第三节　组织形态学检验技术

骨髓组织切片病理学检查（简称骨髓切片），即骨髓活组织检查（简称骨髓活检），是较多造血和淋巴组织疾病诊断的“金标准”。但是，骨髓切片也有很多不足，需要加强与其他形态学方法之间的互补。

一、检查方法和步骤

骨髓组织的技术处理有骨髓脱钙石蜡包埋和不脱钙的塑料包埋两种。这两种方法互有长处。一般认为，塑料包埋超薄切片形态较为清晰，而脱钙石蜡包埋切片易于进行多项组织免疫化学和组织化学染色，有更多的实用性。

（一）塑料包埋切片技术

1.仪器设备

骨髓组织塑料包埋切片所需仪器属于小型简便类。主要有切片机，其型号和功能的类型很多，可选用多功能旋转切片机或轮转式切片机；摊片和烤片机；磨刀机；恒温水浴箱；烤片机，可选用小型烤箱；其他，如锉刀、镊钳、毛笔、载玻片等。

2.骨髓组织脱水

由骨髓活检二步法获取并经Bouin固定液后的骨髓组织标本（见第一节），一般将组织固定30～60分钟后即进入脱水等步骤。在取出包埋于塑料前，需要除去组织中水分。除水分的方法可经浸渍于浓度逐级递增的乙醇来处理，根据高浓度溶剂向低溶度渗透原理，把组织中水分置换出来。先小心地将组织块从固定液中取出，用自来水漂洗几下，吸水纸吸干。用小纱布将组织块和写有其编号的小纸块包裹后，置于盛有自来水的搪瓷罐或钢罐内10分钟，然后用止血钳挤去纱布上的残余水分，如图4-94所示逐级脱水10分钟，脱水罐均应置于55℃恒温水浴箱内，并每间隔2～3分钟振摇一次。最后经无水乙醇处理后，室温搁置2～3小时左右。一般下午脱水后，放置过夜，第二天包埋。

各级乙醇浓度脱水必须充分，若不充分，切出的组织片较易断裂或松散，也易出现组织细胞水肿。

3.组织塑料包埋浸透

（1）Hemapun 865包埋剂配制

1）甲液（浸透剂）：

甲基丙烯酸-2-羟基乙基酯单体100ml，聚乙二醇（PEG-400）10ml，过氧化苯甲酰 0.4g 充分混匀待过氧化苯甲酰全部溶解后置玻璃瓶内，贮存在4℃备用。

2）乙液（促进剂）：

PEG-400 10～15ml，N，N-二甲基苯甲胺2ml，混合后置青霉素小瓶内，4℃贮存备用。

（2）操作步骤：

打开纱布包，轻轻夹出组织块，用吸水纸将其吸干；组织块用镊子放入特制的聚乙烯模具中；吸取Hemapun 865甲液约2ml置于塑料模具（图4-95）中，使充满，置4℃冰箱内，浸泡4小时以上；取出组织块，用带8号针头的1ml注射器吸取Hemapun 865乙液，滴入3滴于模具中，用细玻棒充分搅匀，拨正组织块于模具底部中央；4℃冰箱内静置过夜，待其自聚，顶部贴上编号标签，即成。

（3）组织包埋的影响因素：

影响组织块包埋的因素很多，如甲液和乙液的作用本身是一个化学产热过程。因此，包埋技术中需注意以下因素。

1）甲液包埋组织块的时间：

一般需4小时以上，若小于4小时就加入乙液混匀，易造成凝聚的组织块较软。

2）甲液和乙液的比例：

一般为40：1，甲液约2ml，乙液约0.05ml（即带8号针头的注射器3滴）。若乙液较多，则不能很好凝集，制成的塑料块往往较黏。如果乙液较少或搅拌时有液体漏出，制成的组织块则可较硬，均不利于切片。

3）甲液和乙液搅拌的时间：

一般在30秒左右，注意要上下，前后，左右充分混匀，混匀的手法颇似打鸡蛋时混匀蛋黄和蛋清。若搅拌时间太长，特别是室温过高的情况下，甲液和乙液会很快发生自凝，产生大量气泡，影响切片。

4）包埋液放置：

甲液和乙液混匀后一般放置4℃冰箱等待其凝集，但如果在夏天，室温过高情况下，为防止甲液和乙液凝集过快，产生气泡，可将其放置在冷冻格上。

若操作过程不理想，如乙液加入时未充分混匀，使组织块产生气泡而不能切片时，可用刀片将组织块从塑料包埋中取出直接放入最后一步无水乙醇中，室温过夜，第二天再加甲液，其他步骤相同。

4.组织切片、摊片、贴片与烤片

（1）修理组织：

剪去聚乙烯模具，包埋块先用锉刀修理包埋块底部两侧，尽量锉至靠近黄色组织块（图4-95）。然后上切片机，调节好所需的厚薄度。

（2）组织切片：

将修理恰当的组织块上切片机。每份标本应作连续切片，常规制作切片6张，其中3μm 3张（用于HGF染色、WG染色和改良甲苯胺蓝混合染色，剩下一张备用）；5μm 3张（用于Gomori染色和铁染色，留一张备用）。一般先切5μm规格，后切3μm。切片时用毛笔轻轻刷下切下的组织片，令其展开，再用镊子轻轻夹起摊于水面（摊片，也称捞片）。

（3）摊片：

摊片的水温一般要求20～25℃左右，可使组织片完全展开于水面，若水温太高或太低，组织片会蜷缩起来，不利贴片。

（4）贴片：

一般，一张载玻片贴3张组织片。第一轮切割的3张，分别贴在3张载玻片的1号位置上，依次类推，3张组织片相互靠拢，一般无需涂任何黏附剂。这样每张载玻片上就贴有不同切面的3张组织片，有利于观察。

（5）烤片：

将贴有不同切面组织片的切片，放置在60℃烤片机上充分烤干（图4-95），一般烤片2小时。

（二）石蜡包埋技术

1.仪器设备

随着全自动设备的普及，骨髓组织的石蜡切片（HE切片）制作一般需要全自动的组织脱水机、石蜡包埋机、石蜡切片机、组织切片染色机和切片封片机，还需要摊片机、烤片机、一次性切片刀等。在条件不具备时，也可通过手工方式完成相应的工作流程。

2.组织处理

1）固定：

骨髓组织活检离体后必须立即固定于Bouin液（饱和苦味酸75ml，甲醛25ml，冰醋酸5ml）中，固定时间一般为12小时左右，但最好不要超过36小时。固定液的量至少为组织体积的10倍。

2）脱钙：

Bouin液有着固定组织和软化组织的双重作用，但骨髓组织制作常规HE切片必须进行脱钙处理。

临床上可用的脱钙方法、脱钙试剂很多，为后续获得更好的免疫组化和分子检测，以及更好的操作便利性，建议使用有机酸或者弱酸进行脱钙。一般选用5%稀盐酸脱钙处理4～6小时，然后流水冲洗1～2小时的方案完成组织的脱钙处理。目前有环保试剂公司生产专门的骨髓穿刺标本固定液和脱钙液，也能获得较为理想的制片效果。

3）脱水：

制作常规石蜡包埋的HE切片，在骨髓组织脱钙完成后，必须进行组织脱水、透明以及浸蜡处理，参考流程如下：70%酒精1小时，85%酒精1小时，95%酒精Ⅰ、Ⅱ各1小时，100%酒精Ⅰ、Ⅱ各1.5小时，二甲苯Ⅰ30分钟，二甲苯Ⅱ40分钟，石蜡Ⅰ 30分钟，石蜡Ⅱ 1.5小时，石蜡Ⅲ 2小时。

4）切片：

组织切片厚度2～3μm，要求厚薄均匀，切面完整，无皱褶、无裂隙、无空洞、无污染。

3.骨髓小粒包埋切片

含骨髓小粒骨髓凝块固定、包埋与切片同骨髓组织石蜡包埋标本处理，但不需要脱钙。小粒凝块切片（无骨小梁结构）可以作为未做骨髓活检或为胸骨穿刺者观察骨髓组织的一种补充。

（三）切片染色

塑料包埋剂为亲水性，不用去除切片中的包埋剂即可进行各种染色，染色后也不需进行脱水和透明。

1.常规染色

（1）苏木精 -伊红（haematoxylin-eosin, HE）染色：

苏木精染色1分钟，冲洗吹干；1%伊红染色30秒，冲洗吹干；中性树胶封片，镜检。

（2）苏木精-Giemsa-酸性品红（haematoxylin-Giemsa-fuchsin, HGF）染色：

苏木精染色1分钟，冲洗吹干。

Giemsa 染液与缓冲液（1%磷酸二氢钾溶液与1%磷酸氢二钠溶液以3：2混合）1：20 染色液染色2分钟，冲洗吹干；1%酸性品红染色30秒，冲洗吹干；中性树胶封片，镜检。

（3）Wright-Giemsa-酸性品红染色（WGF）或WG染色：

切片上滴上瑞特染液；滴加Giemsa染液2～3滴；约加2倍于染液量的蒸馏水与染液混合，保持满而不溢，染色10分钟，流水冲洗；1%酸性品红染色30秒，冲洗吹干；中性树胶封片。

若用WG染色则不需要用1%酸性品红复染。与酸性品红复染的区别在于酸性品红复染后，可显示浅红色的骨小梁。不用酸性品红复染仅在标本上留下淡浅蓝色的骨小梁印迹。

（4）改良甲苯胺蓝混合染色：

以甲苯胺蓝和其他染料为主要组成，每张切片上滴加染色应用液，染色20分钟，流水冲洗，晾干后封片。

2.特殊染色

骨髓切片特殊染色即为组化和免疫组化技术（见本章第五节）。作为常规组化染色，最常用的是Gomori网状纤维染色和铁染色。

二、组织和细胞形态学检验

骨髓切片检查主要有两大项目：一是组织结构检查，二是有核细胞检验。前者是了解骨髓组织结构有无变化（组织形态学），包括骨小梁的变化、间质的改变、造血细胞的分布、异常组织的结构和浸润模式等；后者是了解骨髓组织中有核细胞量的多少（有核细胞增生程度），各系细胞的成熟性和形态有无明显改变（细胞形态学）。因此，理想的切片标本应有足够的组织长度，达到0.5cm、镜下至少有3～5个骨小梁及其区间（造血主质），标准长度应在1cm或1cm以上，有6～10个以上骨小梁及其间区，能较完整显示造血组织、骨组织和脂肪组织的分布以及不同系列造血细胞的解剖学结构。

检验方法，在一张切片的三轮组织片中，先用低倍（4×、10×）整体浏览整个切片，观察标本取材是否满意、切片质量和染色是否符合要求，了解组织结构和形态学的特点，异常细胞的增生程度、增殖方式、所占比例，骨髓间质成分的改变以及有无异常病灶等，然后用高倍镜对低倍镜所见作进一步的组织结构和细胞形态细节上的观察和定性（图4-96）。骨髓切片镜检还常需要结合骨髓涂片和印片甚至血片进行分析和诊断。

（一）检查方法

1.有核细胞量（增生程度）检查

检查并确认切片标本内有核细胞，一般是观察骨小梁与骨小梁之间造血主质中的有核细胞多少（图4-97）。有核细胞常指造血细胞。由于有核细胞与脂肪细胞基本上成反比，但也有一些例外。髓系肿瘤时，骨髓组织正常造血细胞被异常造血细胞替代，评判的是异常造血细胞或非造血细胞的增生程度；造血减低时，则为造血萎缩，脂肪组织扩张。

2.原始细胞数量与形态检查

有核细胞量检查后，非常重要的一个项目是原始细胞多少的检查。在原始细胞数量检查的同时，还需要观察原始细胞的形态特点和分布特点，并结合骨髓涂片或印片标本细胞学作出系列的基本评判。正常及一般标本中原始粒细胞很少，比例在2%以下，且常散在性分布于骨小梁旁（图4-98），也无聚集现象，可见2个原始细胞紧邻。原始粒细胞增加的常见规律是始于骨小梁，然后向造血主质区移动。所以，对于一般标本，重点注意骨小梁旁区，有无细胞较大、胞质较少、胞核较大而异染色质和核仁明显的细胞散在性（间质性）或聚集性增加，即幼稚前细胞异常定位。由于骨髓切片中各类细胞多而排列常紧密，不易准确辨认和可靠计数，故通常检查的原始细胞数量（%）为大约数。

通常情况下，检出原始细胞增多时，都需要免疫组化进行标记检查，如原始粒细胞CD34、MPO和CD117常为阳性，原幼单核细胞CD14和溶菌酶阳性（图4-99）。需要注意的是也有部分原始细胞（尤其是形态学上偏成熟的，如颗粒原始细胞）CD34为阴性反应。

3.幼粒细胞及其后期粒细胞数量与形态确认

原始粒细胞有无增加后，检查幼粒细胞及其后期细胞的组成（有无增加与减少、成熟障碍或欠佳）、形态和定位（有无结构异常）。正常情况下，早幼粒细胞常位于骨小梁旁生长，随着细胞成熟而移向造血主质进一步生长发育，中晚幼粒细胞及其后期细胞，在造血主质区呈簇状或散在性生长（图4-100）。

4.有核红细胞数量与形态检查

在临床标本中，贫血标本占了很大的一部分，检查有核红细胞对于贫血的辅助诊断是非常重要的一项内容。由于骨髓切片中，相当部分的原始红细胞与早幼红细胞、中幼红细胞与晚幼红细胞不容易区分，常可以把它们合并为一组进行检查（图4-101）。有核红细胞，尤其是原早幼红细胞基本上位于造血主质生长，不同于原早幼粒细胞常位于骨小梁旁生长，且胞体比原早幼粒细胞为大，胞质也较丰富，核仁特点也明显不同于原早幼粒细胞。大体检查原早幼红细胞与中晚幼红细胞在组织中的增生性，组成比例是否大致正常，即有核红细胞的成熟性有无明显变化，有无有丝分裂细胞增加，有无有核红细胞的巨幼变或胞体普遍变小。粒细胞和有核红细胞都有区域性、聚集性（造血岛）分布的特点，需要检查有无造血岛分布异常和造血岛的明显增大（造血旺盛）或过小（造血减低），有无粒红两系细胞比例上的明显失衡。疑似造血肿瘤时，还需要检查有核红细胞受抑状态及其残留的细胞量和异常造血的程度。原早幼红细胞与原早幼粒细胞、原幼淋巴瘤细胞、骨髓瘤细胞，中晚幼红细胞与淋巴细胞、小型的成熟骨髓瘤细胞容易混淆，需要免疫组化鉴定。CD235α是最常用于区分有核红细胞与其他细胞的单抗（图4-101）。

5.巨核细胞数量与形态检查

在检查巨核细胞数量与形态同时，也要检查巨核细胞在组织中的分布（细胞性组织结构）。检查巨核细胞异常，重点在于定性。巨核细胞通常单个地散在分布于骨小梁间区的窦状结构旁，且不发生群集现象，但可以两个巨核细胞在一起，也不发生明显的移位性生长（图4-102）。

比较可靠的方法是测定骨髓单位面积中的巨核细胞个数（mm2，参考区间为13个）。临床工作中，多采用造血主质中平均高倍视野测定值参考区间为巨核细胞1～2个，或平均低倍视野为5～8个。骨髓切片检查巨核细胞的可靠性常比骨髓涂片高。观察巨核细胞形态是骨髓切片的一项重要内容。包括巨核细胞大小变化（如大而高核叶巨核细胞和小巨核细胞），形状变化（如多形性、异形性），病态造血巨核细胞（如小圆核小巨核细胞、小圆核大巨核细胞、小圆核低核叶巨核细胞和微小巨核细胞）等，但是切片标本中原始巨核细胞和微小巨核细胞不容易观察，需要CD41或CD61标记染色（图4-102）。

6.淋系细胞数量与形态

正常骨髓切片淋巴细胞比较少见，散在性分布于造血主质中，不见原始淋巴细胞，也不见明显的幼淋巴细胞。少数标本，可以检出淋巴小结。如果骨髓活检切片中检出的淋巴小结或集簇 ＞ 3个或检出较巨大的淋巴小结时，应疑及慢性淋巴组织肿瘤。骨髓切片检查淋系细胞数量、形态与分布有无异常，需要从两个层面上去考虑。一是作为常规检查的一般性要求，检查有无淋巴细胞增多、形态异常，有无淋巴小结及淋巴小结的大小。二是已明确诊断的淋巴瘤和白血病，或怀疑淋系肿瘤的患者，需要仔细检查造血主质中有无散在性出现（原始）淋巴细胞增加，有无骨小梁旁和造血主质出现（原始）淋巴细胞簇、灶性或片状等浸润结构，同时检查造血功能良好与否。

7.浆细胞等少见细胞数量与形态

浆细胞常定位于小血管壁四周甚至聚集性生长，或单个及2～3个散在性小簇分布于主质及其他部位，而易于定位性观察到。幼稚浆细胞胞体和胞核均大、胞核偏位、异染色质不明显，胞质常丰富且着色偏浓，常规染色几乎不能检出。

常规检查造血主质中浆细胞有无散在性分布（增加），有无明显的大的聚集、灶性增生或片状浸润，有无明显的细胞幼稚性和异形性（如大小不一、胞体胞核不规则、巨大的蓝染核仁、双核多核）。正常和反应性增多标本中，易于在血管周围检出浆细胞分布增加，有时可见浆细胞沿血管排列。反应性浆细胞增多通常为散在性或五六个浆细胞围绕骨髓动脉呈小丛状，不见明显的幼稚型，百分比常低于10%。恶性增生时则常在非血管部位的造血主质区内呈明显的聚集性、灶性或片状生长结构，且常见浆细胞幼稚、胞核常有发亮的外观。但是，数量检查需要与结构性异常相结合，当检出典型的浆细胞多灶性（浆细胞常达10%以上）或片状（常达20%以上）、弥散性生长（常达60%以上）时，可以评判为浆细胞骨髓瘤或浆细胞白血病，并有典型的幼稚和异常形态学以及脂肪化造血主质区中出现时，还可以适当降低。仅检出聚集性和簇状生长浆细胞或散在性分布（轻度增加）时，需要密切结合临床、骨髓涂片、印片细胞形态学和免疫球蛋白等检查，加以整合。

其他少见细胞，如嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、单核细胞、肥大细胞等，都需要观察这些细胞的数量和形态变化。

8.病态造血细胞检查

检查病态造血细胞时，切片中最容易辨认的是病态巨核细胞，如小圆核巨核细胞和低核叶小圆核巨核细胞（图4-102），微小巨核细胞则不易观察；其次是双核、多核的病态粒红细胞，胞质丰富的类巨变有核红细胞，胞体增大、胞核较粗大的杆状核粒细胞（图4-103）。颗粒缺乏粒细胞和染色质异常胞核形态，一般不能观察。切片中的病态粒细胞和病态红细胞形态都不及涂片明显和多样性，但与涂片一起结合检查仍有重要的互补价值。易于检出小圆核小巨核细胞、小圆核大巨核细胞和小圆核低核叶巨核细胞，以及双核、多核幼红细胞等病态造血细胞，对诊断MDS、MDS-MPN以及AML伴病态造血有重要的参考意义。

9.间质异常检查

检查有无间质的异常，如脂肪细胞液性坏死、血管的异常（血管坏死，静脉窦扩张与破裂）、红细胞渗出、间质水肿（多见于组织脱水不完全，少数为骨髓组织的本身病变，如感染和白血病）、肉芽肿和胶状变性等。白血病和淋巴瘤时静脉窦扩张出血、崩解破裂，间质水肿与出血相对易见；MPN时可见静脉窦明显扩张，并可检出血管内的造血细胞（图4-104）。此外，尚需确认骨小梁有无异常，有无骨重建情况，有无外来的恶性细胞浸润等。

（二）检验评价

骨髓切片检验包括细胞形态学检验和组织形态学检验。单一的细胞形态检验常需结合骨髓涂片和骨髓印片形态学，组织形态学检验则是骨髓切片检验的专长。在同步采集标本的检验中，由于骨髓切片操作较为复杂和费时，检验最迟，故当镜检时占据了信息汇总分析（骨髓涂片和印片形态学检验）的优势，更易对患者的骨髓病变作出有益的评价和诊断。切片能对骨髓病变评估的主要项目有以下几项。

1.评估有核细胞量的最佳指标

骨髓涂片、印片和切片都可评估有核细胞量，但这三片的可靠性是骨髓涂片最差，骨髓印片较佳，切片最佳。因此，骨髓切片是评估骨髓造血组织增生程度的“金标准”，对以细胞量为主要评判的疾病，如MPN、MDS-MPN、脾功能亢进、反应性骨髓细胞增多症、AA、低增生性白血病和MDS，能提供最可靠的诊断依据。通常当造血组织比例达70%以上时显示造血组织增生明显活跃，90%以上时提示造血组织有核细胞增生极度活跃，常见于造血和淋巴组织肿瘤浸润。脂肪组织与造血组织比例成反比，造血组织增生时脂肪组织减少。当脂肪组织增加提示骨髓造血减退，见于AA等。

2.检查巨核细胞异形性的最佳指标

骨髓切片上巨核细胞异形性（大小和形态变异）具有独特性，在骨髓涂片和骨髓印片上都是不易观察或尚未被认识的形态。ET和PV的早、中期患者，切片上巨核细胞数量增多而无多形性改变，而疾病中出现巨核细胞的异形改变时则意味着疾病的进展。PMF和其他MPN的晚期患者，骨髓切片巨核细胞不但增多而且有特征的异形性改变（图4-105）。骨髓切片的这一特征就易对上述疾病作出诊断和鉴别诊断，还可对疾病是否处于进展期作出分析。脾功能亢进和继发性血小板增多症患者，骨髓切片巨核细胞增多，但无异形性，与MPN中晚期患者的巨核细胞异形性不同，有助于鉴别诊断。

3.检查巨核细胞移位性结构的唯一指标

巨核细胞移位增生是常见的结构移位（图4-106），是骨髓切片中可以检查的独特所见。正常情况下，巨核细胞位于造血主质，呈散在性分布。患MPN时，可移位于骨小梁旁并呈簇状增生，主要见于ET、IMF和MD-MPN，也见于PV和CML。脾功能亢进和继发性血小板增多症等继发性患者，骨髓巨核细胞增多而无移位性增生。这些都与骨髓涂片和印片上的特性不同。

巨核细胞多形性异常的程度与MPN的早晚期病变有关，MPN疾病早期多形性改变不明显，进展疾病晚期可出现显著的异形性和小细胞性。巨核细胞异常增殖时也可在造血间质出现巨核细胞簇（图4-106）。

4.检查幼稚前体细胞异常定位的最佳指标

不同类型的造血细胞在骨髓中有一定的分布区域，当某一幼稚前体细胞在正常分布区域移位于其他部位增殖时称为移位性或错位性（组织）结构。幼稚前体细胞异常定位（abnormal localisation of immature precursor，ALIP）也是常见的移位性结构之一，为原来多位于骨小梁旁生长的原始细胞或原、早粒细胞移位至造血主质，（或原、幼单核细胞）呈三五成簇生长（图4-107），与前述的巨核细胞移位方向相反。ALIP主要见于MDS，也见于急性白血病缓解（微小残留）和复发早期，以及MPN进展时。MDS和AML早期复发时，原始细胞常呈间质性和小簇状（原始细胞比ALIP结构为多）增生。骨髓中检查ALIP和原始细胞小灶性增生时，骨髓涂片中不一定可以发现原始细胞增多，因为急性白血病等肿瘤缓解时，骨髓涂片中的缓解可早于骨髓切片，而在即将复发时又可迟于骨髓切片，故检出ALIP和原始细胞小灶性增生有极其重要的意义。如急性白血病缓解时可获得继续强化治疗的机会，复发时又可为治疗获得最佳时间。一般认为，判断白血病微小残留病变的阳性条件为每平方毫米ALIP ≥ 3个。

5.评估肿瘤浸润性结构的最佳指标

ALIP和造血细胞集积性异常增生常是造血和淋巴组织肿瘤的早期浸润结构。通常，按肿瘤细胞浸润造血组织的早期、中期、晚期的组织形态学可分为以下几种类型，但在各型之间可存在混合型。

（1）间质型（图4-108）：

见于肿瘤浸润的早期，整个骨髓结构存在，但散在性分布着瘤细胞，偶见三五成簇。

（2）结节型：

瘤细胞呈局灶性聚集，形成结节，结节大小不一，浸润区周围的骨髓结构仍保持完整（图4-109），多见于肿瘤浸润的早中期，如转移性癌、PCM、淋巴瘤和MPN进展时。

（3）骨小梁旁型：

瘤细胞灶性增生位于骨小梁旁区（图4-110），如淋巴瘤和CML加速期时可见瘤细胞或原始、早幼粒细胞沿骨小旁浸润性生长，AML缓解后早期复发的原始、早幼粒细胞的骨小梁旁生长。

（4）弥散型：

肿瘤细胞弥漫浸润，造血主质中正常骨髓成分消失，或造血细胞 ＜ 10%（图4-111），多见于白血病，也见于淋巴瘤、PCM等疾病的中、晚期。造血细胞 ＞ 10%时，肿瘤细胞常呈松散的弥散性浸润，称为非纯一性浸润。

造血和淋巴组织肿瘤早期浸润骨髓组织时，瘤细胞常呈小簇状、片状或丛集样浸润，造血组织结构基本保留；中晚期肿瘤呈弥散性浸润性时，造血组织消失。而癌瘤转移骨髓时，表现为不均一的簇状或大片状浸润性结构特征，并在癌瘤细胞外周可见增生的纤维组织，造血细胞残留。腺癌浸润时还可见癌细胞呈腺管样结构，鳞癌浸润可见癌珠结构或卷曲样癌细胞团状结构（图4-112）。

（5）评估骨髓纤维化唯一的直接指标：

骨髓切片是评估纤维组织有无增生的唯一项目，是诊断PMF的唯一检验，常是评估AML、CML、MDS、MPN、MDS-MPN 伴骨髓纤维化时提示疾病进展或预后欠佳的项目。骨髓纤维化常是除PMF外MPN中晚期的共同病理过程。PMF时，纤维组织弥散性增生，造血组织被替代，造血细胞少量残留。其他造血和淋巴组织肿瘤伴有骨髓纤维化的程度不一，以局灶性和散在性增生为多见（图4-113）。肿瘤转移骨髓伴随的纤维组织增生也大多为局部性，位于肿瘤细胞周围或骨小梁旁增生。

白血病骨髓涂片标本中骨髓小粒的多少与网硬蛋白的多少有一定关系，粒单系白血病常不伴有网硬蛋白增加，而急性淋巴细胞白血病常伴有网硬蛋白增加，故在骨髓涂片上反映前者骨髓小粒常见，而后者多无骨髓小粒。

（6）观察部分病态造血细胞优于骨髓涂片和印片：

骨髓切片中的病态造血细胞，最易辨认的是病态巨核细胞（微小巨核细胞除外），双核、多核病态细胞也易于检出（图4-114），对巨核细胞的大小和核叶多少的观察常比骨髓涂片容易，也容易观察低核叶巨核细胞。这些对评估MPN、MDS-MPN等疾病进展性有参考价值。一般，切片中的病态粒细胞和病态幼红细胞形态都不及涂片明显和多样性，但与涂片一起结合检查仍有非常重要的价值。

（7）可以观察骨髓涂片不能观察的一些特殊结构：

骨髓切片中可以检出的诸如淋巴小结、类上皮肉芽肿组织等结构（图4-115），有重要的意义，而这些异常在骨髓涂片由于细胞被制片中分散而不能检查。除此之外，骨小梁的结构、间质和血管的异常等，骨髓涂片和骨髓印片均不能观察。

（三）报告方式和诊断要求

骨髓活检诊断报告的要求同骨髓涂片诊断报告，下结论以证据为基础。由于骨髓活检诊断报告往往比骨髓涂片有更高的可靠性和可信度，应以更高的责任心检查每一份标本并给予适当的诊断（或结论）。按异常特征、意义大小分为以下几个诊断性意见。报告的结论应包括病损的程度和疾病诊断。

1.明确诊断

如果切片内出现显著的特征性改变，且与临床和骨髓涂片所见吻合，即可得出明确的诊断性意见。例如，骨髓组织学检查符合骨髓增殖性肿瘤不能分类型。骨髓切片检出转移性肿瘤细胞可以作出独立的诊断。

2.提示性诊断

如骨髓切片检查结果与临床诊断不一致，但组织形态学有一定的特征性，可提示或考虑某病的诊断，供临床参考，并提出完善检查的建议。

3.描述性诊断

如果检出某种组织形态的改变，但属于非特异性，不能作出肯定或否定意见时，可直接描述组织形态学所见，并作出适当的评论。如果涉及鉴别诊断或尚不能赖以确诊等一类问题时，应提出一些建议，包括尚需做哪些补充检查等。

4.其他

当切片组织像在正常范围以内，可报告为“未见明显异常（骨髓象）”或“造血基本良好，未见特殊组织结构和成分（骨髓象）”。对取材不合标准者，不必勉强作出诊断，可直接告知原因，或对骨髓组织主要形态进行描述，建议结合其他检查，必要时重新取材等。

骨髓切片图文报告的设计与要求与骨髓涂片图文报告基本相同。应突出异常组织结构和细胞，要求低倍和高倍的典型组织学图像各一幅。有纤维组织增生或其他特殊异常时，应显示异常的组织图像。

三、骨髓组织形态学

骨髓组织由造血细胞、非造血细胞、神经、血管和基质组成，包括相关的骨组织。造血细胞有造血干细胞、祖细胞、原始细胞及处于不同成熟阶段的各系列细胞，非造血细胞由网状细胞、（原）纤维细胞、脂肪细胞（adipocytes）等组成。非造血细胞与诸如血管、神经和细胞外基质（extracellular matrix）共同组成造血微环境。

（一）正常形态学

1.骨质

（1）骨单位：骨单位（osteon），位于内、外环骨板之间，为多层同心圆排列的圆筒形骨板，与骨的长轴平行。骨单位中心为一条纵行的中央管，管内有毛细血管和小静脉，是血管和神经的通路。

（2）皮质骨：皮质骨（cortical bone）位于骨的外部或周围，呈不同厚度的致密板层结构。骨膜附着于其外表面，内膜衬里细胞层被覆于内面。

（3）骨小梁：骨小梁（bony trabeculae）是皮质骨在松质骨内的延伸部分，呈树杈状和不规则细杆状的立体网状结构，起支持造血组织的作用（图4-105），骨小梁是切片组织结构观察的对象之一，是极其重要的定向结构（如造血细胞位于骨小梁旁或远离骨小梁生长）。骨小梁的骨质由骨细胞，胶原纤维和骨基质等组分构成。骨小梁之间分布着有一定规律性的造血细胞，肿瘤性造血时，由于肿瘤细胞不同程度的增生和浸润方式，导致不同特征的组织学结构。随着年龄的增长，骨小梁容积逐渐减少，脂肪组织相应增加，尤其位于骨小梁旁区的骨髓组织脂肪化。反之，当骨小梁旁区全由造血细胞组成时，提示造血明显旺盛或造血肿瘤弥散性浸润。

（4）成骨细胞：成骨细胞（osteoblast），也称原始骨细胞，由紧贴骨内膜表面扁平的骨原细胞（多潜能细胞）分化而来。成骨细胞外形与浆细胞类似，核偏心，可见淡染的胞质区，呈立方状位于骨内膜表面或集积于骨小梁的壁龛区。胞核染色质中等量，可见核仁，胞质弱嗜碱性（图4-116）。在骨小梁表面出现规则排列的成骨细胞时，常提示活跃的骨重建过程。浸润性肿瘤时，易见成骨细胞。

（5）破骨细胞：破骨细胞（osteoclast）胞体大，有多个胞核，核呈卵圆形，染色质纤细，核仁明显，胞质轻度嗜酸性，伴有短的分枝状突起（图4-116）。常定位于扇形骨小梁表面或侵蚀性壁龛内，肿瘤浸润时，易见破骨细胞，部分造血减低时破骨细胞也易见，Paget病时破骨细胞及其胞核数明显增加。

2.间质脂肪细胞、血管系统、神经纤维、结缔组织间充质（基质）、成纤维细胞样细胞、网状-巨噬细胞等共同构成造血组织的间质。动脉、微动脉和血窦（控制成熟血细胞的释放）的切片纵面和横切面均易见，小动脉有较厚的肌壁层，血窦壁薄（图4-117）。骨髓血管多少与造血旺盛程度有关。

3.造血细胞

（1）粒系细胞

1）原始粒细胞和早幼粒细胞：常单个（少数可2个）地分布于小梁旁区或间区之血管周围，核膜较厚，可见1个以上大而清晰的核仁，深蓝色或暗紫色。在浅蓝色的常染色质内，可见大小不等的异染色质颗粒。通常原始粒细胞胞质量少，而早幼粒细胞较丰富。

2）中、晚幼粒细胞：中幼粒细胞胞体中等大小，核偏位，核膜厚，可见核仁，异染色质呈块状，胞质浅粉红色，可见明显发育的高尔基体（图4-118）。清晰的切片标本，还可见纤细粉红色或棕色点状的中性颗粒；嗜酸颗粒稍粗，呈橘红色或鲜艳亮红色，嗜碱颗粒因易溶于水溶性固定剂，不易观察。晚幼粒细胞核常呈半锯齿状切迹，核膜厚，异染色质更显致密深蓝，聚集成块，常染色质减少。

3）杆状核和分叶核粒细胞：杆状核胞体较小，胞核着色深，胞质不着色或染粉红色，中性杆状核可见细小的浅红色颗粒；嗜酸性杆状核胞质内颗粒粗大，着亮红色。分叶核粒细胞胞体小，核分叶状且着色深，胞质不着色或染粉红色，中性分叶核可见细小的淡红色颗粒或无颗粒；嗜酸性分叶核可见亮红色或橘红色粗大颗粒。

（2）有核红细胞

1）原、早幼红细胞：原始红细胞核圆形居中，核仁深蓝，清晰或隐约可见。核内异染色质呈蓝棕色颗粒或小块状，常染色质呈淡蓝或浅紫色，胞质深蓝色或灰蓝色（图4-119）。早幼红细胞胞体较原始红细胞小，核圆，核膜厚，核仁隐约可见或无核仁，异染色质量多，呈块状。胞质强嗜碱性，蓝色或蓝紫色。

2）中幼、晚幼红细胞：中幼红细胞胞体较早幼红细胞为小，核小而圆形，核膜不清，异染色质呈深蓝或蓝紫色，比早幼红细胞更致密。常染色质量少，无核仁，胞质较丰富。晚幼红细胞胞体更小，核圆，居中或偏位，核内异染色质凝缩呈深蓝或紫蓝色，胞质可呈浅粉红色或不着色（图4-120）。

（3）巨核细胞：正常切片每个高倍视野可见1～2个巨核细胞。成熟巨核细胞通常散在单个地分布于小梁间区间隙内，且不发生群集现象，也不相互密接，但可以两个巨核细胞在一起（图4-121）。

切片中，原始巨核细胞不易识别，需要依赖血小板过氧化物酶的超微结构或单克隆抗体CD41或CD61等标记技术。幼巨核细胞大小为20～80μm，核大，肾形或不规则形，也可呈分叶状，核仁不定，异染色质致密粗颗粒或小块状，深蓝色，胞质量较多，弱嗜碱性。颗粒型巨核细胞为50～100μm，核大而不规则，高度分叶状，异染色质呈粗密块状，深蓝色，可见浅灰色的常染色质。胞质量多，均匀嗜碱性，隐约可见数量不等的粉红色细小颗粒，但观察不到血小板生成和散在于细胞外成簇状的血小板。

（4）淋巴细胞：常单个散在分布于造血主质与脂肪细胞之间，偶尔可聚集形成淋巴小结（图4-122）。淋巴小结多见于老年人和成熟淋巴细胞肿瘤的早期。淋巴细胞胞核小，圆形居中或稍偏位，核膜厚，可见斑点样异染色质，常染色质染浅棕色，异染色质与常染色质间境界清楚，可与晚幼红细胞的同质性核结构（图4-122）相鉴别。

（5）浆细胞：常定位于小血管壁四周，或单个及2～3个散在小簇分布于主质及其他部位；胞核圆形多偏位，异染色质呈粗颗粒或小块状，核周边聚集成块，着色深，胞质带宽，染色不均，淡紫或暗红色，伴核周高尔基淡染区（图4-123）。

（6）单核细胞和巨噬细胞：骨髓中有少量单核细胞不易检出，也常不易与幼稚粒细胞鉴别，但单核系细胞增多时可观察到不规则的形态特点。巨噬细胞定位于骨髓的各个部位（图4-124），定居型和游走型巨噬细胞（一般所述的巨噬细胞）均不易观察。

（7）肥大细胞和嗜碱性粒细胞：在WG染色和甲苯胺蓝混合染色标本中，肥大细胞和嗜碱性粒细胞颗粒呈紫红色或紫黑色（图4-125）。在HGF染色中通常不易观察嗜碱颗粒。

（二）异常形态学

1.结构性异常

（1）骨质异常：

健康人骨小梁具有一定的长度，相互之间有一定的间距，占造血组织的平均值为26%±5%。骨小梁变细见于造血组织增生极度活跃，包括造血组织被异常细胞替代时；骨小梁增宽和新生骨形成，见于骨髓硬化、骨髓纤维化或造血组织萎缩时；骨小梁被侵蚀性破坏是恶性肿瘤浸润的特征之一（图4-126）。骨小梁萎缩还与骨质疏松有关。

（2）移位性异常结构：

不同类型的造血细胞在骨髓中造血有一定的分布区域，当某一细胞在正常分布区域移位于其他部位增殖时称为移位性结构（组织），也称错位性结构。常见移位性结构是巨核细胞簇错位增生和ALIP（图4-106）。

（3）瘤细胞浸润性异常结构：

造血和淋巴组织肿瘤早期浸润骨髓组织的形态学见图4-108～图4-112。

（4）纤维组织异常增生：

纤维组织弥散性增生时，网状纤维呈片状卷发样结构（图4-113），造血组织被替代，常有巨核细胞的多形性异常，主要见于PMF和其他MPN等疾病中晚期，局部纤维组织增生见于许多疾病，如造血和淋巴组织肿瘤与转移性肿瘤。

（5）骨小梁旁细胞层增厚：

正常的幼粒细胞常位于骨小梁旁生长，细胞层2～3层，CML时幼粒细胞位于骨小梁旁增生，细胞层增厚至5～6层（图4-127）。这一结构属于聚集性增生的异常组织，若为较均一的原、早幼粒细胞，可预示急性变趋向。

（6）淋巴小结：

正常骨髓中淋巴细胞分布有两种方式：散在性分布和丛簇状、结节状分布。结节状分布者称为淋巴小结（lymphoid nodule），也称淋巴细胞聚集（lymphocytic aggregate），在正常的青少年骨髓切片中不易见淋巴小结，在中老年人中可见，也见于许多良性疾病（如SLE、类风湿关节炎、糖尿病、免疫性疾病等）。但正常情况和良性疾病中，淋巴小结多位于造血主质，直径 ＜ 3mm，由成熟淋巴细胞组成，小结边缘界线较为明显，小结外缘为明显的造血细胞（图4-122）。检出较巨大的淋巴小结和多个淋巴小结时，应疑似成熟淋巴细胞肿瘤或其早期病变。

2.间质的变化

脂肪组织比例增多（见于造血功能减退），脂肪细胞液性坏死（如AA、骨髓坏死），血管的异常可见静脉窦扩张与破裂（如恶性造血系疾病），窦腔内造血（见于MPN），红细胞渗出（间质出血）、间质水肿、类上皮肉芽肿（见于结核等特殊感染）。

类上皮肉芽肿形成为单核巨噬细胞局部集积、伴有上皮细胞、淋巴细胞等细胞的融合和若干坏死组织的结节性病灶（图4-115），可单个或多个存在或融合在一起。引起肉芽肿的病原体有结核分枝杆菌、细胞内鸟形分枝杆菌、真菌、布氏杆菌、组织胞浆菌、放线菌、肺炎支原体和病毒（如巨细胞病毒）等。在肉芽肿中，最具特异性为结核性肉芽肿，常是全身性结核（如粟粒性结核）经血流扩散到骨髓的一种表现，常见多核的朗汉斯（Langhans）巨细胞，可见干酪样坏死，它们周围有较多单核巨噬细胞、类上皮细胞和淋巴细胞，偶见中性粒细胞和浆细胞多（图4-115）。

3.造血细胞形态异常

造血细胞数量变化容易观察，个体细胞的形态学异常往往较难察觉，尤其是不明显的细胞形态变化。对诸如胞质Auer小体、Howell-Jolly小体、点彩、空泡和部分颗粒，以及红细胞（部分球形细胞除外）形态和血小板等。但细胞大小、形状变化和胞核的异形性改变较易观察。

（1）巨幼细胞和粒细胞：

见于MA，为原始红细胞和早幼红细胞胞体明显增大，伴有明显的集积性增生，呈片状或条索状（图4-128）。巨变晚幼和杆状核粒细胞为细胞增大和核的肥大。这些细胞中，除原、早幼红细胞集积性增生外，巨幼变细胞形态学常不如涂片容易评判。

（2）小型中晚幼红细胞：

IDA时，中、晚幼红细胞簇状出现，伴有胞体小型改变以及胞核的明显深染。这一细胞形态也见于地中海贫血和慢性感染性贫血。

（3）病态造血细胞：

MDS和其他髓系肿瘤时易检出双核、多核幼红细胞，以及小巨核细胞和多小圆核巨核细胞。

（4）异形性巨核细胞：

异形性巨核细胞为细胞大小变化和异形性改变，往往伴有细胞的普遍性小型化、细胞核小型化、核叶减少（低核叶）和核形发生各异的形态，巨核细胞常为异常增生（数量增多），见于MPN，尤其是PMF和MDS-MPN，也是CML、PV、ET等MPN向骨髓纤维化发展的形态学特征（图4-102）。

（5）白血病性髓系原始细胞：

正常及一般标本中偶有原、幼单核细胞，但不易检出。白血病时细胞形态学与相应阶段的形态基本一致，常呈弥散性分布，但细胞核异染色质量少，不及原始淋巴细胞明显。原始单核细胞不规则性形态虽可观察，但不及涂片清晰（图4-129）。AML-M3时的颗粒过多早幼粒细胞，细胞较大，胞核多偏位，胞质丰富、可呈轻度嗜酸性着色，而涂片中密集的多颗粒则不易观察（图4-129）。

（6）白血病性原始淋巴细胞：

ALL的原始淋巴细胞胞核呈圆形、卵圆形至轻度凹陷，形态均一，可见不定形的明显核仁，核染色质细致分散。原始淋巴细胞异染色质丰富和核膜明显是其形态特点之一（图4-130）。

（7）原幼淋巴瘤细胞：

淋巴瘤细胞在不同的病例间差异大，通常细胞明显大小不一、异形性明显，可见圆形或凹陷的胞核、核膜较厚、异染色质呈粗颗粒状、易见深蓝色核仁（多为1个）、胞质量少、淡蓝或浅棕色，淋巴瘤早期浸润常为散在性（图4-131），晚期可出现弥散性浸润。由于淋巴瘤细胞大小和形状不一，常需要结合涂片形态学和临床信息。幼稚T淋巴瘤细胞可见不规则核形。

（8）肿瘤性成熟淋巴细胞：

主要为CLL和小淋巴细胞淋巴瘤，属于B细胞，罕见为T细胞，共性形态特点为细胞小、胞质少、核着色深、异染色质丰富而呈斑点状分布（图4-122），着色较深而不同于原始淋巴细胞。成熟T细胞胞体也较小，核质比例高，核形高度不规则，扭、折、鼓、突形态较为明显。

（9）多毛细胞：

见于HCL。多毛细胞呈小圆形或豆形，胞质丰富、周边可呈油煎荷包蛋白样外观，有丝分裂象缺乏，细胞与细胞之间间距宽（图4-132），常呈簇状或片状浸润。

（10）幼稚浆细胞：

一般骨髓切片标本中偶见幼稚浆细胞，易见时多为浆细胞骨髓瘤。细胞形态：胞核明显偏位、染色质可呈车轮状，胞质丰富、嗜碱性，少量出现时见于反应性浆细胞增生；幼稚浆细胞异形性或畸形性，如大小不一、胞体胞核不规则、大或巨大蓝染核仁、双核多核（图4-133）大多见于PCM；浆细胞白血病的浆细胞常具有弥散性和形态单一（同质）性特点。部分幼稚浆细胞因数量少和形态类似原始红细胞样或胞膜不明显而不易辨认。反应性浆细胞增多通常为五个或六个浆细胞围绕骨髓动脉呈小丛状，不见明显的幼稚型，而浆细胞肿瘤常呈大的病灶、结节或集簇。

（11）浆细胞样淋巴细胞：

细胞胞体偏小，胞质比淋巴细胞为丰富，偏于一侧似鞋形（图4-134），为LPL或Waldenstrom巨球蛋白血症的主要瘤细胞，也可见于PCM和其他淋瘤。

（卢兴国）