第二节　血红蛋白病检验技术

血红蛋白病（hemoglobinopathies）是一类由于血红蛋白结构异常或者合成量不足而引起的遗传性血液病。由于组成血红蛋白的珠蛋白肽链分子结构发生异常所致的疾病，称为异常血红蛋白病（abnormal hemoglobins），如 Hb S病、Hb E病等；由于组成血红蛋白的珠蛋白链合成量减少或缺如引起贫血，称为珠蛋白生成障碍性贫血（旧称地中海贫血，thalassaemias），如α-地中海贫血、β-地中海贫血等。在我国，该病主要流行于长江以南大部分省份，特别是广西、广东和海南等地区。血红蛋白病的临床表现差异很大，诊断均需依靠血液学表型分析和基因型分析。血液学表型分析主要包括基础红细胞指标和血红蛋白类型分析。在血液学表型分析结果的引导下，借助分别针对不同类型血红蛋白病的DNA分子诊断技术，可准确、快速地筛查和确认血红蛋白病基因携带者。

一、血红蛋白电泳测定及血红蛋白A₂定量检测

血红蛋白电泳（hemoglobin electrophoresis）是分离鉴定Hb最常用且最为有效的方法，使用不同介质的电泳方法，其原理，分辨敏感度，操作简繁各有特点。HbA是成人血中的主要血红蛋白，占95%以上；HbA₂虽然其结构和组成与HbA有所不同，但两者的生理功能几乎一样，在正常成人中含量为2.5%左右。HbA₂含量的改变，在血红蛋白病的筛查和诊断中有重要意义。目前常用于分离鉴定Hb的方法有：醋酸纤维薄膜电泳法、琼脂糖凝胶电泳法和高效液相色谱（high performance liquid chromatography，HPLC）法。这3种血红蛋白分析技术均可用于HbA₂定量测定。

1.检验原理

（1）醋酸纤维薄膜/琼脂糖凝胶电泳法：

两者的检验原理基本相同，均是基于血红蛋白为两性电解质，在一定pH的缓冲液中带正电荷或负电荷，因而在电场中向阴极或阳极移动。由于不同种类血红蛋白的等电点、分子大小和形状等不同，故其在电场中移动速率不同，从而在一定的支持介质（醋酸纤维薄膜/琼脂糖凝胶）中得以分离。

（2）HPLC法：

不同种类的血红蛋白，其化学构成及物理性质存在差异。HPLC即是基于这种理化性质差异所导致的不同血红蛋白在相应色谱柱中保留时间不同，使各种组分按顺序被洗脱出来，根据洗脱时间进行血红蛋白种类定性，以及特定组分洗脱峰面积的定量检测。

2.检验方法学

（1）醋酸纤维薄膜法

1）器材和试剂：

①电泳仪、电泳槽、加样器等。②生理盐水。③四氯化碳（AR级）。④缓冲液：pH 8.5 TEB缓冲液：三羟甲基氨基甲烷（Tris）10.29g，乙二胺四乙酸（EDTA）0.6g，硼酸3.2g，加蒸馏水定容至1 000ml。硼酸盐缓冲液：硼砂6.87g，硼酸5.56g，加蒸馏水定容至1 000ml，为电极槽用。⑤染色液：丽春红S染液：染色液：取丽春红S 0.1g，二氯醋酸1.4g，加蒸馏水至100ml；漂洗液：3%醋酸溶液。联苯胺染色液：固定液：10%磺柳酸溶液；联苯胺储存液：取联苯胺0.1g，溶于10ml甲醇中，然后与500ml缓冲液（冰醋酸1.2ml，结晶醋酸钠0.8g，加蒸馏水至500ml）混匀，存4℃冰箱备用。联苯胺显色液：临用前取储存液30ml加入30%过氧化氢溶液1滴和5%亚硝基铁氰化钠1滴。

2）操作步骤：

①血红蛋白溶液的制备：取新鲜抗凝静脉血离心，5 000r/min，5分钟，弃血浆后，用10倍体积的生理盐水洗涤红细胞3次，最后一次以3 000r/min离心20分钟，尽量吸去生理盐水。向洗涤的比容红细胞中加入等体积蒸馏水和0.5倍体积的四氯化碳，剧烈振荡3分钟，使彻底溶血，3 000r/min离心15分钟，吸出上层澄清的血红蛋白液。调节浓度至100g/L，置4℃冰箱备用。②将醋酸纤维薄膜切成3cm×8cm小条，置于pH 8.5TEB缓冲液浸透，取出后用滤纸吸去多余液体。③用微量加样器取待检和正常对照的血红蛋白溶液，分别点样于醋酸纤维膜条点样线上。④端电压200～250V，电泳25～30分钟，泳毕，取出膜条。⑤染色：丽春红染色：将电泳后的膜条置于丽春红S染液中浸透，数分钟后，用3%醋酸溶液漂洗至背底白色，用滤纸印干，肉眼观察。联苯胺染色：将电泳后的膜条用10%磺柳酸溶液固定3分钟，充分水洗后，置联苯胺显色液中，至蓝色区带清晰显现，取出，用水浸洗，观察结果。

3）判断结果：

正常血红蛋白溶液电泳结果显示出四种区带，从阳极端起，依次为HbA区带、HbA₂区带及两条非Hb区带（红细胞内非血红蛋白的蛋白成分，用NHb1和NHb2表示。如用联苯胺染色，NHb1和NHb2则看不见）。异常血红蛋白尚可出现HbH区带、HbJ区带、HbK区带、HbG区带、HbD区带、HbE区带等，如图5-1。

4）HbA₂定量（quantification of HbA₂）：

洗脱比色法：不连续电泳将HbA₂分离后，分别剪出膜条中的HbA和HbA₂区带，放入2个试管中。HbA管中加蒸馏水20ml，HbA₂管中加蒸馏水4ml。浸泡30分钟，不定时摇动。待血红蛋白完全洗脱下来后，混匀，用分光光度计（波长413nm）蒸馏水校正零点，读取吸光度值（OD）并根据下列公式计算出结果。

计算：

（2）琼脂糖凝胶电泳法

1）器材和试剂：

①器材：电泳仪、微量移液器。②试剂：配套琼脂糖凝胶电泳的试剂盒。

2）操作：

①血红蛋白液的制备同醋酸纤维素膜电泳法。②启动电泳仪。③加样器放在一平板上，各加样孔加入10µl溶血样品，2分钟内加样完毕。将加样器放入保湿盒内，齿端向上（转运时用塑料齿保护架）。等待5分钟，使样品扩散至齿端。打开电泳仪盖，抬起电极和加样器支架。④取出缓冲条，拿出末端的塑料片，将缓冲条两端塑料片固定在电极支架背侧的钉上，塑料片应紧贴支架。⑤取出凝胶板，用薄的滤纸轻轻吸去凝胶板表面的多余液体，在电泳仪温度控制板表面的边线内加200μl蒸馏水或去离子水。凝胶面朝上，放置凝胶板，边缘对齐边线。略将凝胶弯曲，然后放平，使水均匀分布在凝胶板下面而不含气泡。⑥降低支架，使缓冲条不接触到凝胶板。⑦从保湿盒里取出加样器，将其放在相应位置后，关上电泳仪盖子，开始电泳。⑧凝胶染色扫描：升高两个支架，取出并丢弃缓冲条。凝胶托架打开后，平放，将干燥的凝胶片放入两层间，然后关上托架，放入染色池中染色。染色完毕后取出干燥的凝胶片，在光密度仪扫描直接测定HbA₂含量。⑨判断结果：血红蛋白区带的判读同醋酸纤维薄膜电泳法。

（3）高效液相色谱（HPLC）法

1）器材和试剂：

HPLC血红蛋白自动分析系统及配套β-地中海贫血检测试剂

2）操作：

以某公司生产的检测系统为例，介绍 HPLC技术血红蛋白组分分析技术。①样本准备：EDTA抗凝静脉全血标本，编号后，依次置于标本托架上。②检测前试剂准备：检查仪器所连缓冲液及冲洗液，按配套试剂盒说明安装色谱柱，溶解和准备好引物、空白对照、校正品、质控品等。③仪器检测前准备：参照仪器使用说明书，打开仪器及计算机电源，运行仪器控制程序，连接及初始化仪器设备。④上样：按顺序依次将准备好的引物、空白对照、校正品、质控品放在对应的、有相应条码的托架上；再将此托架放入仪器进样区域，排在进样顺序托架的第1个，然后再按顺序放入待检标本托架。并于最后放置一空标本托架，以使仪器检测标本完毕后，进样时遇到空标本托架而自动停止检测工作。⑤标本检测：仪器恢复激活状态后，即可进入标本检测。⑥检测结果观察：标本检测完成后，查看质量控制数据，看其靶值及质量控制范围，判断是否在控。只有质量控制结果在控方可保证待检标本检测结果可靠。最后，分别查看每个检测标本的检测结果。⑦判断结果：该系统用含有HbA₂和HbF的定标液定标，以此两类血红蛋白的保留时间特征及校正因子，据峰面积分别计算其相对含量（%）；如出现所定标的已知血红蛋白种类以外的洗脱峰，则提示受检样本中存在其他类型血红蛋白，需参照相应的血红蛋白HPLC分析数据库及色谱图予以判别，但对特殊类型血红蛋白的确定还有赖于操作者的经验判断。

3.方法学评价

（1）醋酸纤维薄膜电泳法：

醋酸纤维薄膜对蛋白质吸附极少，几乎无“拖尾”现象，因膜亲水性较小，所以分离速度快，电泳时间短。同时，样品用量少，分离清晰，易于洗脱定量。由于HbF与HbA等电点接近，通常两者分不开，难分辨出在HbA带稍后的HbF区带。因此，该方法对抗碱血红蛋F分辨率有一定的局限性。此外，在碱性条件下，HbE与HbA₂也因有相同的迁移率而难以分开。

（2）琼脂糖凝胶电泳法：

琼脂糖几乎不吸附蛋白质，且分辨力强、区带整齐、重复性好。随着全自动电泳仪的出现，血红蛋白电泳现多用分辨率更高的琼脂糖凝胶电泳取代醋酸纤维薄膜法。虽然该方法对HbF分辨率有了很大提高，但在低浓度时电泳扫描图谱仍未能显出HbF区带；与醋酸纤维薄膜法一样，也不能区分HbE和HbA₂；在Hb H病的检查中，HbH区带大多较淡染，有些标本甚至出现Hb Bart区带浓于HbH区带的现象，导致假阴性的结果，因此琼脂糖凝胶电泳对Hb H病的检查尚有一些欠缺。

（3）HPLC法：

HPLC法具有重复性好，不受脂浊、黄疸标本的干扰，且检测速度极快的特点，是国际地中海贫血协会推荐的血红蛋白分析的参比方法。经HPLC法确诊的β-地中海贫血与经基因确诊的符合率可达97.6%，具有良好的快速诊断能力。而对α-地中海贫血而言，经HPLC法确诊与经基因确诊的符合率仅为62.6%，因此，该方法对α-地中海贫血的筛查仍存在一定局限性。

4.质量保证

（1）分析前

1）EDTA抗凝全血标本置于4℃环境保存，避免使用溶血标本。

2）一般采用四氯化碳制备血红蛋白溶液，用量应控制在比容红细胞量的0.5～1倍之间。血红蛋白溶液置于4℃保存不能超过1周。冷冻时可保存几个月，但不宜反复冻融，否则将导致变性。

（2）分析中

1）严格控制缓冲液离子强度、染液质量和浓度、染色时间、漂洗次数以及电泳时电流、电压和时间等，否则可影响电泳的分析结果。若检测到异常血红蛋白，而又与常见的异常血红蛋白S，C，D或E不同时，可使用其他方法（如肽链解离电泳）检测。

2）每次试验均应加入已知正常标本和异常标本，分别做阴性对照和阳性对照。

3）醋酸纤维薄膜电泳法/琼脂糖凝胶电泳法：血红蛋白电泳的样本宜稀释1～2倍，使区带更为清晰、整齐，HbA与HbA₂之间应距离6mm以上的空白区域。HbA₂定量时点样量宜10µl，对于中度或重度贫血的病例，点样量应增大为15µl或 20µl，以提高检测结果准确度。

4）HPLC法操作过程中，严格按操作说明用标准品进行定标，且保证定标、质量控制和受检标本的色谱条件一致。由于该方法有一定的检测上限，若超出检测上限则仪器检测结果误差大，须对样本进行稀释后重新检测。

（3）分析后：

及时与临床沟通，核实检验结果与临床诊断的符合性。由于铁缺乏会影响HbA₂的含量（使HbA₂水平下降），因此，缺铁性贫血会影响β-地中海贫血基因携带者的检出。应详细询问临床症状和家族史，结合血液学表型、临床表现和家族史综合分析，以提高临床诊断性能。

5.参考范围

HbA₂的正常值2.3%～3.3%，1岁以下幼儿低于1%。

6.临床意义

（1）通过与正常人的血红蛋白电泳图谱进行比较，可发现异常血红蛋白区带。如 HbH、HbE、Hb Bart、HbS、HbD 和 HbC等异常血红蛋白。

（2）HbA₂水平升高，是β-地中海贫血基因携带者的特征性标志，故HbA₂定量的准确与否，对于临床上β-地中海贫血基因携带者的筛查至关重要。

1）HbA₂增高至4%～8%，多数为轻型β-地中海贫血；若增高至10%以上提示为HbE。其他一些疾病如肿瘤、疟疾、甲状腺功能亢进、HbS病等，HbA₂也可轻度增高。

2）重度缺铁性贫血和遗传性HbF持续存在综合征（HPFH）、α-地中海贫血、δ-地中海贫血患者的HbA₂含量常会降低。此外，还可见于部分其他疾病如铅中毒、骨髓增生性疾病、铁幼粒细胞性贫血等。

二、抗碱血红蛋白测定

HbF具有抗碱变性特性，其随年龄而有变化，正常成人其含量在2%以下，珠蛋白生成障碍性贫血时HbF含量显著增加，持续性胎儿血红蛋白遗传综合征时可高至100%。临床实验室常以抗碱血红蛋白测定作为HbF定量的初筛试验。

1.检验原理

胎儿血红蛋白（HbF）及某些血红蛋白，其抗碱作用比HbA强。将待检的溶血液与一定量的0.083mol/L氢氧化钾或氢氧化钠溶液混匀，准确作用1分钟后加入半饱和硫酸铵中止碱变性反应。HbF抗碱变性作用强，没有变性而存在于上清液中。将变性的血红蛋白沉淀出来，滤除后，用比色法测未变性的血红蛋白含量，求其百分率。临床常以此作为HbF的定量方法，但Hb Bart和部分HbH也具有抗碱变性的能力。

2.检验方法学

（1）器材和试剂

1）器材：

分光光度计、刻度吸管（0.02ml，0.1ml，5ml）或可调移液器、定时器、小漏斗、新华Ⅰ号中型滤纸。

2）试剂：

①0.083mol/L氢氧化钾或氢氧化钠溶液，经定标校正后贮于聚乙烯瓶内。②酸性半饱和硫酸铵溶液：硫酸铵400g，加蒸馏水500ml，置于37℃水浴24小时后，不时搅拌，使达到饱和。再冷至25℃，搅拌一次，使过量硫酸铵析出沉淀，上清液为饱和溶液，取饱和液400ml，1mol/L盐酸20ml混合，加蒸馏水至800ml即可。

（2）操作：

①血红蛋白溶液制备：同血红蛋白电泳测定。②取试管2支，其中1支加入10%血红蛋白溶液0.1ml为测定管，另1支加入10%血红蛋白溶液0.02ml为对照管。于测定管中加入0.083mol/L氢氧化钾或氢氧化钠溶液1.6ml，同时开动秒表，摇匀数秒钟，至1分钟整，立即加入酸性半饱和硫酸铵溶液3.4ml，倒转6次，静置10分钟，滤取上清液待测。于对照管内加入蒸馏水5ml，摇匀待测。用分光光度计540nm波长，以蒸馏水调零点，分别读取各管吸光度（OD）。

计算：

3.方法学评价

抗碱血红蛋白测定方法简便、快速，便于推广，是β-地中海贫血的筛查技术之一。抗碱血红蛋白常常是判断HbF的重要标志，但不能完全代表HbF。除HbF外，Hb Bart’s和部分HbH也具有抗碱能力，需通过电泳鉴别。

4.质量保证

（1）分析前：

尽量用新鲜抗凝血制备血红蛋白溶液，久置会形成高铁血红蛋白，使测得的结果偏低。

（2）分析中

1）碱液浓度，碱化时间及温度要准确。

2）酸性半饱和硫酸铵必须准确配制，最好小批量分装。

3）试验所用试管，吸管等仪器应避免沾染酸碱，否则可影响检测结果。

4）每次试验最好重复两次，并用正常人血样和脐带血（HbF含量高）作对照。

（3）分析后：

与临床沟通，核实试验结果与临床诊断的符合率。对于HbF异常增高者，应结合临床表现和家族遗传史综合分析，以提高临床诊断性能。

5.参考范围

成人：1.0%～3.1%；新生儿：55%～85%，2～4个月后逐渐下降，1岁左右接近成人水平。

6.临床意义

抗碱血红蛋白明显增高见于β-珠蛋白生成障碍性贫血患者，重型患者可达80%～90%。遗传性持续性胎儿血红蛋白增高症，再生障碍性贫血，红白血病，球形红细胞增多症及某些肿瘤等亦可增高。

三、血红蛋白H包涵体测定

血红蛋白H是一种不稳定血红蛋白，在红细胞内可发生沉淀，形成变性珠蛋白小体，呈颗粒状，弥漫而均匀分散在红细胞内，经过特殊处理后可测定其含量。血红蛋白H包涵体测定可作为珠蛋白生成障碍性贫血的诊断指标之一。

1.检验原理

红细胞内不稳定血红蛋白极易被氧化变性沉淀，形成变性珠蛋白小体，附着于红细胞膜上。血液中加入煌焦油蓝，在37℃孵育后，血红蛋白H（HbH）因氧化变性，沉淀，呈颗粒状，弥散而均匀分散在红细胞内，被染成墨绿蓝色。

2.检验方法学

（1）试剂：

10g/L煌焦油蓝溶液：煌焦油蓝1g，枸橼酸钠0.4g，研磨溶解于100ml生理盐水，贮于棕色瓶中，临用前过滤。

（2）操作：

取10g/L煌焦油蓝溶液0.5ml，置于小试管内，加入新鲜血3～4滴，混匀，加塞，置37℃水浴中。在10分钟及1小时用毛细管各取1滴于玻片上，推成薄片，待干燥后，用油镜观察。

结果判断：HbH包涵体染色阳性时，在红细胞内出现大小不等、数目不一的墨绿色圆形小体，分布不规则，散在于整个红细胞内。油镜观察1 000个红细胞，计算含HbH包涵体阳性红细胞的百分率。

3.方法学评价

HbH包涵体测定用于诊断HbH病，方法简便且特异性较高。有时HbH含量少或其他因素使血红蛋白电泳未见HbH区带，而包涵体检查仍可增高。

4.质量保证

（1）用新鲜血立即测定。

（2）观察结果时，应注意与网织红细胞鉴别，后者一般呈蛛网状，与煌焦油蓝混合后，10～15分钟内显现出来，而HbH一般在10分钟后至1小时产生包涵体。

（3）潮湿，阴雨天时应将玻片放入干燥箱烘干（37℃）。

（4）及时与临床进行沟通，核实实验结果与临床诊断的符合率，结合临床表型和家族史，提高临床诊断性能。

5.参考范围

0～5%。

6.临床意义

HbH病患者阳性的红细胞可达50%以上，轻型α-地中海贫血时，偶见HbH包涵体。

四、异丙醇试验

不稳定血红蛋白（unstable hemoglobin）在溶剂异丙醇中的稳定性下降，观察是否出现混浊，以判断是否存在不稳定血红蛋白。异丙醇试验主要用于一些溶血性贫血疾病的检测。

1.检验原理

异丙醇是一种非极性溶剂，能使血红蛋白分子内部的氢键结合减弱，导致血红蛋白的稳定性下降。如在37℃的17%异丙醇溶液中，正常人血红蛋白约40分钟后开始沉淀，而不稳定血红蛋白一般在5分钟便出现混浊沉淀，20分钟后会形成絮状沉淀。

2.检验方法学

（1）器材和试剂

1）器材：

恒温水浴箱，加塞试管，计时器。

2）试剂：

① pH 7.4，0.1mol/L 三羟甲基氨基甲烷（Tris）缓冲液：Tris 1.21g溶于蒸馏水80ml中，用1mol/L盐酸溶液调节pH至7.4，加蒸馏水至100ml，加塞保存备用。②17%（V/V）异丙醇溶液：取异丙醇17ml，加入0.1mol/L Tris缓冲液至100ml，充分混匀，加塞，室温保存备用。不必冰箱保存，以免预热不够，易产生假阳性。③制备血红蛋白溶液试剂：见血红蛋白电泳，用四氧化碳制备。

（2）操作：

①血红蛋白溶液制备：同血红蛋白电泳测定。②取试管加入17%异丙醇溶液1ml，加塞于37℃水浴中预热20～30分钟。将新鲜制备的待测血红蛋白溶液0.1ml，加入上述已预热的试管中混匀，立即计时，分别于5分钟、10分钟、20分钟、30分钟和40分钟时观察结果并记录。

结果判断：5分钟即出现混浊，20分钟内出现大块沉淀为强阳性，用（+ + + +）表示；20分钟内呈现混浊为弱阳性，以（+）表示，介于两者之间用（+ +）或（+ + +）表示；40分钟内溶血液清澈者为阴性，用（-）表示。

3.方法学评价

试验操作简便，快速，其阳性提示异常血红蛋白或HbH存在，需作进一步检测。

4.质量保证

（1）分析前：

尽量用新鲜抗凝血制备血红蛋白溶液，不使用凝血、脂血和溶血标本。

（2）分析中

1）异丙醇溶液浓度（17%）及温度（37℃）要严格控制，pH不得低于7.2。

2）血红蛋白溶液需控制在100g/L，如浓度太低，可产生假阴性。应现配现用，久置可转变为高铁血红蛋白，造成假阳性。

3）如血红蛋白溶液中HbF含量超过4%，就可发生假阳性；即使HbF含量低于4%，但在室温存放3天，也可出现假阳性。故应采用新鲜的溶血液或存于4℃ 2周以内的全血。在8滴血红蛋白溶液中加1滴20g/L氰化钾溶液，可减少或消除假阳性。

（3）分析后：

与临床进行沟通，核实实验结果与临床诊断的符合率，特别是对5分钟内即出现沉淀的个体，应结合临床表现、家族史和实验室其他检测结果综合分析，以提高临床诊断性能。

5.参考范围

阴性（即40分钟内不出现混浊或沉淀）。

6.临床意义

正常人血红蛋白在40分钟时为阴性（-）；阳性可见于不稳定血红蛋白病，此外，HbE、HbF、HbM含量增高，α-地中海贫血杂合子，红细胞葡萄糖6-磷酸脱氢酶（G6PD）缺陷者均可出现阳性。

五、血红蛋白F酸洗脱试验

HbF除抗碱能力强外，抗酸能力也较强。因此，血片经酸洗脱后，只有含HbF的红细胞不被洗脱而染色。利用血红蛋白F酸洗脱试验观察含HbF的红细胞比例，可作为β-珠蛋白生成障碍性贫血的诊断指标之一。

1.检验原理

胎儿血红蛋白（HbF）具有比血红蛋白A（HbA）更强的抗酸能力，经固定后的血片，置酸性缓冲液中保温一定时间，只有含HbF的红细胞不被洗脱；再用伊红染色而呈鲜红色（阳性红细胞），不含HbF的红细胞则被洗脱仅留下细胞膜淡影，为阴性红细胞。

2.检验方法学

（1）试剂：

①80%乙醇。②0.1mol/L枸橼酸：取无水枸橼酸9.6g，溶于适量蒸馏水，待完全溶解后，加蒸馏水定容至500ml。③ 0.2mol/L 磷酸氢二钠：取 Na₂HPO₄·12H₂O 35.81g溶于少量蒸馏水，待完全溶解后，加蒸馏水定容至500ml。④酸性缓冲液pH为（3.3±0.2）：0.2mol/L磷酸二氢钠12.3ml；0.1mol/L枸橼酸37.7ml。⑤苏木素染色液。⑥伊红染液。

（2）操作

1）按常规制备血涂片，自然干燥1小时，再用80%乙醇固定5分钟，水洗待干。

2）将固定后的血膜放37℃、pH 3.3的酸性缓冲液中，保温准确5分钟。

3）冲洗干燥后，在苏木素染液中染白细胞1分钟，以免误认为阳性红细胞。

4）水洗后，用伊红染液染1分钟，再水洗，干燥后镜检。

结果判读：油镜下，含HbF的红细胞被伊红染液染成鲜红色为阳性红细胞，仅留下淡影的细胞膜者为阴性红细胞。计数1 000个红细胞中阳性红细胞所占百分比。

3.方法学评价

该试验可作为地中海贫血的辅助诊断指标，但较费时费力，重复性也比较差。检验结果的准确性依赖检验者的操作水平，并受诸多因素干扰。如血涂片太薄，染色时间偏短可使结果偏低。酸性缓冲液的pH，温度和温育时间均可影响检验结果。

4.质量保证

（1）分析前：

采用枸橼酸盐抗凝血，可使用在4℃冰箱中保存3天内的全血标本。

（2）分析中

1）血片制成后，在2小时内染色，否则可出现假阳性反应。要求血片薄，细胞平铺分散。

2）严格把握缓冲液的pH、温度、洗脱时间，否则会影响检测结果。

（3）分析后：

与临床进行沟通，核实实验结果与临床诊断的符合率，特别是对阳性红细胞异常增多的个体，应结合临床表现、家族史和实验室其他检测结果综合分析，以提高临床诊断性能。

5.参考范围

成人 ＜ 1%；新生儿：55%～85%；2岁后幼儿 ＜ 2%。

6.临床意义

HbF酸洗脱试验是地中海贫血筛查方法之一。重型β-地中海贫血时，多数红细胞染成红色；遗传性HbF增多症纯合子型，红细胞染色深，杂合子型染色浅；轻型β-地中海贫血、再生障碍性贫血、溶血性贫血等，也可见数量较少的阳性红细胞。

六、血红蛋白病分子诊断试验

“分子病”的研究起始于血红蛋白病。1949年，Pauling应用滤纸电泳分析镰形细胞性贫血患者的血红蛋白，首次发现了不同于正常成人血红蛋白HbA的异常电泳成分，称之为HbS；20世纪70年代末期开始了地中海贫血的基因分析。随着分子生物学技术的发展，基因诊断技术也不断更新，现多采用多重PCR、跨越断裂点PCR、PCR结合反向点杂交试验（PCR-reverse dot blot，PCR-RDB）、多重连接探针扩增技术（multiplex ligation-dependent probe amplification，MLPA）和DNA测序技术等。血红蛋白病的表型与基因型分析相结合是诊断血红蛋白病的基本原则，根据血液学表型指标改变的不同组合可进行初步分类，以便于后续采用分子诊断技术确诊血红蛋白病。常见血红蛋白病的血液学表型和基因型特征见表5-1、表5-2。

（李　倩　王昌富）