第四节　血小板检验技术

一、血小板计数

（一）血小板计数常规法

1.原理

血小板计数（platelet count，PLT）是测定全血中的血小板数量，与血液红（白）细胞计数相同。普通显微镜直接计数法根据使用稀释液的不同，血小板计数方法可分为破坏红细胞稀释法和不破坏红细胞稀释法。相差显微镜直接计数法是利用光线通过物体时产生的相位差转化为光强差、从而增强被检物体立体感，有助于识别血小板。

2.器材和试剂

（1）1%草酸铵稀释液：

分别用少量蒸馏水溶解草酸铵1.0g和EDTA·Na₂ 0.012g，合并后加蒸馏水至100ml，混匀，过滤后备用。

（2）器材：

显微镜、改良Neubauer计数板和盖玻片、微量吸管等。

3.操作

（1）取清洁小试管1支，加入血小板稀释液0.38ml。

（2）准确吸取毛细血管血20μl。擦去管外余血，置于血小板稀释液内，吸取上清液洗3次，立即充分混匀。待完全溶血后再次混匀1分钟。

（3）取上述均匀的血小板悬液1滴，充入计数池内，静置10～15分钟，使血小板下沉。

（4）用高倍镜计数中央大方格内四角和中央共5个中方格内血小板数。

（5）计算：

4.方法学评价

（1）干扰因素：

普通光学显微镜直接计数血小板的技术要点是从形态上区分血小板和小红细胞、真菌孢子及其他杂质。用相差显微镜计数经草酸铵稀释液稀释后的血小板，易于识别，还可照相后核对计数结果，因而国内外将本法作为血小板计数的参考方法。

（2）质量保证：

质量保证原则是避免血小板被激活、破坏，避免杂物污染。①检测前：采血是否顺利（采血时血流不畅可导致血小板破坏，使血小板计数假性减低）、选用的抗凝剂是否合适（肝素不能用于血小板计数标本抗凝；EDTA钾盐抗凝血标本取血后1小时内结果不稳定，1小时后趋向平稳）、储存时间是否适当（血小板标本应于室温保存，低温可激活血小板，储存时间过久可导致血小板计数偏低）。②检测中：定期检查稀释液质量。计数前先做稀释液空白计数，以确认稀释液是否存在细菌污染或其他杂质。③检测后：核准结果，常用方法：用同1份标本制备血涂片染色镜检观察血小板数量；用参考方法核对；同1份标本2次计数，误差小于10%，取2次均值报告，误差大于10%需做第3次计数，取2次相近结果的均值报告。

（二）血小板计数参考方法

血小板计数参考方法见于国际血液学标准委员会2001年文件（ICSH. Platelet Counting by the RBC/Platelet Ratio Method.Am J Clin Pathol，2001，115 ：460-464）。

1.血液标本

（1）用合乎要求的塑料注射器或真空采血系统采集健康人的静脉血标本。

（2）使用EDTA·K2抗凝剂，浓度为3.7～5.4μmol/ml血（1.5～2.2mg/ml血）。

（3）盛有标本的试管应有足够的剩余空间以便于血标本的混匀操作。标本中不能有肉眼可见的溶血或小凝块。

（4）标本置于18～22℃室温条件下，取血后4小时之内完成检测。

（5）为了保证RBC和PLT分布的均一性，在预稀释和加标记抗体前动作轻柔地将采血管反复颠倒，充分混匀标本。

2.试剂和器材

（1）器材：

为避免血小板黏附于贮存容器或稀释器皿上，在标本检测的整个过程中必须使用聚丙烯或聚苯乙烯容器，不得使用玻璃容器和器皿。

（2）稀释液：

用磷酸盐缓冲液（PBS）作为稀释液，浓度为0.01mol/L，pH 7.2～7.4，含 0.1% 的牛血清白蛋白（BSA）。

（3）染色液：

使用异硫氰酸荧光素标记的CD41和CD61抗体，这两种抗体可以与血小板膜糖蛋白Ⅱa/Ⅲb复合物结合，用于检测血小板。实验室应确认该批号抗体是否能得到足够的染上荧光的血小板，抗体应能得到足够高的血小板的荧光信号以便通过log FL1（528nm处的荧光强度）对log FS（前向散射光）的图形分析，将血小板从噪声、碎片和RBC中分辨出来。

3.仪器性能

（1）使用流式细胞仪，通过前向散射光和荧光强度来检测PLT和RBC。仪器在检测异硫氰酸荧光素标本的直径为2μm的球形颗粒时必须有足够的敏感度。

（2）用半自动、单通道、电阻抗原理的细胞计数仪检测RBC，仪器小孔管的直径为80～100μm，小孔的长度为直径的70%～100%，计数过程中吸入稀释标本体积的准确度在1%以内（溯源至国家或国际计量标准）。

4.检测方法

（1）用加样器加5μl充分混匀（至少轻柔颠倒标本管8次）的血标本于100μl已过滤的PBS-BSA稀释液中。

（2）加 5μl CD41抗体和 5μl CD61抗体染液，在室温 18～22℃、避光条件下放置15分钟。

（3）加4.85ml PBS-BSA稀释液制备呈1：1 000的稀释标本，轻轻颠倒混匀以保证PLT和RBC充分混匀。

（4）用流式细胞仪检测时，应至少检测5 000个信号，其中PLT应多于1 000，流式细胞仪的设定必须保证每秒计数少于3 000个信号。如果同时收集到RBC散射光的信号和血小板的荧光信号应被视为RBC-PLT重叠，计数结果将被分别计入RBC和PLT。直方图或散点图均可被采用，但推荐使用散点图。检测过程中推荐使用正向置换移液器。

（5）血小板计数值的确定：使用流式细胞仪确定RBC/PLT的比值。R=RBC/PLT，用RBC数除以R值得到PLT计数值。

（三）参考区间

（100～300）×109/L。

（四）临床意义

血小板数量随时间和生理状态的不同而变化，午后略高于早晨；春季较冬季低；平原居民较高原居民低；月经前减低，月经后增高；妊娠中晚期增高，分娩后减低；运动、饱餐后增高，休息后恢复。静脉血血小板计数比毛细血管高10%。

血小板减低是引起出血常见原因。当血小板在（20～50）×109/L时，可有轻度出血或手术后出血；低于20×109/L，可有较严重的出血；低于5×109/L时，可导致严重出血。血小板计数超过400×109/L为血小板增多。病理性血小板减少和增多的原因及意义见表2-12。

二、异常血小板形态检查

（一）方法学

1.原理

与识别异常红细胞形态相似。ICSH将血小板定性异常分为大血小板、巨大血小板、小血小板、少颗粒血小板等。

2.器材和试剂

显微镜，载玻片等。

3.操作

（1）低倍镜观察：

低倍镜下观察血涂片染色情况和血小板分布情况。选择细胞分布均匀、染色良好、红细胞紧密排列但不重叠区域（一般在血涂片的体尾交界处）。

（2）油镜观察：

滴加香柏油1滴，在油镜下仔细观察上述区域中血小板形态。

（3）记录描述：

观察记录标本中血小板形态，特别是异常血小板形态变化。

（二）参考区间

正常血小板呈两面微凸的圆盘状，直径为2～4μm，新生血小板体积大，成熟者体积小。在血涂片上往往成簇分布，其形态多数为圆形、椭圆形或略欠规则；胞质呈淡蓝或淡红色，中心部位有细小、分布均匀的紫红色颗粒。

血小板大小所占的比例不一致，巨型为0.7%～2.0%，大型为8%～16%，中型为44%～49%，小型为33%～44%。

（三）临床意义

1.大小异常血小板

可出现明显的大小不均变化，巨型血小板直径可以大于20μm，主要见于免疫性血小板减少性紫癜（immunologic thrombocytopenic purpura，ITP）、粒细胞白血病、血小板无力症（thrombocytasthenia）、巨大血小板综合征、MDS和脾切除后等。小的血小板直径小于2μm，主要见于缺铁性贫血、再生障碍性贫血等。

2.形态异常血小板

可以出现杆状、逗点状、蝌蚪状、蛇形和丝状突起血小板等不规则和畸形血小板，正常人偶见（少于2%）。影响血小板形状改变的因素很多，各种形态异常又无特异性，因此不规则和畸形的血小板比值超过10%时才有临床意义。

3.聚集、分布异常

血小板聚集、分布状态可间接反映其功能。聚集功能正常的血小板在非抗凝血外周血涂片中常可见聚集成簇或成团，聚集与散在血小板之比为20：1。

（1）血小板增多：

原发性血小板增多症（essential thrombocythemia，ET）和血小板增多的慢性粒细胞白血病，血小板可呈大片聚集。

（2）血小板减少：

再生障碍性贫血和原发性血小板减少性紫癜因血小板数量少，血小板聚集成团情况明显减少。

（3）血小板功能异常：

血小板无力症时血小板无聚集功能，且散在分布，不出现聚集成团的现象。另外，用EDTA抗凝血制作的血涂片，血小板不聚集呈散在分布状态。

（4）血小板卫星现象：

血小板围绕着中性粒细胞的现象，偶见于EDTA抗凝血，与患者血清内存在某种能与EDTA反应的因子有关。

（胡晓波　丛玉隆）