第一节　造血原料检验技术

人体在正常情况下，成熟红细胞寿命约120天。骨髓通过激素以及自身对血液中氧浓度的感受而生成红细胞，以维持红细胞数量的恒定性。血红蛋白是红细胞内主要的结合蛋白，由珠蛋白和亚铁血红素组成。后者是血红蛋白的辅基，其化学结构为原卟啉Ⅸ和亚铁原子。体内的铁以多种形式保持着动态平衡，如体内25%的铁以铁蛋白的形式储存，转铁蛋白能结合铁离子，并与细胞表面转铁蛋白受体结合，并穿过细胞膜进入细胞内，参与合成血红蛋白、肌红蛋白和含铁酶类；铁调素通过调节组织内的铁向血浆中释放而控制铁的贮存和转运；还有许多物质如红细胞原卟啉、红细胞生成素、叶酸和维生素B₁₂也作为重要的造血原料参与了骨髓红系祖细胞生长、增生、分化和成熟。任一种造血原料不足或利用障碍都可能导致贫血。本节主要介绍血清铁、总铁结合力、血清铁蛋白、血清转铁蛋白、可溶性转铁蛋白受体、铁调素、红细胞原卟啉、叶酸、维生素B₁₂和红细胞生成素的实验室相关检验技术。珠蛋白及其基因和肽链分析将在本章第二节讨论。

一、血清铁、总铁结合力、铁饱和度测定

体内一部分转铁蛋白与血清铁（serum iron，SI）结合，另一部分则以脱铁的形式存在，总铁结合力（total iron binding capacity，TIBC）系指转铁蛋白所能结合的最大铁量，包括已经与转铁蛋白结合的铁和脱铁形式存在的转铁蛋白能够结合的铁量（即未饱和铁结合力，unsaturated iron-binding capacity，UIBC）。血清铁在总铁结合力中所占的百分比即为转铁蛋白饱和度（transferrin saturation，TS）。目前，铁元素的检测方法有原子吸收分光光度法、比色分析法、电化学法等。

1.检验原理

（1）比色法：

血清标本中加入强还原剂（抗坏血酸、肼、羟基胺等），将Fe3+还原成Fe2+，再与络合剂反应，生成有色化合物，比色测定SI。TIBC测定则是通过加入过量高铁化合物，使之与脱铁形式转铁蛋白结合，多余的铁被轻质碳酸镁粉末吸附除去，然后用测定SI的方法测定铁总量，即为总铁结合力。

常用络合剂有菲洛嗪、亚铁嗪、双联吡啶、铬天青S、三吡啶三嗪、3-（吡啶基）-5-6-双（5-硫代-2-呋喃基）-1，2，4-三嗪二钠盐乙氨基酚（简称为Ferene）等。

（2）原子吸收分光光度法：

铁元素的空心阴极灯发射其特征波长的光线，通过火焰后进入分光系统照射到检测器上。待测溶液被吸入火焰原子化器，铁元素原子化并在248.3nm处有最大吸收峰，光吸收量与火焰中铁离子的浓度成正比，与标准溶液进行比较，计算待测溶液中元素的含量。

2.检验方法学比色法

以亚铁嗪法为例，操作步骤如下：

（1）器材和试剂：

①甘氨酸 /盐酸缓冲液（pH 2.8）：0.4mol/L甘氨酸溶液58ml、0.4mol/L盐酸溶液42ml和Triton X-100 3ml混合后加入无水亚硫酸钠800mg，使溶解。②亚铁嗪显色液：亚铁嗪0.6g溶于100ml去离子水中。③铁标准贮存液（1ml=100μg Fe）：精确称取优级硫酸高铁铵［NH₄Fe（SO₄）₂·12H₂O］0.863 5g，置1L容量瓶中，加去离子水50ml，逐滴加入浓硫酸5ml，溶解后用去离子水补足至刻度，置棕色瓶中可长期保存。④铁标准应用液（200μg/dl或 35.8μmol/L Fe）：在 100ml容量瓶中加入铁标准贮存液2ml，加适量去离子水后，再加浓硫酸0.5ml，最后用去离子水补足至刻度。⑤TIBC铁标准液（1 000μg/dl或 179μmol/L Fe）：在 100ml容量瓶中，准确加入铁标准贮存液10ml，加适量去离子水后，再加入浓硫酸0.5ml，最后用去离子水补足至刻度。⑥轻质碳酸镁粉。

（2）操作：

主要步骤如下。

血清铁测定法：标本准备：收集血液后，3 000r/min离心10分钟将血清和红细胞迅速小心地分离，取试管3支标明测定、标准和空白管，分别加入血清、铁标准应用液和去离子水各0.45ml，在上述各管中加入甘氨酸/盐酸缓冲液1.20ml，混匀，在562nm波长，5mm光径比色杯，以空白管调零，读取测定管吸光度（称血清空白）。然后再向各管加入亚铁嗪显色液0.05ml，充分混匀，置室温15分钟，或37℃10分钟，再次读取各管的吸光度。计算方法：

血清总铁结合力测定法：于一具有塞子的试管中加入血清 0.45ml、铁标准液（1 000μg/dl）0.25ml和去离子水 0.2ml，混匀，放置室温10分钟后，加碳酸镁粉末20mg，振摇数次，再放置10分钟，其间再振摇数次，2 500r/min离心10分钟。另取3支试管，标明测定、标准与空白管，分别加入上述离心上清液、铁标准液（200μg/dl）和去离子水各0.45ml，向各管加入甘氨酸/盐酸缓冲液1.20ml，混匀。在562nm波长，5mm光径比色杯，以空白管调零，读取测定管吸光度（称血清空白）。然后向上述各管加入亚铁嗪显色液0.05ml，充分混匀，置室温15分钟或37℃10分钟，以空白管调零，读取各管的吸光度。计算方法：

3.方法学评价

（1）检测灵敏度和特异性：

亚铁嗪法对微量的铁离子（以Fe3+计）非常敏感，当 Ca、Mg、Zn 等离子浓度 ≤ 12μg/ml，Cr、Mn、Co、Cu等离子浓度 ≤ 6μg/ml时不干扰铁离子测定。胆红素 ≤ 500μmol/L，维生素C ≤ 0.5g/L时不干扰总铁结合力的测试。

（2）干扰因素

1）生理因素：

血清铁有明显的昼夜规律，上午高于下午，晚上则更低，其波动范围可达20%～30%。

2）标本因素：

血清本身的色度可干扰检测，检测时应做空白对照；溶血标本、严重脂血标本以及使用肝素钠抗凝血浆的标本会影响测定结果。

器材和试剂因素：菲洛嗪与铁离子的反应容易受到反应体系中某些共存离子（如硼酸根和硫化物等）的影响，导致显色时间很长或不发生显色反应。

（3）其他方法：

①原子吸收分光光度法：原子吸收光谱分析优点是灵敏度高（相对灵敏度为ng/ml～μg/ml级），精密度较好（在日常的微量分析中，精密度为1%～3%），但自动化程度较比色法为低，仪器相对昂贵；②电化学法：该法样品用量少，分析时间短，但需专门的仪器，应用较少；③微分电位溶出法：曾被认为是测定铁的较好方法，但操作难以自动化，目前也较少应用。

血清铁和总铁结合力测定是造血原料缺乏性贫血最常用的检测项目，目前临床上多数采用自动化的生化分析仪检测，其操作简便，显色稳定，灵敏度较高，适用于常规操作，但测试时要防止铜、锌等微量元素的污染而影响结果。

测定TIBC的常用方法多采用碳酸镁、氧化铝等吸附剂吸附多余的未结合的铁，经离心去除吸附剂再显色测定。这些方法标本用量大，操作繁琐，影响结果的因素较多，随机误差较大。Ferene法在生化分析仪上直接测定UIBC，以SI与UIBC之和计算总铁结合力，避免了前处理过程中人为的影响因素，是目前较为理想的一种检测方法。另外，美国Ironbinding Capacity Test（IBCT）试剂盒采用微柱过滤法进行前处理，在一定程度上减少了人为因素的影响，但试剂昂贵，应用较少。

4.质量保证

（1）分析前：

本试验用于检测患者血清铁状态及铁剂治疗后疗效观察，在试验前应避免高脂类、高维生素C类食物。高胆红素和溶血标本能影响检测结果。由于血清铁有明显的昼夜规律，监测血清铁，尤其是观察疗效时，应注意标本采样时间一致。标本采集后应及时送检，不能及时测定的标本分离血清后保存。使用仪器时，应熟悉和掌握该仪器性能，定期监测并验证设备性能，检测系统已校准并处于正常状态。

（2）分析中：

所用试剂要求纯度高，含铁量极微；所用的玻璃器材必须用10%（V/V）盐酸浸泡24小时，取出后再用去离子冲洗后方可应用，并避免与铁器接触，以防止污染；严格按试剂盒说明书强调规范操作，作好质量控制，避免试剂交叉污染。

（3）分析后：

检测后宜综合分析检测结果，应包含但不限于下列内容：①与临床相关性的分析：应经常与临床医师沟通，分析试验结果与该患者有关临床信息的相关性，可验证检验结果的可靠程度。②与其他试验的相关性：在同一时间将一个患者的同类试验结果结合起来分析和比较，以识别偶然误差，发现单项问题。③与患者以前试验结果的Delta检查：通过将实验室试验结果与患者以前的结果进行比较，有助于发现过失误差，特别是标本标识的错误。④界限检查：与实验项目的医学决定水平相结合来探讨其临床价值。这些分析后的共性要素在以下各检测项目中不再赘述。

SI、TIBC和TS只是铁代谢检测的筛查试验，在人体早期铁代谢发生改变时可能变化不显著，建议临床可选择铁蛋白、转铁蛋白等其他相关项目。

5.参考区间

（1）亚铁嗪法：

血清铁：成年男性：11～30μmol/L；成年女性：9～27μmol/L。血清总铁结合力：成年男性：50～77μmol/L；成年女性：54～77μmol/L。

（2）铁饱和度：

0.33～0.35（33%～35%）。

不同的测试系统，参考区间亦不同，参照相关仪器或试剂盒说明书。

6.临床意义

铁是人体的必需元素，具有生理活性的铁除以血浆的转铁蛋白形式存在外，主要以血红素的形式存在，缺铁或铁利用障碍时会引起红细胞异常。

（1）血清铁：

增高见于溶血性贫血、巨幼细胞性贫血、再生障碍性贫血、急性肝炎（因转铁蛋白合成及铁贮存障碍）、反复输血、血色病、含铁血黄素沉着症、铁剂治疗、铅中毒（血红蛋白合成障碍）、冠心病等；降低常见于缺铁性贫血、慢性失血、慢性感染、肝硬化、肾病综合征、恶性肿瘤；也见于饮食中长期缺铁或铁的吸收障碍，如营养不良、消化性溃疡、慢性腹泻、胃大部切除等；还见于铁需求增加，如妊娠、婴幼儿、哺乳期等。

（2）总铁结合力：

升高见于缺铁性贫血和肝细胞坏死等；减低见于遗传性转铁蛋白缺乏症，肾病，尿毒症，肝硬化，溶血性贫血，慢性感染及白血病等。

（3）血清铁饱和度：

可用于缺铁性贫血的鉴别诊断和治疗监测。降低伴有运铁蛋白水平升高，见于缺铁性贫血。升高伴有运铁蛋白正常或降低，见于再生障碍性贫血。

二、血清铁蛋白测定

从几种动物的肝脾中提取的铁蛋白（ferritin）由一蛋白质（脱铁蛋白）外壳封闭一个约有4 000个铁原子的核心组成，为24个亚单位聚集而成的大分子（450kD）结构的糖蛋白，是铁在体内储存的一种形式。检测铁蛋白的免疫法因为抗体或抗原标记不同的指示剂，而又有不同的方法，实验室常用的方法有放射免疫法，电化学发光免疫法，免疫比浊法，荧光免疫法等。

1.检验原理

电化学发光免疫法原理：采用双抗体夹心法原理，标本、生物素化的抗铁蛋白单克隆抗体和钌（Ru）标记的抗铁蛋白单克隆抗体混匀，形成夹心复合物，通过生物素与链霉亲和素间的反应结合到微粒上，微粒吸附到电极上，加电压后产生化学发光，通过光电倍增管进行测定。

2.检验方法学

以电化学发光免疫法检测为例，操作如下：

（1）器材和试剂：

①电化学发光免疫分析仪；②配套试剂。主要试剂：钌（Ru）标记的抗铁蛋白单克隆抗体；生物素化的抗铁蛋白单克隆抗体；链霉亲和素包被的微粒；TPA溶液；洗涤液。

（2）操作：

主要步骤如下。

标本准备：①血清：收集血液后，3 000r/min离心10分钟将血清和红细胞迅速小心地分离；②血浆：肝素（锂、钠）或EDTA-K2抗凝，3 000r/min离心10分钟。

标本测试：①标本、生物素化的抗铁蛋白单克隆抗体和钌（Ru）标记的抗铁蛋白单克隆抗体混匀，形成夹心复合物；②加入链霉亲和素包被的微粒，使复合物通过生物素与链霉亲和素间的反应结合到微粒上；③将反应混合液吸入测量池中，微粒由于磁性被吸附到电极上，未结合的物质被清洗液洗去；电极加电压后产生光量子，其强度与标准曲线比较得到检测结果。

3.方法学评价

（1）检测灵敏度和特异性：

用电化学发光法定量测定人血清中的铁蛋白，灵敏度为0.50ng/ml，在胆红素 ＜ 65mg/dl、血红蛋白 ＜ 0.5g/dl、脂质 ＜ 3 300mg/dl、生物素 ＜ 50ng/ml、类风湿因子 ＜ 2 500U/ml时不干扰测试。19种常用药物经试验对测定无干扰。治疗浓度的Fe2+和Fe3+对测定无干扰。铁蛋白浓度高达100 000U/ml也不出现钩状效应。

（2）干扰因素：

接受过小鼠单抗治疗或体内诊断的患者可能会出现假阳性反应；标本放置时间过长或处理不当、标本灭活或有沉淀时、试剂超过使用期限，或仪器性能下降等可对检测造成影响。标本禁止使用叠氮钠防腐。

（3）其他方法：

临床用于检测铁蛋白的免疫学方法有很多，如免疫荧光法，增强免疫比浊法等。放射免疫法是检测铁蛋白的传统方法，但耗时长、不精密度高、且有放射性，现临床实验室多未采用。

4.质量保证

（1）分析前：

接受高剂量生物素（＞ 5mg/d）治疗的患者，至少要等最后一次摄入生物素8小时后才能采血。采集后的标本应及时送检，避免放置时间过长或处置不当，分离后的标本在2～8℃可稳定7天，-20℃可稳定12个月。注意试剂盒有效期。使用仪器时，应熟悉和掌握该仪器性能，定期监测并验证设备性能，检测系统已校准并处于正常状态。

（2）分析中：

按试剂盒说明书强调规范操作，作好质量控制。注意仪器检测限，高于检测范围的标本应进行稀释。

（3）分析后：

铁蛋白减低对于缺铁状态有确定意义。

5.参考区间

电化学发光法：男性（年龄20～60岁）：30～400ng/ml；女性（年龄 17～60 岁）：13～150ng/ml。不同的测试系统，参考区间亦不同，参照相关仪器或试剂盒说明书。

6.临床意义

在治疗初期检测铁蛋白可反映当时体内铁的储量，以早期发现网状内皮系统中铁储存的不足。铁蛋白的检测适用于了解体内铁代谢的状况，正常情况下储存铁可用于血红蛋白的合成，铁蛋白低于12ng/ml的阈值时，判断为潜伏期铁不足。如果铁蛋白水平高于400ng/ml，又排除了供铁不正常的可能性，即反映体内铁存在过量的状况。铁蛋白升高还可见于下列肿瘤：急性白血病、霍奇金淋巴瘤、肺癌、结肠癌、肝癌和前列腺癌。检测铁蛋白对肝脏转移性肿瘤有诊断价值，76%的肝转移患者铁蛋白含量高于400ng/ml，升高的原因可能是由于细胞坏死、红细胞生成被阻断或肿瘤组织中合成增多。

三、血清转铁蛋白测定

转铁蛋白（transferrin，Tf）是能够与铁相结合的蛋白家族，由670～700个氨基酸组成的单链糖基化蛋白，分子量80kD左右。Tf能可逆地结合多价离子，包括铁、铜、锌、钴等。每一分子Tf可结合两个三价铁原子。Tf主要由肝细胞合成，半衰期为7天。检测血清Tf的方法有放射免疫测定法、酶免疫测定法、免疫比浊法、化学发光免疫分析法等，目前临床主要采用免疫比浊法进行检测。

1.检验原理

免疫比浊法原理：将兔抗人铁蛋白抗体交联于胶乳颗粒上，与待测样品中铁蛋白在液相中相遇，立即形成抗原抗体复合物，并形成一定浊度，与通过同样处理的校准品比较，即可计算出样品中Tf的含量。

2.检验方法学

以免疫比浊法为例，操作如下：

（1）器材和试剂：

①自动化分析仪。②配套试剂。主要试剂：pH 7.2～7.6磷酸盐缓冲液、抗人转铁蛋白抗体、特定蛋白复合校准品、聚乙二醇6000、EDTA-Na₂、特定蛋白复合校准品、9g/L NaCl。

（2）操作：

主要步骤如下。

标本准备：

①血清：收集血液后，3 000r/min离心10分钟将血清和红细胞迅速小心地分离；②血浆：肝素（锂、钠）或EDTA-K₂抗凝，3 000r/min离心10分钟。

标本测试：

①标准曲线：将5种不同浓度特定蛋白复合校准品（标准管）、9g/L NaCl（空白管）中分别加入pH 7.2～7.6磷酸盐缓冲液，读取标准管A1和空白管A1。在上述各管中加入抗人转铁蛋白抗体，孵育一段时间后，读取标准管A2和空白管A2，吸光度计算方法：

仪器自动拟合或制作标准曲线。②标本测定及计算方法同标准曲线，根据标准曲线得到结果。

3.方法学评价

（1）检测灵敏度和特异性：

用免疫比浊法测定人血清中的转铁铁蛋白，灵敏度较高。当样品中结合和游离胆红素浓度 ≤ 1 026μmol/L，血红蛋白 ≤ 10g/L、甘油三酯 ≤ 22.6mmol/L以及类风湿因子 ≤ 1 700IU/ml时，没有观察到干扰现象。

（2）干扰因素：

妊娠及口服避孕药或雌激素注射可使Tf升高。标本放置时间过长或处理不当，脂血，标本有沉淀，或灭活过的标本，试剂超过使用期限/或仪器性能下降时也可对检测造成影响。

（3）其他方法：

酶联免疫吸附法：酶联免疫吸附法是近年来发展起来的一种检测方法，其优点是灵敏度高，但干扰因素较多，因而限制了其临床应用。

4.质量保证

（1）分析前：

标本应新鲜，及时送检，分离后的标本室温或2～8℃保存可稳定8天，不能处理的标本于-20℃保存，可稳定6个月，避免反复冻融；注意试剂盒有效期，应有适当的程序和方法证实试剂和相关设备处于正常工作状态。

（2）分析中：

试剂严格按照说明书储存，使用前恢复到室温。不用的其他试剂应包装好或盖好，不同批号的试剂不要混用，保质期前使用。分析时应做好质量控制，保证检测的准确性。

（3）分析后：

转铁蛋白既是急性时相蛋白，又可以作为评价营养状态的一项指标。同时与TIBC结合探讨，可能会更为全面地观察机体铁转运的方式和能力。

5.参考区间

免疫比浊法：28.6～51.9μmol/L。不同的测试系统，参考区间亦不同，参照相关仪器或试剂盒说明书。

6.临床意义

转铁蛋白是血浆中主要的含铁蛋白质，负责运载由消化道吸收的铁和由红细胞降解释放的铁，以Tf-Fe3+的复合物形式进入骨髓中，供红细胞的生成和分化，因此血浆中Tf水平可用于缺铁性贫血的诊断和对治疗的监测。

（1）Tf增多见于缺铁性贫血、急性肝炎、急性炎症、口服避孕药、妊娠后期。

（2）Tf减少见于肾病综合征、肝硬化、恶性肿瘤、溶血性贫血、营养不良等。

四、可溶性转铁蛋白受体测定

铁经肠上皮细胞吸收后结合转铁蛋白转运入血，再通过细胞表面的转铁蛋白受体（transferrin receptor，TfR）介导，完成细胞对铁的摄取。可溶性转铁蛋白受体（sTfR）是血清中TfR的水解片段，与红细胞生成活性及体内铁贮存状况密切相关。目前临床用于测定sTfR的方法主要有酶联免疫双抗体夹心法和免疫比浊法等。

1.检验原理

酶联免疫双抗体夹心法：将sTfR单克隆抗体包被于固相载体，血清中的sTfR与之结合后，形成抗原抗体复合物，再加入酶标记的转铁蛋白受体具有特异性的多克隆抗体，使之结合后加入底物和显色剂，其颜色深浅与转铁蛋白受体的量成正比。

2.检验方法学

（1）器材和试剂：

①自动化分析仪。②配套试剂盒，主要成分：标记用酶；酶底物与色原；包被液（pH 9.6碳酸盐缓冲液：Na₂CO₃ 0.16g，NaHCO₃ 0.29g加入蒸馏水溶解后定容至100ml）；洗涤液（0.02mol/L，pH 7.4 Tris-HCl-Tween20 缓冲液：Tris 2.42g，1mol/L HCl 13ml，Tween20 0.5ml，加入蒸馏水至1 000ml），终止液（2mol/L H₂SO₄）。

（2）操作：

主要步骤如下。

标本准备：①血清，收集血液后，3 000r/min离心10分钟将血清和红细胞迅速小心地分离；②血浆，EDTA-K2、枸橼酸钠或肝素（锂、钠）抗凝，3 000r/min离心10分钟，其中用枸橼酸钠抗凝的血浆，测定结果需进行换算。

标本检测：①包被抗体；②分别加入标本和标准品反应；③洗板，加酶标试剂反应；④洗板，加显色剂显色；⑤加终止液；⑥读取吸光度值，计算。

3.方法学评价

（1）检测灵敏度和特异性：

灵敏度 ＜ 0.1mg/L。不与其他可溶性结构类似物交叉反应。

（2）干扰因素：

主要干扰因素如下。

生理因素：新生儿、儿童sTfR高于成年人，随着年龄增长sTfR逐渐下降接近成年人。sTfR在不同种族人群间含量不同，其中有色人种的sTfR浓度高于白色人种，但无性别差异，与成年人的年龄也没有相关性。但生活在不同海拔高度的人群，sTfR浓度也不同，生活的海拔越高，sTfR浓度也越高，此外，孕妇随妊娠期的进展，sTfR不断升高，于产后5～10周恢复正常。

标本因素：标本处理和保存不当时（如溶血等），可影响检测结果，高血脂血也可对检测产生影响。

器材和试剂因素：多见于仪器性能欠佳，试剂盒使用和保存不当而影响结果。

（3）其他方法：

sTfR是一个新的铁代谢参数，检测的方法有多种，速率散射比浊法测定血清sTIR灵敏度为0.73mg/L，当胆红素 ＜ 325μmol/L、甘油三酯 ＜ 19.8mmol/L、血红蛋白＜ 5g/L时，对测定结果无明显影响，也是临床较为常用的检测sTfR的方法之一。

4.质量保证

（1）分析前：

标本应新鲜，不能含热原和内毒素，对收集后当天进行检测的标本，储存在4℃备用，不能及时处理的标本，将标本及时分装后放在-20℃或-70℃条件下保存。避免反复冻融。标本2～8℃可保存48小时，-20℃可保存1个月。-70℃可保存6个月。尽量不要使用溶血或高血脂血。如果血清中存在大量颗粒，检测前先离心或过滤。部分激素类标本需添加抑肽酶。不要在37℃或更高的温度加热解冻。应在室温下解冻并确保样品均匀地充分解冻。应熟悉和掌握仪器性能，定期监测并证实设备，试剂及仪器分析系统已适当校准并处于正常工作状态。

（2）分析中：

严格按照试剂说明书进行操作，保证质量。推荐使用加样器加样，并经常校对其准确性，以避免试验误差。不同的检测方法和不同的实验室检测的正常参考范围常不一致，因此，在做sTfR检测时应设正常对照，并建立相应的sTfR参考范围及鉴别诊断的cut-off值。

（3）分析后：

sTfR是评价功能性铁缺乏的可靠指标。

5.参考区间

酶联免疫双抗体夹心法：健康成人：1.3～3.3mg/L。不同的测试系统，参考区间亦不同，参照相关仪器或试剂盒说明书。

6.临床意义

在人体内转铁蛋白携带铁与细胞表面TfR结合，并穿过细胞膜进入细胞内，参与合成Hb、肌红蛋白和含铁酶类。人体内80%的TfR存在于骨髓幼红细胞膜上，在幼红细胞成熟过程，膜TfR逐渐被释放入血，成为sTfR的主要来源。

（1）鉴别缺铁红细胞生成与贮存铁消耗两种状况。在缺铁红细胞尚未形成而只是单纯的贮存铁耗竭状态下，如童年、青少年发育阶段及妊娠期，血红蛋白生理性下降，其他指标很难区分这种生理性贫血与缺铁性红细胞形成的贫血。而sTfR在组织缺铁时特异性升高的特点有助于早期鉴别缺铁红细胞生成。

（2）sTfR在小细胞低色素性贫血中的鉴别作用：实验室在评估小细胞低色素性贫血时的困难是如何鉴别缺铁性贫血（IDA）和慢性病贫血（anemia of chronic disease，ACD），尤其是在它们同时出现或在伴有感染、肝脏疾病等时，一般实验室检测方法都受到一定程度的影响，而sTfR不受炎症、感染等因素的影响，此时，sTfR能很好地对此类型贫血进行鉴别。

（3）sTfR对红细胞生成的评估大部分sTfR来源于骨髓幼红细胞，红细胞生成的变化直接影响sTfR。因此sTfR可作为判断重组人类促红细胞生成素治疗慢性肾衰贫血、小儿缺铁性贫血、慢性疾病贫血等疾病预期疗效的有效指标。骨髓红细胞的增生可引起sTfR升高到正常范围的8～20倍。

五、铁调素测定

铁调素（hepcidin）是维持体内铁稳态的关键物质，是一种重要的铁调节性激素。其由肝脏合成，释放于循环血浆中，经肾脏代谢后，随尿液排出。铁调素通过调节组织内的铁向血浆中释放而控制体内铁的贮存和转运。铁调素合成过多在炎症性贫血和非铁依赖性缺铁性贫血的病因中扮演重要角色。相反，当合成不足时可导致体内铁负荷过重，是一些遗传性血色沉着症以及β-地中海贫血铁负荷过多的主要病因。目前，检测血清中铁调素含量的方法主要为竞争性酶联免疫法（C-ELISA）。

1.检验原理

竞争性酶联免疫法原理：固相载体上包被有抗人铁调素抗体，检测时，加入含有标准品或待测样品与生物素标记的铁调素抗原的混合液，标准品或待测样品中的铁调素抗原和被标记的重组铁调素抗原与固相抗体竞争性结合，加入亲和素化酶作用底物显色后在450nm波长进行检测，样品中的铁调素浓度与吸光强度成反比，可根据呈色的深浅进行定量分析。

2.检验方法学

（1）器材和试剂：

①酶标仪。②微孔反应板（已包被抗人hepcidin抗体），恒温箱，微量移液器等。③试剂：铁调素标准品：12 个浓度分别为：1.85ng/ml，3.9ng/ml，7.8ng/ml，15.6ng/ml，31.2ng/ml，62.5ng/ml，125ng/ml，250ng/ml，500ng/ml，1 000ng/ml，2 000ng/ml，4 000ng/ml。10ng/ml生物素标记的铁调素-25抗原。0.01mol/L PBS缓冲液：约800ml蒸馏水中加入8.0g NaCl、0.24g KH₂PO₄和1.44g Na₂HPO₄至充分溶解后，用HCl调节溶液的pH至7.4，最后加蒸馏水定容至1 000ml即可。样品稀释液：含0.05% Tween 20的Tris碱缓冲液（TBS-Tween 20）。酶促底物：链霉亲和素过氧化物酶。洗涤液：含0.5ml/L Tween 20的PBS（pH 7.4）缓冲液。显色剂：3，3′，5，5′-四甲基联苯胺。反应终止液：0.2mol/L 硫酸。

（2）操作步骤

1）标本准备：

血清，收集血液后，3 000r/min离心10分钟将血清和红细胞迅速小心地分离。

2）平衡：

将试剂盒从冷藏环境中取出，待平衡至室温后（约30分钟），方可开启使用。

3）加样：

将12个浓度的铁调素标准品与生物素标记的铁调素-25各50μl组成的混合液加入系列标准孔。同时，将待检血清（预先用样品稀释液1：20倍稀释）与生物素标记的铁调素-25各50μl组成的混合液加入检测孔。

4）加酶促底物：

分别在每孔中加入链霉亲和素过氧化物酶 50μl，轻轻混匀。

5）温育：

置于37℃恒温箱孵育1小时，室温平衡5分钟。

6）洗涤：

用含0.5ml/L Tween 20的PBS洗涤液充分洗涤10次，洗涤完后扣干（每次应保持30～60秒的浸泡时间）。

7）显色：

每孔加 3，3′，5，5′-四甲基联苯胺 50μl，轻轻混匀，置于室温10分钟。

8）终止：

每孔加0.2M硫酸50μl，轻轻混匀终止反应。

9）测定：

用酶标仪波长450nm测定各孔OD值，30分钟内完成并记录结果。

3.方法学评价

（1）检测灵敏度和特异性：本方法最小检测下限为5.5ng/ml，不受血清中其他成分的干扰。血清中铁调素的稳定性较好，-80℃保存6个月后检测水平仅降低5%左右。即使在遗传性血色病沉着症患者血清中铁调素浓度极低的情况下，C-ELISA定量法也能准确检测其含量。

（2）干扰因素

1）生理因素：血清中铁调素含量具有昼夜节律性变化，中午12：00和晚上8：00含量最高，早上8：00最低。

2）食物因素：短时间内摄入大量铁，可刺激机体铁调素分泌增加，而使检测水平偏高。

3）药物因素：服用引起血清铁浓度增高的药物，可影响检测结果。

（3）与现有方法比较，C-ELISA操作简单，经济实惠，适用于高通量研究，目前市面上已有商品化试剂盒出售。基于质谱仪相关的检测方法由于仅能进行半定量或需要依赖昂贵的仪器，不适合在临床上推广使用。

4.质量保证

（1）分析前：

患者需在试验前3天禁食含铁高的食物，测试当天停止服用补铁药物。采集患者静脉血，待血液完全凝固后分离血清用于检测。

（2）分析中

1）应保证抗人铁调素抗体的纯度。

2）应严格规范操作流程，保证洗板的一致性和充分性，仔细按照推荐的洗板顺序操作是ELISA测定程序中的要点。

3）加酶试剂应使用定量移液器加液，以保证加量准确。

4）孵育前，应检查温箱的温度是否符合要求，保证温度准确。

5）洗涤是ELISA操作中的重要环节，清洗干净是保证质量的关键。手工洗涤时各孔均须加满洗液并浸泡30～60秒，防止孔口内有游离酶未能洗净；采用洗板机时，应注意调节洗液量至孔口。

6）比色前应先用柔软洁净的吸水纸拭净微孔板底附着的液体或指印，然后将微孔板正确放入酶标仪的比色架中，酶标仪不应安置在阳光或强光照射处，使用前先预热仪器15分钟，测读的结果更稳定。

（3）分析后：

国内对于铁调素的探讨相对较少，应详细询问临床症状并结合实验室其他检查结果综合分析，以提高临床诊断性能。

5.参考区间

男性：29～254ng/ml；女性：17～286ng/ml。不同的测试系统，参考区间亦不同，参照相关仪器或试剂盒说明书。

6.临床意义

铁调素是重要的铁代谢调控因子，血清中铁调素水平可反映机体内铁的贮存和转运情况，也可作为铁代谢性疾病的诊断和临床治疗的依据。

（1）生理性：

男性较女性高。生理性增高可见于能引起血清铁浓度增高的情况，如摄入大量含铁量高的食物，补铁制剂等。生理性降低见于红细胞增生时。

（2）病理性

1）铁调素增高：

异常增高见于炎症性贫血（C-反应蛋白浓度大于10mg/dl）、非铁依赖性缺铁性贫血、多发性骨髓瘤（IL-6生成过多）以及非炎症性慢性肾病等。

2）铁调素降低：

可见于因铁调素基因突变引起的伴铁耗竭的成人型遗传性血红蛋白沉着症、HJV基因突变引起的青年型血红蛋白沉着症、β-地中海贫血铁负荷过多期以及其他铁负荷性贫血（iron-loading anemias）。

六、红细胞原卟啉测定

红细胞原卟啉（erythrocyte protoporphyrin，EP）为构成血红素的主要成分，存在红细胞内。当体内缺铁时以游离形式在红细胞中积聚，虽然含量极微，但其量的增减能有效地反映人体血红蛋白代谢状况。原卟啉以两种形式存在于红细胞内，一种是与锌离子结合为锌卟啉（zinc protoporphyrin，ZPP），另一种是游离状态存在（free erythrocyte protoporphyrin，FEP），临床是常用酸性溶剂提取FEP后，以荧光比色法测定红细胞内游离原卟啉，应用血液荧光测定仪检测锌卟啉。

1.检验原理

红细胞内游离原卟啉检测原理：用加酸的醋酸乙酯或无水乙醇破坏红细胞并提取原卟啉。卟啉在紫外线照射下发出荧光，用荧光比色法测定标本中原卟啉的含量。

锌卟啉检测原理：锌卟啉具有特征的荧光光谱，在激发光波长420nm时，发射光波长为594nm，用荧光法测定其荧光强度，经微处理元件转换后，直接显示出锌卟啉的浓度。

2.检验方法学

（1）红细胞内游离原卟啉检测

器材和试剂：

①荧光光度计。②漩涡式振荡器。③酸化无水乙醇：无水乙醇94ml，用2.5mol/L盐酸定容至100ml。④标准原卟啉Ⅸ原液（5mg/L）：精确称取原卟啉Ⅸ粉5mg，加入酸化无水乙醇至1 000ml，盛于棕色瓶中，外用黑纸包裹，贮存于4ml冰箱中，可用1个月。⑤标准原卟啉Ⅸ工作液（50μg/L）：标准原卟啉Ⅸ原液（5mg/L）用酸化无水乙醇稀释100倍，临用前新鲜配制。

操作：

主要步骤如下。

标本准备：

肝素（锂、钠）抗凝全血。

标本测定：

取3支试管，分别标明空白管，标准管和测定管，于各管中分别加入生理盐水、标准原卟啉Ⅸ工作液、肝素抗凝全血各0.05ml。每管中加入酸化无水乙醇3.50ml，置于漩涡式振荡器上振荡2～3分钟，以3 000r/min离心6分钟，将上清液倒入荧光比色杯中，以空白管校零，标准管校准荧光强度并调至100，于荧光光度计上进行荧光度测定（激发滤片400nm，发射滤片600nm），读取测定管的荧光强度。用肝素抗凝全血测定红细胞比容（HCT）。计算方法：

（2）锌卟啉检测

1）器材和试剂：

①荧光测定仪。②微量吸管、采血针和消毒用品等。

2）操作：

以某荧光测定仪为例，主要步骤如下。

接通电源，仪器预热10～15分钟，按下电源开关，指示灯亮。参数显示器上显示1 990，数据显示器上显示10 000。选择测量单位，将清洁盖玻片置于玻片槽中测量。取末梢血10μl，血滴于盖玻片上，使铺满测量环区（不能有气泡），测量结果减去玻片值，即为ZPP含量。

3.方法学评价

（1）干扰因素：

主要干扰因素如下。

生理因素：

原卟啉水平受年龄、性别及取血部位的影响，儿童的EP水平高于成人，波动范围也较大，随着年龄的增长，原卟啉水平逐渐下降，成人后水平稳定，波动范围较小，在性别上一般女性高于男性。此外，EP水平与居住地海拔高度有关，居住地海拔高者EP水平高于平原地区。

标本因素：

原卟啉在强光下易破坏，标本保存时长太长或强光照射后，可使结果偏低，胆红素可干扰检测，使检测结果增高。

器材和试剂因素：

见于试剂配制不准确，仪器性能不佳等。

操作过程因素：

多见于操作不规范，如提取原卟啉后上清液放置时间过长或强光照射等；ZPP测定时，血膜厚薄不均一或有气泡，工作电压不稳定等。

（2）FEP和ZPP检测的价值：

在铅吸收和缺铁性贫血中的所谓“游离原卟啉（FEP）”实际上并非游离，而是与锌结合成锌原卟啉（ZPP）存在于红细胞内，现已证明铅对铁络合酶有抑制作用，因此在红细胞血红蛋白的合成过程中，原卟啉不能与铁结合成血红素，而在红细胞内积累增多，与红细胞内锌结合为锌卟啉（ZPP），使ZPP含量增高，因此测定血ZPP含量对于诊断缺铁性贫血，评价体内铅代谢状态是一项可靠的早期生化代谢指标。

4.质量保证

（1）分析前：

原卟啉水平受年龄、性别及取血部位的影响，监测EP，尤其是观察疗效时，应注意标本采样一致。标本采集后应及时送检，不能及时测定的标本，应保存于暗处或4℃冰箱避光保存，但不能超过24小时；高胆红素标本可影响结果测定，因此也应避免。应有恰当的程序和/或方法定期监测并证实设备，试剂及仪器分析系统已适当校准并处于正常工作状态。

（2）分析中：

FEP检测时所有操作过程应在避光条件下进行，并尽快完成，提取的原卟啉荧光强度随时间而衰减，但在2小时内基本稳定。ZPP测定所用玻片必须非常清洁，玻片厚薄均匀；血液标本应铺满测量区，且血膜厚薄要均匀，过薄过厚均影响测量结果。

（3）分析后：

FEP作为反映血红蛋白构成的一个独立因素，其操作过程较为复杂，不确定度较大，因此对于其检验结果宜慎重对待。

5.参考区间

FEP：正常成人（398.4±131.7）μg/L RBC。ZPP：0.6～1.0μmol/L。不同的测试系统，参考区间亦不同，参照相关仪器或试剂盒说明书。

6.临床意义

铁缺乏时，血红蛋白合成减少，红细胞内FEP蓄积，所以EP量可间接反应铁的缺乏，但是铅中毒、红细胞生成性卟啉病、骨髓增生异常综合征等病FEP也增高；而恶性贫血、营养性巨幼细胞贫血及红白血病时，FEP减少。

慢性铅中毒或缺铁性贫血时ZPP升高，一般用ZPP ＞ 3.5μg/g Hb作为缺铁性贫血诊断指标之一。

七、叶酸测定

叶酸（folic acid）是一组化学结构相似，生化特性相近的化合物统称，由蝶啶、对氨基苯甲酸与1个或多个谷氨酸结合而成。食物中的叶酸绝大多数是以蝶酰多谷氨酸（或称多谷氨酸叶酸）的形式存在的。食物叶酸经小肠黏膜细胞内叶酰多谷氨酸水解酶水解后吸收。体内叶酸有两种形式：多谷氨酸叶酸在肝脏、红细胞及其他组织细胞内贮存，其余部分则以单谷氨酸叶酸的形式分布于血浆、组织液、胆汁及尿液中。叶酸为一碳单位的载体，参与嘌呤、嘧啶等重要物质的合成。用于评价人体叶酸状况最常用的指标是红细胞叶酸及血清或血浆叶酸。目前，叶酸的检测方法已有多种，其中微生物法、放射免疫法为经典方法，化学（或电化学）发光免疫法是近来发展起来的自动化检测技术。

1.检验原理

（1）电化学发光免疫法原理：

标本与叶酸预处理试剂处理后，将叶酸从叶酸结合蛋白质中释放出来，与钌标记的叶酸结合蛋白质形成叶酸复合物，加入链霉亲和素包被的微粒和生物素化的叶酸，后者与钌标记的叶酸结合蛋白质上仍未占据的位点结合，形成钌标记的叶酸结合蛋白质-生物素化的叶酸复合物，此复合物通过生物素与链霉亲和素间的反应结合到微粒上，微粒通过磁铁吸附到电极上，未结合的物质被清洗液洗去，电极加电压后产生光量子强度与标本中叶酸的浓度成反比。

（2）微生物法检测原理：

叶酸是酪乳酸杆菌（Lactobacillus casei，L.C，ATCC 7469简称L.C）生长所必需的营养素。在一定条件下，L.C的生长繁殖与培养基中叶酸含量成正比关系，细菌增殖量以吸光度计测定，通过与标准曲线相比较，计算出样品中叶酸的含量。

（3）放射免疫法检测原理：

核素标记的抗体与叶酸结合，产生γ-放射碘叶酸化合物，其放射活性与血清或红细胞中的叶酸含量成比例，检测其放射活性，与已知标准对照，得到叶酸含量。

2.检验方法学

以电化学发光免疫法为例，操作如下：

（1）器材和试剂：

①自动免疫分析仪。②主要试剂：预处理试剂1：硫代甘油12.66g/L，含稳定剂，pH 5.5；预处理试剂2：氢氧化钠37g/L；链霉亲和素包被的微粒；钌标记的叶酸结合蛋白质；生物素化的叶酸。

（2）操作：

主要步骤如下。

标本准备：收集血液后，3 000r/min离心10分钟将血清和红细胞迅速小心地分离。不要使用血浆。

标本测试：①15µl标本与叶酸预处理试剂1和预处理试剂2混匀，将叶酸从叶酸结合蛋白质中释放出来。②将预处理标本与钌标记的叶酸结合蛋白质，形成叶酸复合物，其数量取决于标本中待测物的浓度。加入链霉亲和素包被的微粒和生物素化的叶酸，后者与钌标记的叶酸结合蛋白质上仍未占据的位点结合，形成钌标记的叶酸结合蛋白质-生物素化的叶酸复合物。此复合物通过生物素与链霉亲和素间的反应结合到微粒上。③反应混合液吸到测量池中，微粒通过磁铁吸附到电极上，未结合的物质被清洗液洗去，电极加电压后产生化学发光，产生光的量与样本内叶酸的浓度成反比。仪器依据标准曲线通过计算而得出检测结果。

3.方法学评价

（1）检测灵敏度和特异性：

电化学发光免疫法检测叶酸的灵敏度为0.6ng/ml。该方法不受黄疸（胆红素 ＜ 75mg/dl）、脂血（脂质 ＜ 1 500mg/dl）和生物素（＜ 40ng/ml）干扰。不受类风湿因子干扰（＜ 400U/ml）。56种常用药物经试验对测定无干扰。

（2）干扰因素

1）标本因素：

抗凝剂可使叶酸结合蛋白的免疫原性部分失活，使检测结果偏低，应避免使用血浆标本；红细胞叶酸浓度远远高于血清，测定血清叶酸浓度时应避免标本溶血。脂血可对检测产生影响。

2）药物因素：

本检测会受到氨甲蝶呤或亚叶酸的影响，因为叶酸结合蛋白质与此类药物有交叉反应。

3）试剂和仪器因素：

多见于标准品不准确；标记物变质；抗体失效等，测量仪器或加样不准时也可影响检测质量。

（3）其他方法：

①微生物法：是检测生物体内叶酸的经典方法，通常所用的微生物有干酪样乳酸杆菌、粪链球菌和啤酒小球菌属，3种微生物对不同形式叶酸的敏感度不同。可用于鉴别分析各种形式叶酸在不同检测物的分布，其中干酪样乳酸杆菌在3种微生物中反应谱带最宽，也是最为常用的菌种。用微生物法检测血清和全血叶酸，操作简单，不需要特殊仪器或设备，灵敏度高（0.1ng/L），结果准确，但实验周期长，重复性差，干扰因素多，血清中存在的抗生素、叶酸盐拮抗物、血清乳酸杆菌抗体或样品暴露在日光下等，均可使测定值呈假性降低，多年以来，尽管微生物法得到了很大改进，但仍因耗时大，操作复杂而不能得到广泛使用。②放射免疫分析方法（RIA），所得结果与微生物学测定法相同，但较为准确和快捷，且不受血清中叶酸拮抗物或抗生素的影响，但操作方法复杂且有放射性污染等缺点。③固相酶免疫测定方法（ELISA），这种非放射标记免疫测定在临床检验得到了广泛应用，但是，因ELISA最后测定的是颜色的吸光度，其精密度和敏感性达不到RIA水平。④气相色谱-质谱法：优点是能直接检测红细胞叶酸浓度且特异性好，灵敏度高，结果准确，缺点是仪器价格昂贵，操作复杂，难以在临床推广。⑤色谱分析法：高效液相色谱-电化学检测方法对单谷氨酸叶酸及其衍生物的检测灵敏度高，对四氢叶酸及5-甲基四氢叶酸的检测灵敏度是微生物法的10～50倍，且检测前样品无需处理，这项技术的应用对体内叶酸吸收、代谢及转运等基础理论的研究具有重要意义，但技术复杂，不适用于临床常规检测。

4.质量保证

（1）分析前：

标本应新鲜，避免因标本保存或处理不当引起的误差；标本在2～8℃可稳定2天，-20℃可稳定1个月。只能冻融一次，避光保存。含沉淀的标本使用前需离心。不要使用加热灭活的血清。标本和质控品禁用叠氮钠防腐。由于红细胞中含有高浓度的叶酸，溶血会导致叶酸测定值偏高，因此溶血标本不适合于本测试项目。脂血可对检测产生影响，应空腹采血（禁食12小时）。接受高剂量生物素（＞ 5mg/d）治疗的患者，至少要等最后一次摄入生物素8小时后才能采血。

（2）分析中：

按试剂盒说明书强调规范操作，作好质量控制。

（3）分析后：

叶酸的变化可能会受到抗代谢药物的影响，宜结合临床分析。

5.参考区间

电化学发光法：血清叶酸：4.5～20.7nmol/L。RIA法：血清叶酸：成年男性8.61～23.8nmol/L，女性7.93～20.4nmol/L。红细胞叶酸：成人340～1 020nmol/L。不同的测试系统，参考区间亦不同，参照相关仪器或试剂盒说明书。

6.临床意义

叶酸是机体细胞生长和繁殖所必需的物质，帮助蛋白质的代谢，并与维生素B₁₂共同促进红细胞的生成和成熟，是制造红细胞不可缺少的物质。叶酸缺乏时，脱氧胸苷酸，嘌呤核苷酸的形式及氨基酸的互变受阻，细胞内DNA合成减少，细胞的分裂成熟发生障碍，引起巨幼细胞性贫血。血清叶酸含量反映近期膳食叶酸摄入情况，红细胞叶酸含量反映体内叶酸储存情况，红细胞叶酸与血清叶酸浓度相差几十倍，体内组织叶酸缺乏但未发生巨幼细胞贫血时，红细胞叶酸测定对判断叶酸缺乏尤有价值。此外，叶酸减少还见于红细胞过度增生叶酸利用增加，如溶血性贫血、骨髓增殖性疾病等；此外，甲亢、营养不良、慢性腹泻、酒精中毒、重症皮肤病、恶性肿瘤、肝脏疾病以及正常妊娠时叶酸含量也可减少。

八、维生素B₁₂测定

维生素B₁₂（vitamin B₁₂）是含钴的化合物，又称钴维生素或钴胺素（cobalamin或cobamide），由环绕一个中心钴原子的四吡咯环组成的，各不相同的是连接在钴原子上的侧基。钴胺素来源于动物产品，如肉、蛋、牛奶和其他乳制品。当摄取这些物质时，它们通过与胃液中的一种糖蛋白内因子结合，继而吸收到回肠。一旦进入血液循环，钴胺素就被吸收而存储在肝脏中。如果需要，它们就会由B₁₂结合蛋白质（转钴胺）承载并释放到血浆中去。维生素B₁₂是一种辅酶，在体内参与2种重要的代谢反应：半胱氨酸经过甲基化后成为蛋氨酸；甲基丙二酸单酰辅酶A转化为琥珀酰辅酶A。维生素B₁₂的缺乏将会影响这两个反应的正常运行，出现巨幼细胞贫血和神经精神症状。目前，维生素B₁₂的检测方法主要有微生物法、放射免疫法和化学（电化学）发光免疫法。

1.检验原理

（1）电化学发光免疫法原理：

标本经预处理后，结合的维生素B₁₂被内源性因子释放，与钌标记的内因子混合，形成维生素B₁₂-结合蛋白复合物，加入链酶亲和素包被的微粒和生物素化的维生素B₁₂，后者与钌标记的内因子上仍未占据的位点结合，形成钌标记的内因子-生物素化的维生素B₁₂复合物。此复合物通过生物素与链酶亲和素间的反应结合到微粒上。反应混合液吸到测量池中，通过生物素与链酶亲和素间的反应结合到微粒上。微粒通过磁铁吸附到电极上，未结合的物质被清洗液洗去，电极加电压后产生化学发光，产生光量子强度与样本内维生素B₁₂的浓度成反比。

（2）微生物法的原理：

特定的微生物对维生素B₁₂的存在具有极高的特异性和灵敏性，在测定用培养基中提供了除待测维生素以外所有营养成分，这样细菌的生长程度就会同标准溶液及未知浓度的待测溶液中维生素的含量相对应，以不同浓度标准溶液的浊度读数相对于各梯度水平标准物质的量绘制标准曲线，根据标准曲线即可计算出样品中维生素B₁₂的含量，常用的微生物为小眼虫和莱希曼乳杆菌。

（3）放射免疫法检测原理：

用抗氧化剂和氰化钾在碱性环境下（pH ＞ 12），将人血清中的维生素B₁₂从载体蛋白中释放出来，加入57CO标记的维生素B₁₂，与固定在微晶纤维颗粒上纯化的维生素B₁₂结合物竞争结合，检测其放射活性，其量与受检血清的维生素B₁₂含量成反比，与同样处理的标准品比较，得到维生素B₁₂含量。

2.检验方法学

以电化学发光免疫法为例，操作如下：

（1）器材和试剂：

①化学发光分析仪。②主要试剂：预处理试剂1：二硫苏糖醇1.028g/L，含稳定剂，pH 5.5；预处理试剂2：氢氧化钠36g/L，氰化钠2.205g/L；链霉亲和素包被的微粒；钌标记的内因子；生物素化的维生素B₁₂。

（2）操作：

主要步骤如下。

标本准备，血清：3 000r/min离心10分钟，将血清和红细胞迅速小心地分离。血浆：肝素（锂、钠）抗凝，3 000r/min离心10分钟。

标本测试：①15μl标本、维生素B₁₂预处理试剂1和预处理试剂2混合，结合的维生素B₁₂被内源性因子释放。②将预处理标本与钌标记的内因子混合，形成维生素B₁₂-结合蛋白复合物，其数量取决于标本中待测物的浓度。③加入链酶亲和素包被的微粒和生物素化的维生素B₁₂，后者与钌标记的内因子上仍未占据的未点结合，形成钌标记的内因子-生物素化的维生素B₁₂复合物。此复合物通过生物素与链酶亲和素间的反应结合到微粒上。反应混合液吸到测量池中，微粒通过磁铁吸附到电极上，未结合的物质被清洗液洗去，电极加电压后产生化学发光，通过光电倍增管进行测定。检测结果自动从标准曲线上查出。

3.方法学评价

（1）检测灵敏度和特异性：

电化学发光法检测维生素B₁₂灵敏度 30pg/ml，该方法不受黄疸（胆红素 ＜ 65mg/dl）、溶血（血红蛋白 ＜ 1.0g/dl）、脂血（脂质 ＜ 1 500mg/dl）和生物素（＜ 50ng/ml）等干扰。不受类风湿因子干扰（＜ 3 400U/ml）。50种常用药物经试验对测定无干扰。

（2）干扰因素

1）生理因素：

怀孕时维生素B₁₂增高。

2）药物因素：

口服避孕药和多种维生素剂可使维生素B₁₂增高。

3）试剂和仪器因素：

多见于标准品不准确；标记物变质；抗体失效等，测量仪器或加样不准时也可影响检测质量。

（3）其他方法：

①微生物法：利用生长与环境中的维生素B₁₂浓度相关的微生物来检测样本中维生素B₁₂的量，常用的微生物为小眼虫和莱希曼乳杆菌。用微生物法检测维生素B₁₂，操作简单，不需要特殊仪器或设备，结果准确，但实验周期长，重复性差，干扰因素多。②高效液相色谱法：根据层析原理利用高效液相色谱仪对样本进行分析。该方法分辨率高、重复性好，但仪器较昂贵。此外血清维生素B₁₂含量低且为水溶性导致样品萃取困难，还需要步骤繁琐的梯度洗脱，目前已被放射免疫法所取代。③放射免疫法：20世纪50年代末建立的RIA技术，大大提高了免疫测定的敏感度，但存在半衰期短、放射性核素污染、必须离心分离等缺点。

4.质量保证

（1）分析前：

标本应新鲜，及时送检，在进行离心操作前需让血清样本完全凝结。按采血试管生产商建议的方式进行离心。确保标本已去除了残余的纤维蛋白和细胞类物质。避免对溶血样本进行测定。在室温下标本保存不得超过8小时，不能立即测定的标本应保存于-20℃或以下的冰箱中，接受高剂量生物素（＞ 5mg/d）治疗的患者，至少要等最后一次摄入生物素8小时后才能采血。应熟悉和掌握仪器性能，定期监测并证实设备，试剂及仪器分析系统处于正常工作状态。

（2）分析中：

按试剂盒说明书强调规范操作，作好质量控制。超过仪器检测限的标本应稀释后重做。

（3）分析后：

血清叶酸和维生素B₁₂测定仅可作为初筛试验，结合红细胞内浓度、血清高半胱氨酸和甲基丙二酸水平测定和内因子抗体综合分析对诊断和鉴别诊断更有意义。

5.参考区间

RIA法：成人148～660pmol/L。电化学发光免疫法：血清叶酸：179～894pg/ml。不同的测试系统，参考区间亦不同，参照相关仪器或试剂盒说明书。

6.临床意义

血清维生素B₁₂降低对巨幼细胞贫血诊断有重要价值，胃切除术后、肠道吸收不良、肠道寄生虫病时维生素B₁₂也可降低，而白血病患者血清维生素B₁₂含量明显增高；真性红细胞增多症、某些恶性肿瘤和肝细胞损伤时也可增加。

九、红细胞生成素测定

红细胞生成素（erythropoietin，EPO）是由193个氨基酸组成的糖蛋白，相对分子量为（3.5～4.0）×104，胎儿几乎均由肝脏产生，成人主要产生于肾脏近曲小管细胞和肾皮质、外层髓质的小管周围毛细内皮细胞。任何造成肾脏功能损伤的因素都会造成EPO产生障碍。因此对EPO含量检测除反映机体骨髓造血的功能状况外，同时也是肾脏功能的直接反映。EPO的测定主要经历了三个阶段：生物体内测定法；生物体外测定法；免疫测定法。其中后期发展起来的免疫测定法是目前应用最广泛的临床检测EPO的方法。

1.检验原理

EPO的免疫学检测方法是根据抗原-抗体反应进行的，因为抗体或抗原标记不同的指示剂，而又有不同的方法，如：放射免疫法，免疫酶法，荧光免疫法，化学发光法等。

化学发光法原理：将样本和包被小鼠单克隆抗EPO的顺磁性微粒、阻断剂及碱性磷酸酶结合物添加到反应管中。在反应管内温育完成后，结合在固相上的物质将在磁场内被吸附住，而未结合的物质被冲洗除去。然后，将化学发光底物Lumi-Phos*530添加到反应管内，对反应中所产生的光量子进行测量，其与样本内EPO 的浓度成正比。样本内分析物的量由所储存的多点校准曲线来确定。

2.检验方法学

以化学发光法为例，操作如下：

（1）器材和试剂：

①化学发光分析仪。②主要试剂：R1a：包被着小鼠抗-重组人EPO单克隆抗体的顺磁性微粒［含小牛血清白蛋白（BSA）、 ＜ 0.1% 叠氮钠和 0.17% ProClin300］；R1b：鸡抗-重组小鼠EPO碱性磷酸酶结合物［含小牛血清白蛋白（BSA）、 ＜ 0.1% 叠氮钠和 0.17% ProClin300］；R1c：含小牛血清白蛋白（BSA）、蛋白质（鸡、牛、小鼠）、 ＜ 0.1%叠氮钠和0.17% ProClin300的Tris缓冲溶液。

（2）操作：

主要步骤如下。

标本准备：血清：收集血液后，3 000r/min离心10分钟将血清和红细胞迅速小心地分离。血浆，肝素（锂、钠）抗凝，3 000r/min离心10分钟。

标本检测：①将样本、包被着小鼠抗-重组人EPO单克隆抗体的顺磁性微粒和鸡抗-重组小鼠EPO碱性磷酸酶结合物添加到反应管中，标本中的EPO及酶标抗体结合在固相上，形成双抗夹心复合物。②形成的双抗夹心复合物在一个磁场内被吸住，而未结合的物质被冲洗除去。③将化学发光底物Lumi-Phos*530添加到反应管内，所产生光量子与样本内EPO的浓度成正比，与同样处理的校准曲线进行比较得到标本中EPO的量。

3.方法学评价

（1）检测灵敏度和特异性：

化学发光法检测EPO灵敏度为 ≤ 0.6mIU/ml，高达500mg/dl血红蛋白、40mg/dl胆红素、3 000mg/dl甘油三酯、3 500mg/dl蛋白质（人血清白蛋白）、8 000单位/dl肝素、20mg/dl对乙酰氨基酚、50mg/dl乙酰水杨酸、40mg/dl异丁苯丙酸以及1：20稀释的多种维生素的样本，均不会影响EPO浓度的测定。EPO达到30 000mIU/ml时，测定不会表现出钩状效应。

（2）干扰因素：

化学发光法检测EPO主要干扰因素如下。

生理因素：影响EPO生物合成的主要因素是机体的供氧情况：当过度输血或自发性红细胞生成增多等引起供氧增加时，血清EPO水平下降；而动脉血氧分压降低或红细胞数量减少造成缺氧时，则可使EPO的合成迅速增多。人体EPO一天中有所不同，上午7：30至中午12：00之间比较稳定。

标本因素：溶血标本可能会增加非特异性显色。标本宜在新鲜时检测。如有细菌污染，也会产生假阳性反应。如在冰箱中保存过久，可使本底加深。存在着被患者样本内嗜异性抗体所干扰的可能性。经常与动物有接触或者接受过使用免疫球蛋白或免疫球蛋白碎片进行免疫治疗或诊断步骤的患者，可能会产生抗体。此外，其他的嗜异性抗体，比如人抗山羊抗体，可能会存在于患者的样本内，此类干扰性的抗体可能会导致结果的错误，需对被怀疑带有此类抗体的患者的结果进行仔细的核查。

（3）其他方法：

①生物法：此法较繁琐，已不采用。②放射免疫测定法：需有进行放射免疫检测的一整套仪器，而且用同位素可带来污染，较少应用。

4.质量保证

（1）分析前：

在进行离心操作前需让血液标本完全凝结。在离心操作完成后的2小时内，将至少500µl的无细胞血清样本移入保存用试管，并立即将试管口牢牢塞紧。在室温（15～30℃）下，若在8小时内无法完成测定，可将样本冷藏保存在2～8℃环境下；若在24小时内无法完成测定，或样本需要运输，可将样本在-20℃或更低环境下冷冻保存。标本不能保存在玻璃试管内。在分析前，确保已去除了残余的纤维蛋白和细胞类物质，冻存样本解冻不超过3次。由于EPO在人体中不稳定，建议在上午7：30至中午12：00之间，采集样本。不同EPO测定试剂所获得的结果可能存在差异，因此如需对同一个患者进行任何间隔时间的连续检验，建议采用同一个商品EPO测定试剂测试。

（2）分析中：

按试剂盒说明书进行操作，作好质量控制。超过仪器检测限的标本应稀释后重做。每批测试均须用一系列不同浓度的参考标准品在相同的条件下制作标准曲线。

（3）分析后：

EPO检测主要用于血液病，肾病尤其是肾性贫血的研究，同时可用于EPO治疗前后的血药浓度观察及疗效监测。

5.参考区间

化学发光法：2.59～18.50mIU/ml。不同的测试系统，参考区间亦不同，参照相关仪器或试剂盒说明书。

6.临床意义

（1）肾癌、肾肿瘤、Wilmis肿瘤、肝癌、脑成血管细胞肿瘤、肾上腺肿瘤、平滑肌肿瘤、平滑肌瘤、发育不全性贫血、缺铁性贫血、地中海贫血、巨细胞贫血、单纯红细胞发育不全性贫血和脊髓发育不全综合征等疾病血清中EPO水平升高。

（2）肾衰、晚期肾病、慢性感染或代谢紊乱导致贫血、自身免疫疾病、类风湿关节炎、AIDS、恶病质、早产性贫血、低甲状腺功能性贫血和营养不良性贫血等疾病血清中EPO水平降低。

（3）肾性贫血患者EPO水平较低，在进行治疗过程中，往往通过注射EPO来提高体内EPO水平进行治疗，从而帮助患者增加红细胞数量，此时EPO水平有所上升；其他贫血如缺铁性贫血、巨细胞性贫血患者EPO水平不降低，但也可以使用EPO治疗，此时浓度也会有所升高。

（邓明凤　王昌富）