/min离心5分钟，弃去上清液，取沉淀物滴片，加盖片后，以油镜观察；⑤判断结果：有分散或成堆蓝色颗粒（直径1～3μm），尤其存在于细胞内，为阳性。

（三）方法学评价

尿含铁血黄素试验是PNH传统的检测方法，该方法简单易行，与酸溶血试验等联合检测，对PNH的诊断具有较高的意义。

（四）质量保证

1.分析前

最好取患者晨尿，以提高阳性率；试剂开启后需在规定条件下保存和使用。所有器材必须不含铁，否则可造成假阳性结果。

2.分析中

试剂必须新鲜配制，同时应作阴性对照；标本在放置时，建议以封口膜封口以免污染。

3.分析后

确认检测过程正确无误，并结合患者病史及其他检测结果等综合分析，及时与临床医生进行沟通，保证检测结果的正确性。

（五）参考区间

阴性。

（六）临床意义

Rous试验阳性提示慢性血管内溶血，尿中有铁排出。无论有无血红蛋白尿，只要存在慢性血管内溶血如PNH，本试验结果即呈阳性，并可持续数周。但在溶血初期，虽然有血红蛋白尿，上皮细胞内尚未形成可检出的含铁血黄素，此时本试验可呈阴性反应。

八、血细胞膜CD55和CD59检测

PNH是一种后天获得性溶血性疾病。近年研究发现，该病是患者造血干细胞磷脂酰肌醇聚糖A（phosphatidylinositolglycan complementation class A，PIC-A）基因突变，使血细胞膜上多种糖化磷脂酰肌醇（glycosyl-phosphatidyl inositol，GPI）锚蛋白缺失，引起红细胞对补体敏感性增加而造成溶血。目前已发现10余种GPI锚蛋白缺乏可能与PNH发病有关，其中以衰变加速因子（decay accelerating factor，DAF，CD55）和膜反应溶解抑制物（membrane inhibitor of reactive lysis，MIRL，CD59）最为重要。CD55可加速补体C3转化酶的衰变，从而抑制补体C3的激活，CD59通过与补体C8、C9结合，抑制膜攻击复合物的形成，两者缺乏均易引起PNH的异常红细胞对补体敏感性增高而引起溶血。

（一）检验原理

利用免疫荧光染色标记针对CD55、CD59的单克隆抗体，与红细胞和中性粒细胞膜上的CD55、CD59特异性结合，通过流式细胞仪检测，测定细胞散射光和激发的荧光，检测红细胞和中性粒细胞膜上CD55、CD59表达的数量。

（二）检验方法学

1.器材和试剂

①抗体：CD55-PE；CD59-FITC；②溶血素FACS Lysing Solution 10X；③磷酸二氢钾；④磷酸氢二钠；⑤0.9%氯化钠；⑥含0.5% BSA的PBS；⑦流式细胞仪；⑧试管；⑨离心机。

2.操作

主要步骤如下。

（1）红细胞CD55/CD99检测：

在试管中加入全血5µl，生理盐水 100µl和 CD55-PE、CD59-FITC 各 20µl，室温下避光孵育30分钟；悬浮细胞，补足0.5ml生理盐水，上机检测。

（2）粒细胞CD55/CD99检测：

①在试管中加入全血或骨髓100µl。②加2ml 1X Lysing Solution，混匀，室温下避光5～10分钟，离心5分钟，1 200r/min。③悬浮细胞，加1X PBS（含0.5% BSA）洗涤，离心5分钟，1 200r/min。④悬浮细胞，加CD55-PE、CD59-FITC各20µl，室温下避光孵育30分钟。⑤悬浮细胞，加1X PBS（含0.5% BSA）洗涤，离心5分钟，1 200r/min。⑥悬浮细胞，补足0.5ml生理盐水，上机检测。

（3）样本检测：

①开机预热5分钟后联机，以荧光微球作为标准样品调整仪器，使得CV ＜ 2%，保证仪器的最佳工作状态。②进行荧光补偿调整，减去荧光信号重叠。③通过FSC和SSC光散射“门”收集50 000个红细胞，10 000个中性粒细胞。④判断结果：经FITC或PE荧光直方图分析红细胞及中性粒细胞上CD55、CD59的表达。

（三）方法学评价

用流式细胞仪检测CD55和CD59等GPI锚连接蛋白有助于早期诊断PNH。双色荧光流式细胞术检测PNH及其他血液病患者红细胞上的CD55和CD59，当PNH患者的CD59阴性细胞占3%以上时即可检出，其敏感性较高。

外周血红细胞CD55/C59，其优点主要在于可确定GPI-AP缺乏的程度，进而对PNH细胞进行分期（Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型PNH细胞），缺点在于PNH患者红细胞的寿命较正常红细胞缩短，从而使检测敏感性下降，且不能排除先天性CD55、CD59缺陷；联合外周血中性粒细胞表面CD59、CD24、CD16等的检测，有助于提高PNH诊断的特异性及敏感性。

（四）质量保证

1.分析前

防止患者标本溶血；严重溶血期后，GPI缺乏的红细胞可能会极度减少，甚至可能下降到检测限以下；如果患者在检测前有多次输血，PNH筛查可以收到输血的影响，导致错误结果；患者如果有严重的再生障碍性贫血，可以导致粒细胞数目减低，不够检测分析；试剂开启后需在规定条件下保存和使用。

2.分析中

至少两种 GPI相关抗原（CD55，CD59，CD16，CD24或CD66）的缺失，才能诊断为PNH，在一些罕见的遗传性疾病中，可以有单一抗原的缺失。

3.分析后

确认检测过程正确无误，并结合患者病史以及其他检测结果等综合分析，及时与临床医生进行沟通，保证检测结果的正确性。

（五）参考区间

红细胞CD55、CD59 阳性率 ＞ 95%；粒细胞 CD55、CD59阳性率 ＞ 95%。

（六）临床意义

1.PNH患者

CD55、CD59 抗原在红细胞、粒细胞膜上减少较明显，并可见CD59在红细胞出现典型的Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ型细胞。粒细胞异常克隆比例大于红细胞异常克隆。红细胞和中性粒细胞上的CD55和CD59 表达更具有特异性和敏感性，且易于临床常规检测。同时检测红细胞和中性粒细胞上的CD55和CD59 表达情况有助于鉴别PNH和小细胞低色素性贫血。CD55、CD59 表达正常，提示患者异常细胞消失，处于临床恢复期。

2.CD55、CD59单克隆抗体检测

PNH 患者外周血的粒细胞、红细胞、淋巴细胞膜表面抗原的异常表达，可作为确诊PNH、追踪病情的可靠手段。

九、PIG-A基因突变检测

PIG-A基因位于X染色体（Xp22.1），由6个外显子组成，全长17kb。PIG-A的cDNA编码区有1 452bp，编码484个氨基酸，起始密码子位于第二号外显子的5′端，终止密码子位于第六号外显子的5′端。PIG-A基因编码-αl-6N-乙酰氨基葡萄糖转移酶的一个亚基，此酶的作用是在内质网膜上将UDP-N-乙酰氨基葡萄糖中的N-乙酰氨基葡萄糖转移至肌醇，形成磷脂酰肌醇，这是合成糖基化磷脂酰肌醇分子（GPI）的第一步反应，同时也是整个反应链的限速步骤。内质网合成的多种蛋白需要借助于GPI转移并锚定在细胞膜表面。PNH是由于造血干细胞的PIG-A基因发生突变使上述转移酶功能受到影响，进而GPI合成障碍，导致血液细胞膜表面包括膜保护蛋白在内的多种锚定蛋白缺失，最终产生溶血等临床症状。

迄今为止，PNH患者中已经报道了100多种PIG-A基因的突变，没有发现突变热点。该基因的6个外显子均有可能发生突变，但发生突变最多的是第2外显子，可能与第2外显子为PIG-A基因较大的外显子有关。大部分突变为单个碱基的突变，如插入、缺失、替换等。

（一）检验原理

聚合酶链反应（PCR）是一种在体外特异性扩增DNA片段的技术。设计特定的PIG-A基因引物，将PIG-A基因在体外扩增后，分析扩增产物的序列，可以了解PIG-A是否存在突变及突变类型。

（二）检验方法学

1.器材和试剂

①淋巴细胞分离液；②磷酸盐缓冲液（PBS）：氯化钠8g，氯化钾0.2g，磷酸氢二钠1.56g，磷酸二氢钾0.2g，加水至1L；③红细胞裂解液；④DEPC水，TRIzol，无水乙醇；⑤MMLV cDNA合成试剂盒；⑥PCR试剂盒；⑦ PCR 引物：上游引物：5′-ACA TTT ACC AGC TCT CTC AGT GC-3′，下游引物：5′-TTC AGT GCT GCT CTT AGT ACA G-3′产物片段长度为442bp；⑧超净工作台，PCR扩增仪。

2.操作

主要步骤如下。

（1）骨髓单个核细胞的分离：

取患者骨髓或外周血5ml，EDTA或枸橼酸抗凝，5ml淋巴细胞分离液中加入5ml过滤后骨髓液，2 000rpm离心20分钟，吸取中间白膜层，PBS洗涤2次，加入溶血素1ml，室温避光10分钟，1 500rmp离心5分钟，PBS洗涤2次，计数细胞数。

（2）总RNA的提取：

将骨髓单个核细胞转移至DEPC处理后的EP管中，PBS洗涤1次，加入1ml Trizol，彻底混匀后室温放置5分钟。向EP管中加入200µl氯仿，剧烈振动混匀至乳糜状，室温放置2～3分钟。4℃12 000r/min离心15分钟；轻轻吸出上层水相转移至新的DEPC处理后的EP管中，加入 4℃异丙醇 600µl，-20℃静置 30 分钟，4℃ 12 000r/min离心30分钟。弃上清液，加入1ml 75%冰乙醇洗涤沉淀，4℃7 500r/min离心10分钟。弃上清液，放置干燥10分钟，使RNA沉淀干燥。加入12µl DEPC水溶解RNA。

（3）逆转录合成cDNA：

RNA产物按照MMLV cDNA试剂盒说明书进行逆转录：取2µl RNA产物，加入Oligo（dT）0.5μg，DEPC 水补充至 12µl，70℃水浴 5分钟，立即置于冰上，依次加入5×RT-Buffer 4µl、RNA酶抑制剂20U、10mmol/L dNTP 2µl，37℃水浴 5分钟，加入 MMLV 逆转录酶 200U，反应总体积20µl，42℃水浴1小时，70℃ 10分钟结束逆转录。

（4）DNA扩增：

PCR扩增管内依次加入10×PCR Buffer 5µl、dNTP 5µl、上、下游引物各2µl、MgCl₂ 3µl、cDNA模板4µl、Tag酶0.8µl，灭菌去离子水补足至 50µl体积。

（5）扩增条件：

94℃变性3分钟，94℃变性30秒，58℃退火40秒，72℃延伸60秒，40个循环。

（6）判断结果：

将扩增产物直接进行DNA测序，检测PIG-A基因的突变形式，应用软件分析突变结果。

（三）方法学评价

PIG-A基因突变的检测方法有单链构象多态性（SSCP）、序列分析等多种分析方法。序列分析法检测PIG-A基因突变具有较高的敏感性及特异性，检测到PIG-A基因突变不能确诊PNH，说明患者存在PNH克隆，可以对PNH克隆的性质加以判断。流式细胞术定量检测CD55、CD59结合PIG-A基因突变分析可更好地判断PNH克隆的情况，并对PNH和其他骨髓增殖性疾病的诊断及鉴别诊断有较高价值。

（四）质量保证

1.分析前

肝素在PCR反应过程有抑制作用，因此最好用EDTA抗凝管。

2.分析中

骨髓或外周血中RNA易降解，应当在24小时内提取RNA。细胞加入Trizol试剂后可以冻至-80℃低温冰箱中保存1年；细胞与Trizol之间的比例要合适，1ml Trizol适合于提取1×107的细胞，Trizol抽吸一定要充分，以保证RNA纯度；提取RNA时应避免RNase对RNA的降解。RNA抽提的整个过程中都应戴一次性手套并勤换手套；实验室用的普通玻璃器皿经250℃干烤4小时；试剂从冰箱内取出后应当充分溶解并混匀；有关试剂可以小管分装，-20℃保存，避免反复使用造成污染；逆转录时，模板RNA量不宜过多；标本进行逆转录反应时需要设立阴性对照；在PCR反应中最后加入模板；小心加入模板，防止形成气泡污染其他反应管；标本进行PCR反应时需要设立阴性、阳性对照。

3.分析后

确认检测过程正确无误，并结合患者病史及其他检测结果等综合分析，及时与临床医生进行沟通，保证检测结果的正确性。

（五）参考区间

极少数正常人中可检测出PIG-A基因突变。

（六）临床意义

目前，已经报道了170多种PIG-A基因突变，其中3/4的突变导致PIG-A基因的功能完全丧失，1/4的突变则保留了PIG-A基因的功能。但PNH的发生仅仅有PIG-A基因突变还不够，还必须有PNH克隆的生长优势（即所谓的“双重致病”学说）。因此，仅检测到PIG-A基因突变不能确诊PNH，只能说明患者存在PNH克隆。

（唐元艳　王昌富）