第三节　红细胞膜病检验技术

红细胞膜主要由蛋白质，脂类和糖类组成。红细胞膜以双层脂质分子为主体，蛋白质镶嵌其中，糖类多结合于膜外表面。红细胞膜维持着红细胞正常的双凹圆盘结构、柔韧性以及变形性，沟通细胞内外的分子转运和信息传递，发挥细胞识别和免疫作用。

红细胞膜蛋白根据其穿膜与否可分为整合蛋白和外周蛋白。整合蛋白牢固地包埋或贯穿于脂质双分子层中，主要包括带3蛋白和血型糖蛋白。带3蛋白与膜的渗透脆性、结构完整性等生理活性有关。血型糖蛋白可与带4.1蛋白及蛋白P55结合成复合物，在调节细胞的稳定性、变形性和细胞膜形状中起着十分重要的作用。外周蛋白主要包括收缩蛋白（带1、2蛋白）、锚蛋白（带2.1蛋白）、带4.1蛋白、带4.2蛋白、束蛋白（带4.9蛋白）、带5蛋白及少量其他蛋白，如带2.2蛋白、带3a蛋白、带6蛋白及带7蛋白等。其中带4.1蛋白是维持红细胞形状和控制膜的机械特性如变形性和稳定性等基本的蛋白，该蛋白缺陷可以导致红细胞膜变得不稳定，可出现球形变或椭圆形变。带4.2蛋白与红细胞的形态、可变形性及携氧功能密切相关，带4.2蛋白缺失可引起球形或椭圆形红细胞增多症及不同程度的溶血性贫血。

红细胞膜脂质约占膜总质量的43%，排列成厚7.5～9.0nm的双分子层，红细胞膜内外两层脂质的分布是非对称性的，其中外层主要由含胆碱的磷脂酰胆碱（PC）和神经鞘磷脂（SM）组成，而内层主要由含氨基的磷脂酰丝氨酸（PS）和磷脂酰乙醇胺（PE）构成。

红细胞膜缺陷的原因包括外在和内在因素两种，外在因素如物理、化学或免疫等损伤，内在因素即为红细胞膜蛋白质和脂质成分和/或功能发生异常。上述两种因素均可导致红细胞膜的破裂。临床上，红细胞渗透脆性试验，酸化甘油溶解试验，自身溶血试验等方法是诊断红细胞膜病（red cell membrane disorders）的常用检验技术。近年来，随着蛋白质组学及分子生物学的发展，从蛋白质和基因水平对红细胞膜及红细胞膜病有了进一步的研究。

一、红细胞渗透脆性试验

将红细胞置于低渗溶液中，因细胞内外渗透压差的原因，水分子进入红细胞，使其发生肿胀，乃至红细胞破裂而发生溶血。红细胞在低渗盐溶液中出现溶血的特性，叫作红细胞渗透脆性（osmotic fragility）。

（一）检验原理

不同浓度的低渗液对红细胞的影响不同，在0.6%～0.8%NaCl溶液中，红细胞发生一定程度的膨胀，当浓度降低到0.42%～0.46%时，部分红细胞破裂，浓度为0.34%～0.32%时，全部红细胞破裂，发生完全溶血。

（二）检验方法学

1.器材和试剂

①171mmol/l氯化钠溶液：称取经120℃恒重的分析纯氯化钠1.00g，加少量蒸馏水溶解后，转入100ml容量瓶中用蒸馏水定容。②小试管。

2.操作

主要步骤如下。

准备24支小试管（1×8cm），分成两排竖立于试管架上，前排用作检查患者，后排用作正常对照。分别按表5-3加入171mmol/l氯化钠溶液和蒸馏水。

取患者静脉血1ml，不取下针头，当即在前排每试管内加血1滴，滴完后，将每试管轻轻倾倒一次（由低浓度的试管开始），使血与盐水混匀。正常对照管如法操作。

将各试管置于4℃冰箱内2小时后取出观察结果。

判断结果：试管内液体完全变成透明红色，说明红细胞完全破裂溶血，引起红细胞最先出现完全溶血的盐溶液浓度为红细胞对低渗盐溶液的最大抵抗力；试管下层为混浊红色，管底有少量沉淀（红细胞），而上层出现透明红色，表示部分红细胞破裂溶血，开始出现部分溶血时的盐溶液浓度为红细胞对低渗盐溶液的最小抵抗力；试管下层为混浊红色，管底有多量红细胞成点，上层无色，这表示红细胞没有溶解。

（三）方法学评价

目前临床上常用的红细胞渗透脆性试验，为改良Sanford法，又称简易半定量法。此外还有Dacie法和红细胞机械脆性试验两种方法，目前临床上较少用。

（四）质量保证

1.分析前

以非抗凝血为最佳，如选用抗凝剂应用肝素，不能用枸橼酸盐、草酸盐和EDTA盐抗凝，以免增加离子浓度，改变溶液渗透压。如用上述抗凝剂抗凝，应先用生理盐水洗涤一次后，配成50%的红细胞悬液进行检查；标本采集顺利，混匀时动作轻柔，避免发生溶血和破坏红细胞。

2.分析中

氯化钠必须干燥，称量精确，用前现配；每次实验均要有正常对照，被检者与正常对照者开始溶血的溶度相差0.4g/L即有诊断价值；室温静置2小时后观察结果，先从高浓度观察，上层初现透明红色为开始溶血管，溶液透明深红色、管底红细胞完全消失者为完全溶血管。如不易判断可低速离心1分钟后观察；黄疸患者结果常较难判断，可先用生理盐水洗涤一次后，配成50%的红细胞悬液进行实验；所用器材必须清洁、干燥，避免引起其他异物影响所致溶血；血与NaCl比值为1：25，血必须直接注入试剂中，不可沿着管壁，注入速度要慢。

3.分析后

确认检测过程正确无误，并结合患者病史和用药史以及其他检测结果等综合分析，及时与临床医生进行沟通，保证检测结果的正确性。

（五）参考区间

开始溶血0.42%～0.46%（NaCl液），完全溶血0.28%～0.32%（NaCl液）。

（六）临床意义

1.红细胞渗透脆性增加

见于遗传性球形红细胞增多症、自身免疫性溶血性贫血和遗传性椭圆形细胞增多症。

2.红细胞渗透脆性减低

见于缺铁性贫血、地中海贫血以及阻塞性黄疸等。

二、温育渗透脆性试验

将血液在37℃条件下温育24小时，红细胞的渗透脆性将显著增加，从而导致红细胞渗透脆性增高。在遗传性球形红细胞增多症患者的球形红细胞中表现得更加明显。

（一）检验原理

将血液置于37℃温育24小时，由于红细胞的代谢，使能源葡萄糖消耗，ATP减少，导致需要能量的红细胞膜对阳离子的主动转运受阻，钠离子在红细胞内聚集，细胞肿胀，温育渗透脆性增加。红细胞膜或某些酶缺陷的红细胞能源耗尽，温育渗透脆性明显增加。

（二）检验方法学

1.器材和试剂

①氯化钠磷酸盐缓冲液（pH 7.4）：称取恒重的分析纯氯化钠9.00g，磷酸氢二钠1.365g（或Na₂HPO₄·2H₂O 1.712g），磷酸二氢钠 0.184g（或 NaH₂PO₄·2H₂O 0.243g），加少量蒸馏水溶解后，转入1 000ml容量瓶中定容；②分光光度计；③试管；④离心机；⑤水浴箱。

2.操作

主要步骤为：抽取静脉血2ml，注入无菌肝素抗凝管中，加塞置于37℃温育24小时；分别取氯化钠磷酸盐缓冲液和蒸馏水，按表5-4加入各试管中。

每管加入温育后的肝素抗凝血0.05ml，颠倒混匀，放置室温30分钟。

将各管摇匀，然后以2 000r/min离心10分钟，取上清液以波长540nm比色，以氯化钠磷酸盐缓冲液为空白管，17.1mmol/L氯化钠溶液为完全溶血管。分别读取各管吸光度（A）值，并计算其溶血百分率。

红细胞中间脆性（MCF）：以不同浓度氯化钠为横坐标，相应溶血百分率为纵坐标曲线，即为红细胞盐水渗透脆性曲线。50%溶血的氯化钠浓度为红细胞中间脆性（MCF）。

判断结果：

（三）方法学评价

红细胞温育渗透脆性试验被认为是诊断遗传性球形红细胞增多症的金指标，尤其是对有不明原因贫血家族史患者。37℃孵育24小时后，遗传性球形红细胞增多症患者红细胞渗透脆性增加，开始溶血时NaCl浓度较正常对照高出0.08%则为阳性。但红细胞渗透脆性试验的敏感性较低，部分患者红细胞经温育后渗透脆性可不增加。

（四）质量保证

1.分析前

温育红细胞所用试剂及器材均应无菌；标本采集顺利，混匀时动作轻柔，避免发生溶血和破坏红细胞，采集后尽快送检；氯化钠的纯度很重要，含杂质时可以导致溶血。

2.分析中

试管应加塞，操作时应防止污染；pH和温度应当恒定，有变化时可以影响结果判断；配制氯化钠磷酸盐缓冲液时，注意化学试剂的结晶水不同而调整用量。

3.分析后

确认检测过程正确无误，并结合患者病史和用药史以及其他检测结果等综合分析，及时与临床医生进行沟通，保证检测结果的正确性。

（五）参考区间

未温育50%溶血为4.0～4.45g NaCl/L；37℃温育24小时50%溶血为4.65～5.9g NaCl/L。

（六）临床意义

1.红细胞渗透脆性增加

见于遗传性球形红细胞增多症、自身免疫性溶血性贫血和遗传性椭圆形细胞增多症。

2.红细胞渗透脆性减低

见于缺铁性贫血、地中海贫血等。

三、酸化甘油溶解试验

在微酸性含甘油的缓冲液中，由于甘油与膜脂质的亲和性等能提取膜脂质或与它起化学反应，使红细胞膜减少，从而导致红细胞发生缓慢溶血，并随细胞溶解的增加出现光密度逐渐下降。遗传性球形红细胞增多症患者红细胞膜脂质减少，表面积/体积的比值降低，细胞球形化和膜代谢异常，加入酸化甘油缓冲液后，膜脂质进一步减少，加速了表面积减少，细胞球形化和膜代谢异常的过程，因而溶血加速。

（一）检验原理

在20～28℃时，正常红细胞加入酸化甘油后会缓慢溶血而出现光密度下降。光密度下降为起始光密度一半时所需时间即为酸化甘油溶解试验（AGLT₅₀）。遗传性球形红细胞增多症患者红细胞的AGLT₅₀较正常缩短。

（二）检验方法学

1.器材和试剂

①0.1mmol/L磷酸盐缓冲液：称取经0.1mmol/L磷酸氢二钠溶液49ml和0.1mmol/L磷酸二氢钾51ml混匀，调节pH至6.85，每10ml分装，-20℃保存。②等渗磷酸缓冲盐液：取0.1mmol/L磷酸缓冲液10ml和0.154mmol/L氯化钠溶液90ml混合，4℃可保存一周。③0.3mol/L甘油试剂：取纯甘油1.1ml加入等渗磷酸缓冲盐液16ml，混匀后转入50ml容量瓶中，用蒸馏水定容，4℃可保存1个月。④自动控温的分光光度计或生化分析仪。⑤试管。⑥冰箱。

2.操作

主要步骤如下：

开启分光光度计，预热20分钟，使得温度准确，读数稳定；试剂置于25℃水浴平衡20分钟。

取离体4～8小时肝素抗凝血20μl，加入5ml等渗磷酸缓冲盐液中，配成红细胞悬液，其浓度以起始吸光度0.40～0.60为宜。

取3ml等渗磷酸缓冲盐液比色调零，温度25℃，波长625nm，光径1.0cm。

判断结果：取0.3mmol/L甘油试剂加入另一光径1.0cm比色皿中，再取已配制的红细胞悬液10ml吹入甘油试剂中，同时开启秒表，快速颠倒混合两次后测起始吸光度（10秒时），此后每间隔20秒，至290秒连续读取吸光度并记录之。以起始吸光度值下降一半的时间记为AGLT₅₀结果。

（三）方法学评价

酸化甘油溶解试验较红细胞渗透脆性试验在遗传性球形红细胞增多症的诊断中更为灵敏、可靠且简便，可以检测出渗透脆性试验阴性的患者。本试验中，选取AGLT₅₀较AGLT₁₀对于疾病的诊断更为敏感。在检测过程当中应当严格控制温度和标本放置的时间以及缓冲液的pH，才可获得较为准确的结果。

（四）质量保证

1.分析前

标本采集顺利，混匀时动作轻柔，避免发生溶血和破坏红细胞；标本采集后在室温静置4～8小时，静置时间不足容易出现中间值。

2.分析中

控制实验温度为（25±2）℃，温度过高AGLT50太长，吸光度变化慢，不便于观察；温度低于20℃，则AGLT50缩短，出现假阳性；不宜采用白色瓶装甘油，易致假阳性；试验中应做正常对照；酸化甘油试剂的pH 6.85为宜，pH的改变会导致红细胞膜电荷的改变，相互间的排斥力减弱，易聚集而加速沉降。

3.分析后

确认检测过程正确无误，并结合患者病史及其他检测结果等综合分析，及时与临床医生进行沟通，保证检测结果的正确性。

（五）参考区间

AGLT₅₀ ＞ 290s。

（六）临床意义

遗传性球形红细胞增多症及其无症状携带者，AGLT₅₀缩短。部分自身免疫性溶血性贫血患者可以有异常。

四、自身溶血试验

体外将红细胞置37℃环境中孵育48小时后可导致溶血，称为自身溶血试验（autohemolysis test）。在孵育时，加入葡萄糖或腺苷三磷酸（ATP）作为纠正物，观察溶血可否有一定的纠正，称为纠正试验。

（一）检验原理

血液经37℃温育48小时，红细胞膜异常可致钠离子内流倾向明显增加，ATP消耗过多，或糖酵解途径酶缺乏所引起ATP生成不足，导致产生轻微溶血；某些红细胞膜和酶缺陷患者溶血程度增高。如果溶血被葡萄糖或/和腺苷三磷酸（ATP）所纠正，有助于鉴别贫血类型。

（二）检验方法学

1.器材和试剂

①100g/L葡萄糖（无菌）。②生理盐水：154mmol/L氯化钠（无菌）。③0.4mmol/L腺苷三磷酸生理盐水（无菌）：称取ATP 2.5g溶于10ml无菌生理盐水中，用无菌30g/L Tris溶液或14g/L NaHCO₃溶液调节至pH 6.8，加热消毒后备用。④HiCN稀释液。⑤分光光度计。⑥温箱。

2.操作

主要步骤如下。

取5ml肝素抗凝静脉血，按表5-5加入各试管中。

以分光光度计比色。条件：波长540nm，光径1.0cm，以空白对照调零，读取各管吸光度（A）值。

判断结果：

式中“测定管（A）值×（1-Hct）”是将测定管（A）换算成全血量时的（A）值；“×4”是由于溶血对照管稀释100倍，测定管稀释25倍的转换系数。

（三）方法学评价

该项试验是筛查和鉴别由于红细胞膜缺陷而产生溶血性贫血的较为灵敏的检查。

（四）质量保证

1.分析前

标本采集顺利，混匀时动作轻柔，避免发生溶血和破坏红细胞。

2.分析中

试剂和器材严格无菌；空白对照管溶血率应该在正常参考范围以内。

3.分析后

确认检测过程正确无误，并结合患者病史及其他检测结果等综合分析，及时与临床医生进行沟通，保证检测结果的正确性。

（五）参考区间

正常人血液在无菌条件下温育48小时后，溶血率一般 ＜ 4.0%；加葡萄糖后溶血率 ＜ 0.6%；加ATP后溶血率 ＜ 0.8%。

（六）临床意义

1.遗传性球形红细胞增多症明显增高，并可用葡萄糖和ATP纠正。

2.其他遗传性非球形红细胞溶血性贫血也可增高，并分别可被葡萄糖或ATP纠正。

3.丙酮酸激酶缺乏症、自身免疫性溶血性贫血、阵发性睡眠性血红蛋白尿症、药物性溶血等增高加葡萄糖不能纠正，加ATP能纠正。

五、红细胞膜蛋白分析

红细胞膜蛋白的组成主要包括15种蛋白，分子质量为15～250kDa。其中有3种主要的蛋白，约占膜蛋白60%以上，主要包括血影蛋白、血型糖蛋白A（glycophorin A）、带3蛋白（band 3 protein）。此外，红细胞膜蛋白还包括有肌动蛋白，带2.1蛋白，带4.1蛋白等。

（一）检验原理

十二烷基硫酸钠（SDS）与红细胞膜蛋白混合加热至100℃时，能使所有肽链之间的连接完全解离，同时肽链与SDS结合，形成SDS多肽复合物，以聚丙烯酰胺凝胶（PAG）为载体，在电场作用下，膜蛋白能分离出各种区带，由于SDS多肽复合物的迁移率一般取决于相对分子质量的大小，据此可以测定膜蛋白中的各种组分，还可以根据区带的位置推断其相对分子质量。

（二）检验方法学

1.器材和试剂

①低渗液：10mmol/L Tris-盐酸缓冲液，称取Tris 1.21g，以蒸馏水溶解并加至1L，以盐酸调节pH为7.4。②等渗液：含154mmol/L氯化钠的低渗液，称取氯化钠8.77g，以低渗液溶解并加至1L。③丙烯酰胺储存液：丙烯酰胺30g，双丙烯酰胺0.8g，以蒸馏水溶解加至100ml。④分离胶缓冲液：Tris 18.17g，SDS 0.4g，以蒸馏水溶解加至 100ml，以盐酸调节pH至8.8；浓缩胶缓冲液：Tris 6.06g，SDS 0.4g，以蒸馏水溶解加至100ml，以盐酸调节pH至6.8。⑤100g/L过硫酸铵溶液；四甲基乙二胺（TEMED）。⑥电泳缓冲液：Tris 3.03，甘氨酸 14.41g，SDS 1.0g，以蒸馏水溶解并加至1L，调节pH为8.3。⑦样品处理液：浓缩胶缓冲液25ml，甘油 20g，SDS 10g，20mmol/L EDTA（pH 7.5）5ml，饱和溴酚蓝溶液5ml，加蒸馏水至100ml。⑧蛋白染色液：考马斯亮蓝R2 500.05g，异丙醇 25ml，冰醋酸 10ml，加蒸馏水至 100ml。⑨脱色液：水：乙醇：冰醋酸= 8：3：1。⑩电泳仪，电泳槽，高速冷冻离心机。

2.操作

主要步骤如下。

（1）红细胞膜的制备：

取5ml肝素抗凝血，以2 500r/min离心5分钟，去除血浆和灰白色血细胞层。加入预冷的等渗液将沉淀红细胞悬浮，后以2 500r/min 离心5分钟，去除上清液。重复此步骤3次。沉淀红细胞按1：10加入预冷等渗液，混匀后置于4℃ 30分钟，待完全溶血。以12 000r/min 4℃离心10分钟，将沉淀按上述步骤洗涤3次，即可得到红细胞膜样品。

（2）红细胞膜蛋白电泳：

①制胶：制备分离胶：将丙烯酰胺储存液12ml、分离胶缓冲液7.5ml、蒸馏水10.2ml、过硫酸铵0.3ml和TEMED 20ul混合，立即注入电泳玻璃管内，至上端20mm处，小心加水层5mm封闭，待凝胶聚合；制备浓缩胶：将丙烯酰胺储存液1.65ml、浓缩胶缓冲液2.5ml、蒸馏水5.75ml、过硫酸铵0.1ml和TEMED 7μl混合，立即加入已倾去水层的分离胶上端，厚约10mm，再封水层，待凝胶聚合。②上样：将已加入5% β-巯基乙醇或5mmol/L二硫苏糖醇（DTT）的膜蛋白样品与样品处理液按1：1混合，置于水浴箱中煮沸5分钟，待冷却至室温后用加样枪将处理后的膜蛋白样品加入浓缩胶表面即可，20～40μl。③电泳：将电泳缓冲液倒入电泳槽中，接通电源，正极在下，负极在上，电流5～8mA/管，至溴酚蓝距管底10mm处时终止电泳。取下电泳凝胶管，用细长针头沿管内壁注入蒸馏水，使得凝胶与管壁剥离，挤出凝胶。④染色：将凝胶浸入蛋白染色液中过夜，次日以脱色液脱色，更换脱色液3次，直至本地洗脱干净、膜蛋白区带显色鲜明后，置于7%冰醋酸中。⑤检测：将染色后的凝胶照相摄影，即可得到红细胞膜蛋白区带图谱，或以吸光度扫描仪测定，计算出红细胞膜蛋白组分的百分率。

（三）方法学评价

应用聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE），可发现包括带3蛋白、4.2蛋白、血影蛋白及联合蛋白异常等，尤其是对4.2蛋白和锚蛋白的缺乏的HS患者，该方法特异性更好。但SDSPAGE用于检测少量的蛋白如锚蛋白等蛋白时，其精密度不够理想。目前临床上也采用放射免疫法或ELISA法直接测定每个红细胞的膜蛋白含量。流式细胞术筛选伊红-5-马来酰亚胺（eosin-5-maleimide，EMA）标记的红细胞作为诊断HS及研究膜蛋白缺陷的筛查试验，该方法也可以检测Rh复合物相关的膜内蛋白和带3蛋白的相对数量。

（四）质量保证

1.分析前

全部试剂需要用分析纯或优级纯。

2.分析中

制备红细胞膜是要在低温下操作，以避免细胞膜上蛋白酶对膜蛋白的水解；低渗液的pH要适当，以pH 7.4～8.0为宜，若低于7.4则不易获得白色的膜蛋白样品；根据膜蛋白各组分的分离效果，可以适当地改变丙烯酰胺浓度，凝胶聚合速度，缓冲液的离子强度和电泳时的电流强度等；滤纸盐桥要尽量缩短，以减少电阻；同时做正常人样本对照，对比观察有无异常。

3.分析后

确认检测过程正确无误，并结合患者病史及其他检测结果等综合分析，及时与临床医生进行沟通，保证检测结果的正确性。

（五）参考区间

各种膜蛋白组分百分率的参考值依据实验方法和凝胶类型以及不同地区、种族人群宜各自制定。

（六）临床意义

红细胞膜蛋白异常常见于溶血性疾病。

1.遗传性球形红细胞增多症（HS）

HS患者中常见膜蛋白带4.2蛋白减少或缺失、Sp轻至中度缺乏、锚蛋白缺乏等。此外，带4.1蛋白缺陷也是我国HS患者的其他常见病因，而欧美国家则为锚蛋白缺乏，在日本更常见带4.2蛋白缺乏。

2.遗传性椭圆形红细胞增多症（HE）

HE患者可发生带4.1蛋白缺陷、血型糖蛋白C缺陷、带3蛋白或β收缩蛋白缺陷，造成锚蛋白结合受阻。收缩蛋白突变会削弱或破坏膜骨架的二维空间水平的完整性，水平方向的膜缺陷可导致膜不稳定，造成溶血性贫血和红细胞碎片形成。

3.遗传性热异形红细胞增多症（HPP）

Sp蛋白缺乏是本病的基本病因。

六、红细胞膜磷脂分析

膜脂是细胞膜的基本组成部分，构成膜的基本骨架，维持构象并为膜蛋白行使功能提供环境，主要包括磷脂、糖脂和胆固醇。①磷脂：约占整个膜脂的50%以上。磷脂由卵磷脂、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸和鞘磷脂组成。这些磷脂并非在膜内均匀分布，在表层多含有具胆碱基的中性磷质，内层含有具负电荷的磷酯酰丝氨酸和可变结构的磷脂酰乙醇胺。②糖脂：普遍存于原核和真核细胞细胞质膜上，其含量5%以下，在神经细胞质膜上含量较高。由一个或多个糖残基代替磷脂酰胆碱而与鞘氨醇的羟基结合。③胆固醇：存在于真核细胞膜上，为双性分子，可以提高脂质双分子层的力学稳定性，调节脂质双分子层的流动性，降低水溶性物质的通透性。

（一）检验原理

高效液相色谱法（HPLC）以液体为流动相，采用高压输液系统，将具有不同极性的单一溶剂或不同比例的混合溶剂、缓冲液等流动相泵入装有固定相的色谱柱，在柱内各成分被分离后，进入检测器进行检测，从而实现对试样的分析。HPLC法一般分为正相高效液相色谱法（NP-HPLC）和反相高效液相色谱法（RP-HPLC）。利用磷脂分子的极性差异，可以使用正相高效液相色谱法，对各类磷脂组分进行分离分析，使各组分得以分离。

（二）检验方法学

1.器材和试剂

①异丙醇、三氯甲烷；②154mmol/L氯化钠溶液；③甲醇、乙腈，色谱纯；④氯仿、磷酸，优质纯；⑤标准磷脂浓度：磷脂酰胆碱（PC）、磷脂酰乙醇胺（PE）、磷脂酰丝氨酸（PS）、神经鞘磷脂（SM）；⑥高效液相色谱仪，色谱工作站，纯水仪，二元梯度泵；⑦低速离心机，超速冷冻离心机。

2.操作

主要步骤如下。

（1）红细胞膜磷脂的提取：

①取5ml肝素抗凝血，用154mmol/L氯化钠溶液洗涤3次，弃去上清液。取红细胞0.2ml加入蒸馏水0.5ml，充分摇匀，置于4℃10分钟至完全溶血。②在上述溶液中加入预冷的异丙醇5.5ml，振动摇匀后置于4℃15分钟；再取出置于室温1小时，每隔10分钟振摇一次。③加入预冷的三氯甲烷3.3ml，振动摇匀后置于4℃15分钟；再取出置于室温1小时，每隔10分钟振摇一次。④以3 000r/min离心10分钟，吸出全部上清液，转入另一支试管中，通氮气吹干，备用。

（2）磷脂成分的分离：

①色谱条件：检测波长203nm，色谱柱，流动相为乙腈：甲醇：85%磷酸=100：3：1，流速1.5ml/min，柱压2.7×106Pa，室温下进行色谱分析。②标准品浓度（商品试剂）：磷脂酰胆碱（PC）、磷脂酰乙醇胺（PE）、磷脂酰丝氨酸（PS）、神经鞘磷脂（SM）。配制不同浓度的磷脂标准品，进行HPLC分析，作峰面积与浓度的曲线。③判断结果：采用与标准品对照保留时间的方法，确定红细胞膜上磷脂成分与含量。

（三）方法学评价

对磷脂进行分离、检测的方法有薄层色谱法、液相色谱以及磁共振法等。高效液相色谱分离磷脂可以避免破坏磷脂分子结构，得到更准确的分子结构信息，具有方便、快速、高灵敏度、无损伤的特点。高效液相色谱法可以分为正相高效液相色谱和反相高效液相色谱法。正相色谱分离磷脂的基础是磷脂各组分的极性差异，磷脂在不同类型柱子上的保留存在差异，各组分的流出顺序也不同。反相色谱分离磷脂的基础则是各磷脂组分的疏水性差异。在反相柱上分离磷脂，由于磷脂分子的异质性，一个组分会分成几个峰，给定量带来困难。但反相色谱与质谱检测器组合，可以实现磷脂的分离和痕量检测，检测限达ppm级。

（四）质量保证

1.分析前

异丙醇和三氯甲烷应当置于冰箱预冷；标本采集顺利，避免溶血。

2.分析中

制备红细胞膜是要在低温下操作，以避免细胞膜上蛋白酶对膜蛋白的水解；低渗液的pH要适当，以pH 7.4～8.0为宜；以氮气吹干膜脂提取液时，距页面1cm，不要直接接触液面或将氮气管深入提取液底部；磷脂成分的洗脱顺序受到流动相和固定相变化的影响比较显著；流动相的酸碱度对洗脱顺序影响不显著，流动相的极性对磷脂的分离有一定影响。

3.分析后

确认检测过程正确无误，并结合患者病史及其他检测结果等综合分析，及时与临床医生进行沟通，保证检测结果的正确性。

（五）参考区间

磷脂乙醇胺：26.88%±3.0%；磷脂丝氨酸：26.3%±4.8%；鞘磷脂醇：15.11%±0.26%；磷脂酰胆碱：31.96%±0.55%。

（六）临床意义

1.遗传性球形红细胞增多症红细胞膜磷脂质下降，但各成分比例不变。

2.遗传性口形红细胞增多症磷脂酰胆碱增高。

3.棘形红细胞增多症胆固醇正常或偏高，磷脂正常或稍降低。

4.珠蛋白生成障碍性贫血、遗传性非球形红细胞溶血性贫血和肝病患者磷脂酰乙醇胺含量减低，磷脂酰胆碱含量增高。

七、红细胞膜病分子诊断试验

遗传性红细胞膜病，包括遗传性球形细胞增多症（hereditary spherocytosis，HS）、遗传性椭圆形细胞增多症（hereditary elliptocytosis，HE）、遗传性热异形细胞增多症（HPP）、东南亚卵圆形细胞增多症（SAO）和遗传性口形细胞增多症（HSt）等。这些疾病大多具有临床和实验室的异质性，分子诊断试验对本病的诊断具有重要意义（表5-6）。

1.遗传性球形细胞增多症（HS）

75%的HS为常染色体显性遗传，大约25%的病例没有家族史，这些病例可表现为自发突变或隐性发病。其主要的分子缺陷在于红细胞膜，尤其是膜骨架和脂质双层间垂直方向交互作用的蛋白。大多数HS病例的基因突变发生在ANKl，SPTB，SLC4A1，EPB42和SPTA1，分别编码锚蛋白，β收缩蛋白，带3蛋白，4.2蛋白和a收缩蛋白。

通过膜蛋白缺陷相应的基因分析，目前已确定了12个锚蛋白-1的突变。在带3蛋白基因，发现了11个突变（3个移码突变和8个错义突变）。其中，带3蛋白等位基因Okinawa，包含有2个突变即MemphisⅡ多态性（K56E，AAG→GAG，和P854L，CCG→CTG），以及G714R，GGG→AGG突变，位于跨膜片段9。后者的变化和HS有关。等位基因Fukuoka：G130R，GGA→AGA，则改变了4.2蛋白和带3蛋白的结合。在红细胞的前体细胞，带3蛋白Okinawa结合所有的4.2蛋白，而带3蛋白Fukuoka则不具备此功能。

HS的遗传学异常和红细胞膜表型超微结构的异常相关。锚蛋白突变主要和骨架网络的断裂有关；带3蛋白突变（伴移码突变的带3蛋白Kagoshima）被证实和膜内部微粒（IMPs）的异常有关；4.2蛋白突变（纯合型4.2蛋白Nippon）造成4.2蛋白的完全缺陷，显示了骨架网络和IMPs的异常。目前应用于遗传性球形红细胞的分子诊断有以下几种：

（1）细胞膜蛋白的测定：

应用聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDSPAGE），可发现包括带3蛋白、4.2蛋白、血影蛋白及联合蛋白异常等。尤其是对4.2蛋白和锚蛋白的缺乏的HS患者，特异性更好。虽然SDS-PAGE对红细胞膜缺陷的诊断意义很大，但是由于SDS-PAGE测定膜蛋白不够精确，尤其是用于测定少量的蛋白如锚蛋白等，结果不够理想。另外，带3蛋白和4.2蛋白的降低也可影响锚蛋白电泳带含量。目前临床上也采用放射免疫法或ELISA法直接测定每个红细胞的膜蛋白含量。

（2）流式细胞术：

伊红-5-马来酰亚胺（eosin-5-maleimide，EMA）荧光染色，伊红-5-马来酰亚胺（eosin-5-maleimide，EMA）是一种荧光染料，与红细胞孵育后，可在完整红细胞外表面与跨膜蛋白共价结合，主要与红细胞膜中的带3蛋白、Rh多肽、RhAG和CD47结合，是诊断HS的良好指标。EMA 提供定量分析有利于辨别阳性结果和阴性结果，阳性结果主要表现为平均荧光强度（percentage of the mean channel fluorescence，MCF）的百分比减少，MCF=（正常对照平均荧光强度-受试者荧光强度值）×100/正常对照平均荧光强度，所有正常对照样本应选择血红蛋白含量正常的血液样本，且MCV的标准差应控制在2fl左右。该方法可以检测Rh相关的膜内蛋白和带3蛋白的相对数量，其中检测带3蛋白缺陷的敏感度为92.7%，特异性为99.1%。

（3）分子细胞遗传技术：

HS患者膜蛋白缺陷通常由其编码基因异常造成。通过相关分子生物学技术，如限制性片段长度多态性连锁分析或者串联重复序列分析可确定HS和某个基因的相关性，用单链构象多态性分析PCR（PCR-SSCP）、实时荧光定量PCR、PCR结合核苷酸测序等方法可以测定膜蛋白基因突变位点。变性高效液相色谱分析（DHPLC）对单个核苷酸变异的检出率较SSCP高，且较直接DNA测序具有高敏感性、效率高、费用低等优势。

2.遗传性椭圆形细胞增多症（HE）

HE是一种以外周血象中出现椭圆形、雪茄形红细胞为特征的遗传性红细胞膜病。HE主要的缺陷在于α收缩蛋白，β收缩蛋白，或4.1蛋白。

已发现有大约20种β收缩蛋白的突变可以导致HE的发生。包括β收缩蛋白基因小的缺失或插入导致的移码突变和提前终止，这些可发生在收缩蛋白Napoli、Nice、Tandil和Tokyo；收缩蛋白Nagoya的LePuy突变、Rouen突变和一个无义突变造成D收缩蛋白肽链缩短；G收缩蛋白错义突变发生在收缩蛋白 Buffalo、Cagliari、Cosenza、Cotonou、Kayes、Linguere、Paris和Providence，氨基酸替换既可破坏三螺旋结构形成收缩蛋白二聚体自我连接位点，又可以影响对交互作用至关重要的残基。

在HE中已发现的α收缩蛋白至少有30种突变。大多数的突变是靠近二聚体自我连接位点的单一氨基酸替换。包括收缩蛋白 Alexandria，Anatasia，Barcelona，Genova，Lograno，Marseilles；其他的还有肽链小片段的框内缺失。收缩蛋白Sfax的一个剪接位点突变导致第4个重复序列上的9个氨基酸缺失；收缩蛋白Dayton是在α收缩蛋白基因的一个漂移DNA成分导致的第2个重复序列上49个残基的缺失。这些突变可能阻止了α收缩蛋白肽链的折叠并干扰了Q收缩蛋白和β收缩蛋白的相互作用。带4.1蛋白缺陷的发生率在HE患者中远较收缩蛋白缺陷的发生率低。杂合缺陷者常见于一些阿拉伯和欧洲人种，导致蛋白的部分缺陷从而引起轻度溶血，甚至不发生溶血，而外周血涂片中可见明显的椭圆形细胞增多；纯合缺陷则引起蛋白的完全缺陷从而引起显著的溶血。EPB41基因下游起始位点的错义突变往往和HE患者的带4.1蛋白缺陷相关。

（1）激光衍射法测渗透脆性：

渗透梯度激光衍射仪器在一个已知的剪切应力下，可连续性观察渗透梯度范围内红细胞的形态改变。这种技术的优点是不同的红细胞膜缺陷疾病都有自己独特的曲线，但普及率小且操作复杂。鉴别要点主要包括以下几个指标：可变形指数（deformability index，DI）指细胞的含水量和变形能力，DImax代表红细胞的最大细胞可变性；低渗点（hypo-osmotic point，Omin）指在低渗范围内，细胞可变形性最小时的渗透压，即50%的红细胞发生溶血时的渗透压；高渗点（hyper-osmotic point，O’）指在高渗范围内，细胞可变性指数达到其最大值一半时的渗透压，代表了红细胞的水合作用。激光衍射法检测HE患者红细胞时，发现DImax减少而Omin和O’正常，曲线呈梯形。

（2）伊红-5-马来酰亚胺荧光染色：

伊红-5-马来酰亚胺（eosin-5-maleimide，EMA）荧光染色最初被认为是诊断HS的良好指标，而后有研究认为，EMA荧光减少且MCV升高对HE同样有诊断价值。

（3）分子细胞遗传技术：

由于 HE 患者的临床异质性显著，有时通过红细胞形态、激光衍射法等指标依然无法确诊。分子遗传学技术是一种确定基因突变的先进性技术，结合多个实验室检查，有利于提高对HE的诊断水平。实时荧光定量PCR可以通过检测 SPTA1、SPTB和EBP41的mRNA表达水平，确定相应编码膜骨架蛋白的缺陷类型，对突变导致基因表达量下降的患者敏感，但无法确定患者的突变位点。Sanger测序法可直接获得突变位点的信息，对未知突变的检出具有优势，但当患者频繁接受输血时，体内多源头的红细胞群会扰乱其检测结果。第二代测序技术是一种新兴的实验技术，能为遗传性溶血性疾病提供高效快速的诊断，即使是多次输血的患者也能很快明确病因。变性高效液相色谱分析（DHPLC）对单个核苷酸变异的检出率较SSCP高，且较直接DNA测序具有高敏感性、效率高、费用低等优势。

3.东南亚卵圆形细胞增多症（SAO）

SAO是一种少见的显性HE变异，其特征是出现卵圆形红细胞，这类细胞中有很多包含1或2个横向的脊或一个纵向的裂缝。SAO的主要病因是带3蛋白胞质和跨膜区连接处的9个氨基酸的27bp缺失导致框内缺失。SAO的带3蛋白阴离子运输能力削弱，而在膜内发生线性聚集的趋势增加。带3蛋白胞质和胞膜连接区的第400～408位氨基酸缺失，该缺失和所谓的“Memphis I”多态性（AAG→GAG；赖氨酸56谷氨酸）相关。

4.遗传性口形细胞增多症及相关疾病

口形红细胞是以宽的横向裂口或口状为特征的红细胞，可见于各种获得性和遗传性疾病。其中遗传性类型常伴有遗传性红细胞阳离子渗透性异常，这种异常与红细胞水化或膜脂质异常有关。红细胞水化紊乱从一个极端的脱水至另一个极端的水过量。研究显示，位于16q23-24的基因往往和一些脱水的遗传性口形红细胞增多症（DHS）有关。过度水化的遗传性口形红细胞增多症（OHS）时，口细胞素（stomatin，或蛋白 7）减少或缺乏。

（黄　俊　王昌富）