第三节　白细胞检验技术

一、白细胞计数

（一）白细胞计数常规法

1.原理

白细胞计数（white blood cell count）采用白细胞稀释液将血液稀释一定的倍数，同时破坏溶解红细胞。将稀释的血液注入血细胞计数板，在显微镜下计数一定体积内白细胞数量，经换算即可求出每升血液中的白细胞数量。

2.器材和试剂

（1）白细胞稀释液：

2%冰乙酸溶液中加入10g/L结晶紫3滴。

（2）器材：

显微镜、改良Neubauer计数板（improved Neubauer counting chamber）、盖玻片和微量吸管，等。

3.操作

（1）吸取稀释液：

用吸管吸取白细胞稀释液0.38ml于小试管中。

（2）吸取血标本：

用微量吸管吸取新鲜全血或外周血20μl，擦去管尖外部余血。将吸管插入小试管中白细胞稀释液的底部，轻轻放出血液，并吸取上层白细胞稀释液洗尽管内壁2～3次。

（3）混匀悬液：

将试管中的血液与稀释液混匀，待细胞悬液完全变为棕褐色。

（4）充液：

再次将小试管中的细胞悬液混匀。用玻棒蘸取细胞悬液1滴，注入改良Neubauer计数板的计数池中，室温下静置2～3分钟，待白细胞完全下沉后再做白细胞计数。

（5）低倍镜计数：

计数范围为计数板的四角4个大方格内的白细胞总数。

（6）计算：

如下式。

在式2-11中，N：4个大方格内数得的白细胞数；4：每个大方格的白细胞平均数量；×10：将1个大方格白细胞数换算成1.0μl血液内白细胞数；×20：血液的稀释倍数；×106：由 1μl换算成 1L。

4.方法学评价

（1）干扰因素：

①充池影响：充池前应适当用力、快速振荡30秒，以充分混匀白细胞悬液，但应避免过多气泡影响充池和准确计数；充池应避免充液过多、过少、断续，避免气泡及充液后移动盖玻片。②白细胞因素：白细胞数量过多时，应采用加大稀释倍数的方法；数量过少时，可采用扩大计数域的方法，否则影响计数准确性。③加盖玻片影响：加盖玻片的方式可影响充液的高度，进而影响计数结果，WHO推荐采用推式法，此法较盖式法更能保证充液体积的高度为0.10mm。

（2）质量保证：

①校正工具：稀释用吸管、微量吸管、改良Neubauer计数板均为计量工具，使用前需经过严格的校正，否则将直接影响计数结果的准确性；②计数池内细胞分布：细胞分布应尽可能均匀，各大方格间的细胞数相差不应超过10%，若相差太大，应重新充池；③计数原则：计数大小方格内的压线细胞时，遵循数上不数下、数左不数右的原则；④校准原则：白细胞稀释液不能破坏有核红细胞，后者可使白细胞计数结果偏高，此时应计算白细胞校正值，公式如下：

（二）白细胞计数参考方法

白细胞计数参考方法见于国际血液学标准委员会1994年文件（ICSH. Reference method for the enumeration of erythrocytes and leucocytes. Clin Lab Haematol，1994，16 ：131-138）。

1.一般技术要求

同红细胞计数参考方法。制备双份稀释标本，每0.08ml血液中加入20ml稀释液中，计数前加入溶血剂。在确保红细胞完全溶解、红细胞残骸不至计入白细胞、溶血剂对白细胞计数发生影响之前，对白细胞进行计数。计数红细胞的小孔管可用于白细胞计数。

2.计数方法

（1）阈值验证：

将低阈值设在红细胞碎片引起的噪声和白细胞信号之间。

（2）重叠校准：

制备4份原级白细胞稀释标本，取0.02、0.04、0.06和0.08ml血液分别加入20ml稀释液。回归线的交点代表最大浓度原级稀释标本（0.08ml+20ml）的重叠校准值。重复检测的次数分别为12、6、4、3次。用计数值乘以251得出白细胞的计数值。

（3）误差分析：

白细胞计数的最大允许偏倚为4%。

（三）参考区间

成人：（4～10）×109/L；

儿童：（15～20）×109/L；

婴儿：（11～12）×109/L；

新生儿：（15～20）×109/L。

（四）临床意义

1.增加

①生理性增加：新生儿、活动和进食后、运动、疼痛、情绪激动、妊娠期、分娩期和吸烟等；②病理性增加：常见于急性感染、炎症、组织损伤、血细胞破坏、急性失血、恶性肿瘤和急性中毒等。

2.减少

常见于感染、血液病、理化损伤、脾功能亢进和自身免疫疾病等。

二、白细胞分类计数和异常白细胞形态检查

（一）白细胞分类计数常规法

1.原理

白细胞分类计数（differential leukocyte count，DLC；differential count，DC）是将血液制成细胞分布均匀的血涂片，用瑞特染液染色，根据各类细胞的形态特点和颜色差异将白细胞区别并进行计数。通常分类100个白细胞，计算得出各种白细胞所占的百分率。

2.器材和试剂

（1）试剂：

瑞特染液和磷酸盐缓冲液。

（2）器材：

显微镜、载玻片等。

3.操作

（1）制备血片：

将血涂片用瑞特染液染色，冲洗干净，自然干燥后待用。

（2）低倍镜观察：

在全片对细胞分布、数量、染色情况作初步估计。

（3）油镜观察：

选择血片细胞分布和染色良好区域（一般在血片体尾交界处），加香柏油1滴，对白细胞从细胞大小、细胞核、细胞质等多方面作认真仔细地观察。

（4）顺序计数：

观察100个或200个中性粒细胞，记录相应5类白细胞数量。

（5）计算百分率：

按各类白细胞数量计算出各自的分类百分率。

（6）白细胞形态观察：

油镜下，在同一张血片上，观察记录有病理变化各种白细胞形态。

（7）计算中性粒细胞毒性指数：

4.方法学评价

（1）干扰因素：

①细胞分布因素：首先应采用低倍镜观察血涂片的染色质量及细胞分布情况，注意血涂片边缘及尾部有无巨大的异常细胞和寄生虫等，若发现异常应报告。②异常细胞：分类计数中若发现异常或幼稚白细胞，应逐个分类计数和报告，并包括在白细胞分类的比值或百分率中。分类计数中见到幼稚红细胞，应逐个计数，但不计入100个白细胞内，而以分类100个白细胞时见到幼稚红细胞的数量来报告，并注明其所属阶段。③红细胞和血小板形态和数量：应在同一张血片上注意观察成熟红细胞和血小板的形态、染色、数量及其分布情况。有核红细胞可干扰白细胞计数和分类。④区别含中毒颗粒的中性粒细胞和嗜碱性粒细胞：区别要点是：嗜碱性粒细胞与中性粒细胞比，细胞核较少分叶，染色较浅，嗜碱颗粒着色更深，较大且大小不均匀，细胞边缘常分布较多，常覆盖分布于细胞核上。⑤染色质量：血涂片染色偏碱或染色时间过长时，中性颗粒可误认为中毒颗粒，故应注意全片各种细胞的染色情况。

（2）质量保证：

①血涂片制备和染色。血涂片不良将影响白细胞分类计数结果，甚至导致错误的分析结果。目前，普遍采用传统的楔形，约3cm×2cm，表面光滑，两边留有小于0.3cm的空隙，中间有恰当大小（1.0～1.5cm）的阅片区，另一端有同样大小的厚片区。染色后的细胞色彩鲜明，能显示出各种细胞特有的色彩，细胞核结构和细胞质颗粒清楚。②注意细胞分布特点。因各种白细胞的体积和密度不同，在血涂片中分布不均匀。体积较小、密度较大的淋巴细胞在体部较多，而体积较大、密度较小的单核细胞和粒细胞在尾部和两侧较多，异常大的细胞则常出现在尾部。因此，应选择细胞分布均匀、染色效果好的部位进行分类。若采用离心法涂片，可获得细胞分布均匀、形态完好的血涂片。③白细胞数量。白细胞分类计数的准确性与分类计数的白细胞数量有关，被计数的白细胞占总计数白细胞的比例越大，误差就越小，为兼顾临床工作效率，分类计数白细胞数量可根据白细胞总数而定。

（二）白细胞分类计数参考方法

白细胞分类计数参考方法见于美国临床实验室标准委员会1992年文件［NCCLS. Reference leukocyte differential count（proportional）and evaluation of instrument method.Approved standard. NCCLS H20-A.1992］及我国卫生部于2005年发布实施的卫生行业标准WS/T 246—2005《白细胞分类计数参考方法》。

1.血涂片制备

（1）血片数量：

每份标本制作3张血涂片。要求所用玻片清洁、干燥、无尘，大小为25mm×75mm，厚度为0.8～1.2mm，并有明确标记。如果标本中白细胞数量少时，需要制备更多血涂片。

（2）制片前：

使用EDTA·K₂抗凝血血液标本时，应在采集后4小时内制备血涂片。在制片前，标本应充分混匀。

（3）制片中：

用楔形技术制备血涂片。在玻片近一端1/3处，加1滴（约0.05ml）充分混匀的血液，握住另一张较狭窄的、边缘光滑的涂片，以30°～45°角使血滴沿推片迅速散开，快速、平稳地推动推片至玻片的另一端。

2.血涂片染色

罗氏染液（Romanowsky stain）由亚甲蓝和/或亚甲蓝氧化产物（天青B）和卤化荧光素（通常为伊红B或Y）组成。良好的染色能准确鉴别成熟和未成熟白细胞或异常细胞。

在采血制片1小时内，用罗氏染液染色，或在1小时内用无水甲醇（含水量 ＜ 3%）固定后染色。

3.血涂片检查步骤

（1）显微镜检查顺序：

低、高倍镜（10～40倍）进行浏览，观察有无异常细胞和细胞分布情况；然后在油镜下（100倍），观察细胞质内的颗粒和核分叶情况。

（2）视野观察顺序：

检查从约50%的红细胞互相重叠区域开始，向红细胞完全散开的区域推移，血涂片较薄的区域，呈羽状，为“血片边缘”区域。

（3）判别“可接受”区域：

中性粒细胞、单核细胞和淋巴细胞分布均匀的区域为血涂片分类“可接受”区域，当白细胞总数正常时，在血涂片尾部和边缘，每油镜视野所见的白细胞数量不超过血涂片体部的2～3倍。

（4）判别“可接受”细胞：

除某些病理情况外，破碎细胞或不能识别细胞数量不超过白细胞总数的2%，若破碎细胞仍能明确鉴别，应包括在分类计数中。在结果报告中，应设其他栏，以备填写破碎细胞或不能识别细胞，并作适当描述。

（5）分类计数顺序：

采用“城垛式”方法检查血涂片，每个明确识别的细胞必须归入下列分类中：中性分叶核粒细胞、中性杆状核粒细胞、淋巴细胞、异型淋巴细胞、单核细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、其他有核细胞，能明确识别的破碎细胞，应恰当分类。

计数总白细胞数量：每张血涂片应计数200个白细胞，若标本中白细胞数量减少，应增加检查血涂片的数量。

（6）计算白细胞分类结果：

以各类白细胞的百分率和绝对值表示。白细胞分类绝对值=白细胞分类百分率×白细胞计数值

（7）计数有核红细胞：

结果以每100个白细胞计数中见到几个表示。

（三）参考区间

见表2-10和表2-11。

（四）临床意义

1.正常白细胞形态

（1）中性分叶核粒细胞（neutrophilic segmented granulocyte, Neg）：

细胞大小为10～15μm，呈圆形或卵圆形，细胞核与细胞质比率为l：3，细胞核分叶，叶间有丝状连接，分为2～5叶，核染色质聚集，无核仁，细胞质染成淡粉红色，含大量特异性颗粒。

中性杆状核粒细胞（neutrophilic stab granulocyte，Nst）：细胞大小为10～18μm，呈圆形或卵圆形，细胞核与细胞质比率为1：2～1：1.5，细胞核呈S形、C形、U形或分叶形，可见峡状染色质，核染色质粗颗粒状聚集，无核仁，细胞质丰富，染成粉红色，含大量特异性颗粒，罕见嗜天青颗粒。

中性粒细胞增多和减少的临床意义同白细胞计数。

（2）淋巴细胞（lymphocyte, L）：

细胞大小为 7～15μm，呈圆形或卵圆形，细胞核与细胞质比率为5：l～2：l，细胞核通常呈圆形或卵圆形，偶见核凹陷或轻度切迹，核染色质散在致密或粗颗粒状聚集，副染色质无或少量，无核仁，有时可见小的、淡的核小体，细胞质少至中等量，淡蓝色至中度嗜碱性，可见核周淡染区，有时有副核窝，小淋巴细胞无颗粒，大淋巴细胞的细胞质较多，含少量粗大嗜天青颗粒。

淋巴细胞增多常见于感染性疾病、肿瘤性疾病和组织移植术后等。减少常见于流行性感冒、人类免疫缺陷病毒（HIV）感染和结核病等。

（3）单核细胞（monocyte, M）：

细胞大小为 12～20μm，呈圆形，可有伪足，细胞核与细胞质比率为4：1～2：1，细胞核形态各异，呈圆形、卵圆形、马蹄形、切迹形或分叶形，核染色质轻度聚集，无核仁，细胞质含蓝灰色颗粒，少量空泡。

单核细胞增多常见于感染、结缔组织病、血液病和恶性肿瘤等。

（4）嗜酸性粒细胞（eosinophil, E）：

成熟型细胞大小为10～15μm，幼稚型细胞大小为10～18μm，呈圆形或卵圆形，成熟型细胞核与细胞质比率为l：3，幼稚型细胞核与细胞质比率为l：2～2：l，细胞核分叶状，通常2～3叶，由细丝状染色质连接，分叶核和杆状核的核染色质致密、块状，幼稚型的核染色质疏松、细致，无核仁，细胞质内充满粗大、球形、均一的橘红色有折光性的颗粒，部分可脱颗粒，幼稚型可含有少量深紫色嗜天青颗粒。

嗜酸性粒细胞增多常见于过敏性疾病、寄生虫病、皮肤病、感染性疾病和血液病等。减少常见于传染病急性期、严重组织损伤和垂体或肾上腺皮质功能异常等。

（5）嗜碱性粒细胞（basophil, B）：

细胞大小为 10～15μm，呈圆形或卵圆形，细胞核与细胞质比率为1：3～1：2，细胞核分叶状，常被颗粒覆盖，核染色质聚集，无核仁，细胞质含粗大、致密、深紫色或黑色颗粒。

碱性粒细胞增多常见于过敏性和炎症性疾病、嗜碱性粒细胞白血病和骨髓增殖性疾病等。

2.异常粒细胞形态

国际血液标准化委员会（ICSH）将髓系细胞定性异常分为：①胞质异常，包括中性粒细胞中毒颗粒、空泡、Döhle小体、Auer小体；②胞核异常，包括中性粒细胞分叶过多、中性粒细胞分叶减少。淋巴系细胞定性异常分为：①反应性淋巴细胞（异型淋巴细胞，可疑良性）；②异常淋巴细胞（异型淋巴细胞，可疑恶性）。

（1）中性粒细胞核分裂象变化：

包括核左移和核右移。核左移（shift to the left）是指外周血中性杆状核粒细胞增多和/或出现晚幼粒细胞、中幼粒细胞，甚至早幼粒细胞的现象（杆状核以前阶段细胞 ＞ 5%）。常见于化脓性感染、急性溶血和应用细胞因子等。若核左移伴白细胞总数增高称为再生性左移（regenerative shift to the left），常见于急性化脓性感染、急性中毒和急性溶血等。若核左移伴白细胞总数正常或减低称为退行性核左移（degenerative shift to the left），常见于再生障碍性贫血、粒细胞缺乏症和伤寒等。

核右移（shift to the right）是指外周血中性分叶核粒细胞增多，并且5叶核以上中性粒细胞 ＞ 3%的现象。常见于巨幼细胞性贫血、内因子缺乏所致的恶性贫血和感染等。

（2）中性粒细胞毒性变化：

在严重化脓性感染、败血症、恶性肿瘤、急性中毒和大面积烧伤等病理情况下，中性粒细胞可发生一系列形态变化，具体表现为：①大小不均（anisocytosis）：中性粒细胞的体积大小相差悬殊，不均一性增大；②中毒颗粒（toxic granulation）：中性粒细胞的胞质中出现比正常中性颗粒粗大、大小不等的紫黑色或深紫褐色颗粒；③空泡形成（vacuolation）：中性粒细胞的胞质或胞核可出现1个或数个空泡；④Döhle小体（Döhle body）：中心粒细胞因毒性变化而在胞质中保留的局部嗜碱性区域，呈圆形、梨形或云雾状，染成天蓝色或灰蓝色，直径0.1～2μm，最大可达5μm，单个或多个，常位于细胞边缘；⑤退行性变（degeneration）：细胞发生胞体肿大、结构模糊、边缘不清楚、核固缩、核肿胀和核溶解等现象。

（3）中性粒细胞核形态变化：

①多分叶核中性粒细胞（hypersegmented neutrophil）：成熟中性粒细胞胞体增大，核分叶5～9叶，甚至10叶以上，各叶大小差异很大，核染色质疏松，常见于巨幼细胞贫血等；②巨杆状核中性粒细胞（giant band neutrophil）和巨多分叶核中性粒细胞（giant hypersegmented neutrophil）：前者胞体可大至30μm，核染色质略细致，着色变浅，胞核呈肥大杆状或特长带状，后者胞核分叶超过5叶，常见于巨幼细胞贫血和恶性贫血等；③双核粒细胞（dual-nuclei granulocyte）和环形核粒细胞（ring-shaped nuclei granulocyte）：前者是中性粒细胞内出现2个细胞核，后者是杆状核呈环形，常见于骨髓异常增生综合征、粒细胞白血病和巨幼细胞贫血等。

（4）Auer小体（Auer bodies）：

又称棒状小体。粒细胞胞质中出现的红色细杆状物质，1个或数个，长1～6μm。若出现数个Auer小体呈束状排列，称为faggot细胞。常见于急性粒细胞白血病。

（5）Pelger-Huet畸形（Pelger-Huet anomaly）：

成熟中性粒细胞核分叶能力减退，核常呈杆状、肾形、眼镜形、哑铃形或少分叶，但染色质致密、深染，聚集成小块或条索状，其间有空白间隙。常见于常染色体隐性遗传性疾病、骨髓增生异常综合征和急性髓细胞白血病等。

（6）Chediak-Higashi畸 形（Chediak-Higashi anomaly）：

中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、单核细胞和淋巴细胞中均含几个至数十个直径为2～5μm的包涵体，呈异常巨大的紫蓝色或淡灰色块状物。常见于Chediak-Higashi综合征。

（7）May-Hegglin畸形（May-Hegglin anomaly）：

中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、单核细胞终身含无定形的淡蓝色包涵体，与Döhle小体类似而体积大且圆。为常染色体隐性遗传性良性畸形。

（8）Alder-Reilly畸形（Alder-Reilly anomaly）：

中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、单核细胞和淋巴细胞的胞质中含巨大深染嗜天青颗粒，呈深红色或紫色包涵体，但不伴有白细胞增多、核左移和空泡等。常为常染色体隐性遗传，常伴骨或软骨畸形。

3.异形淋巴细胞形态

（1）反应性淋巴细胞（reactive lymphocyte）：

原称为异型/不典型淋巴细胞（atypical lymphocyte），按形态特征分为

1）Ⅰ型（空泡型）：

又称为泡沫型或浆细胞型，细胞较正常淋巴细胞稍大，多为圆形，细胞核偏位，呈圆形、椭圆形、肾形或不规则形，染色质呈粗网状或不规则聚集粗糙块状，细胞质丰富，深蓝色，无颗粒，含有大小不等的空泡或呈泡沫状。

2）Ⅱ型（不规则形）：

又称为单核细胞型，细胞较Ⅰ型细胞明显增大，外形不规则，似单核细胞，细胞核呈圆形或不规则形，染色质较Ⅰ型细致、疏松，细胞质丰富，淡灰蓝色或蓝色，有透明质感，着色不均匀，边缘处蓝色较深，呈裙边样，可有少许嗜天青颗粒，一般无空泡。现认为，此型最多见。

3）Ⅲ型（幼稚型），

又称为未成熟型或幼淋巴细胞型，细胞较大，细胞核较大，呈圆形或椭圆形，染色质呈细致网状，可有1～2个核仁，细胞质量较多，呈深蓝色，多无颗粒，偶有小空泡。常见于传染性单核细胞增多症、过敏性疾病或结缔组织病等。

（2）卫星核（satellite nucleus）淋巴细胞：

淋巴细胞主核旁有1个游离的卫星小核。常见于接受大剂量电离辐射和核辐射后等。

（胡晓波　丛玉隆）