第二节　红细胞检验技术

一、血红蛋白测定

（一）氰化高铁血红蛋白法

1.原理

在氰化高铁血红蛋白（hemiglobincyanide，HiCN）转化液中，红细胞被溶血剂破坏，各种血红蛋白［硫化血红蛋白（SHb）除外］中亚铁离子（Fe2+）被高铁氰化钾氧化成高铁离子（Fe3+），形成高铁血红蛋白（Hi）。Hi与氰化钾（calcium cyanide，KCN）提供的氰根离子（CN-）结合，生成稳定的复合物HiCN，棕红色的HiCN在波长540nm处有吸收峰，用分光光度计测定该处的吸光度，再换算成每升血液中的血红蛋白浓度，或用HiCN参考液进行比色法测定制作标准曲线供查阅。

2.器材和试剂

（1）HiCN 试 剂：

氰化钾（KCN）0.050g，高铁氰化钾［K₃Fe（CN）₆］0.200g，无水磷酸二氢钾（KH₂PO₄）0.140g，Triton X-100 1.0ml，蒸馏水加至1 000ml，纠正pH 至7.0～7.4。

（2）标准HiCN参考液：

浓度200g/L。

（3）分光光度计：

带宽应小于1nm，比色杯光径1.000cm，允许误差为0.5%，测定温度为20～25℃。

（4）其他：

微量吸管和移液管等。

3.操作

（1）加转化液：

将5ml HiCN转化液加入试管内。

（2）混合液体：

取全血20μl加到试管底部，用上清液反复漱洗吸管3次，血液与转化液充分混匀，静置5分钟。

（3）测定混合液：

用符合世界卫生组织（WHO）标准的分光光度计在波长540nm处，光径为1.000cm时，以HiCN转化液或蒸馏水调零，测定标本的吸光度（A）。

（4）换算结果：

可选择以下任何一种方法。

1）使用计算公式：

式2-1中：A：540nm处测定的标本吸光度；64 458：血红蛋白平均分子量；44 000：血红蛋白毫摩尔吸光系数；251：稀释倍数。

2）查对标准曲线：

或者，将HiCN参考液倍比稀释为50g/L、100g/L、150g/L和200g/L四种血红蛋白浓度，在所用的分光光度计上540nm分别测定各稀释度的吸光度，然后以参考液Hb（g/L）为横坐标，吸光度测定值为纵坐标，在坐标纸上绘出标准曲线，通过标准曲线查出待测标本的血红蛋白浓度。

4.方法学评价

（1）干扰因素：

①HiCN转化液：是一种低离子强度而pH又近中性的溶液。引起测定值假性增高的原因有：转化液HiCN的稀释倍数不准确；红细胞溶解不当；血浆中脂质或蛋白量增加；白细胞计数 ＞ 20×109/L；血小板计数 ＞ 700×109/L。若因球蛋白异常增高引起的浑浊，可向转化液中加少许固体氯化钠（约0.25g）或碳酸钾（约0.1g），混匀后可使溶液澄清。②标准曲线：应定期检查并与所用的分光光度计相配。理论上，吸光度与血红蛋白浓度呈线性关系，故HiCN标准曲线应为坐标原点出发的一条直线。③加液量：必须准确。标准微量吸管必须经过水银称量法校正。④转化时间：一氧化碳血红蛋白（HbCO）转化为HiCN的速度缓慢，有时可长达数小时，如延长转化时间或加大试剂中K₃Fe（CN）₆的用量，可望得到满意结果。

（2）质量保证

1）分光光度计校正：

①波长：将100～150g/L的HiCN参考液放在待检分光光度计中，从500～600nm分几个波段测定HiCN的吸光度。如所测最大吸收峰在540nm，表示分光光度计波长准确，在实际工作中，对波长偏差不大的分光光度计，可把吸收峰波长当作540nm进行测定。②杂光：HiCN吸收光谱峰值在540nm，峰谷在504nm。杂光的增加使HiCN在吸收峰吸光度下降，而对峰谷处吸光度影像不大，设q值为反映杂光水平的参数，q=A_540nm/A_504nm，合格的分光光度计q值应为1.59～1.63，杂光可使HiCN吸收光谱的q值减低。③比色杯：用HiCN试剂作空白，波长710～800nm处，比色杯光径1.000cm时，吸光度应小于0.002。④灵敏度和线性：用HiCN参考液倍比稀释（应包括高、低浓度）后，在所用的分光光度计上相当540nm处分别测定各稀释度的吸光度，以参考液血红蛋白含量为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制曲线。观察各点连线是否为直线，如有个别点不在直线上，将直线外点的实测吸光度与直线上理论吸光度比较，如两者之差在5%以内，则可认为仪器符合线性的要求，直线的最低点即为该仪器HiCN法的灵敏度，最低与最高点间的范围即为仪器HiCN法的测定线性范围。

2）HiCN转化液质量：

应以蒸馏水配制，pH稳定在7.0～7.4。配好的试剂用滤纸过滤后为淡黄色透明溶液，用蒸馏水调零，比色杯光径1.000cm，波长540nm处的吸光度应小于0.001，试剂应贮存在棕色有塞玻璃瓶中，不能分装于多个试管中且长时间敞开管口又不避光，也不能贮存在塑料瓶中，因CN-会丢失，导致测定结果偏低，试剂置4℃冰箱内保存一般可用数月，如变绿、浑浊则不能使用，注意不能在0℃以下保存，因为结冰可引起高铁氰化钾还原，使转化液退色失效。

3）HiCN转化液安全性：

HiCN转化液中氰化钾是剧毒品，配制转化液时要按剧毒品管理程序操作。配制好的HiCN转化液中因氯化钾含量低，又有高铁氰化钾存在，毒性不是很大。若进入体内，高铁氰化钾氧化血红蛋白，生成高铁血红蛋白，后者结合CN-，起到一定的解毒作用，但仍应妥善保管。测定后的废液不能与酸性溶液混合，因为氰化钾遇酸可产生剧毒的氢氰酸气体，为防止氰化钾污染环境，比色测定后的废液集中于广口瓶中，按每升HiCN废液加次氯酸钠溶液40ml，充分混匀，敞开容器，置室温3小时以上。待CN-氧化成CO₂和N₂挥发后再排入下水道。

（二）十二烷基硫酸钠血红蛋白法

1.原理

十二烷基硫酸钠（sodium lauryl sulfate，SLS）作为一种阴离子表面活性剂，具有轻度氧化作用，血液中除SHb以外的所有血红蛋白均可与低浓度SLS作用，亚铁血红素被氧化成稳定的棕红色高铁血红素样复合物（SLS-Hb），通过绘制标准曲线，间接计算血红蛋白浓度。

2.器材和试剂

（1）60g/L十二烷基硫酸钠磷酸盐缓冲液：

称取60g十二烷基硫酸钠溶解于33.3mmol/L磷酸盐缓冲液（pH 7.2）中，加TritonX-100 70ml于溶液中混匀，再加磷酸盐缓冲液至1 000ml，混匀。

（2）SLS应用液：

用蒸馏水将原液稀释100倍。

（3）器材：

分光光度计。微量吸管、移液管等。

3.操作

（1）制备标准曲线：

取4份不同浓度抗凝血分别用HiCN法及本法测定每份血液的血红蛋白浓度和吸光度，然后以HiCN法测得的血红蛋白浓度为横坐标，SLS法测得的吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。

（2）测定标本：

取SLS应用液5ml置于试管中，加入全血20μl，充分混匀，5分钟后置540nm下以应用液调零，测定其吸光度，查标准曲线。

4.方法学评价

（1）干扰因素：

SLS液可破坏白细胞，因此对某些血液分析仪不宜使用。

（2）质量保证：

本法试剂不含氰化钾，反应产物也不污染环境，是较好替代方法。但因SLS-Hb的毫摩尔消光系数尚未确认，故不能根据标本吸光度直接计算结果，需用HiCN法及本法分别测定多份不同浓度抗凝血或溶血的血红蛋白浓度和吸光度，通过绘制标准曲线，结果溯源到HiCN值。

（三）血红蛋白测定参考方法

血红蛋白测定参考方法见于国际血液学标准委员会1996年发布的文件（ICSH. Recommendations for reference method for haemoglobinometry in human blood and specifications for international haemiglobincyanide reference preparation 4th edition.J Clin Pathol，1996，49 ：271-274）和我国卫生部临床检验标准专业委员会于2011年9月发布，2012年4月1日实施的卫生行业标准WS/T 341—2011《血红蛋白测定参考方法》。

1.血液标本

推荐采用静脉血和毛细血管血。静脉血使用EDTA盐或肝素盐抗凝，标本应充分颠倒混匀12次以上。脂血、高白细胞计数（＞ 20×109/L）和高血小板计数（＞ 700×109/L）引起的混浊会干扰HiCN法结果。

2.HiCN 试剂

应含有 K₃Fe（CN）₆ 200mg、KCN 50mg、KH₂PO₄ 140mg、非离子表面活性剂0.5～1.0ml，去离子水或蒸馏水加至1 000ml，呈透明淡黄色溶液，pH 7.0～7.4，渗透压6～7mOsm/kg，480nm以上的吸光度应为零。

3.HiCN试剂过滤

在540nm下因HiCN试剂吸光度每增加0.001会使Hb浓度假性增高0.370g/L，故HiCN试剂必须用直径25mm、低结合力、低释放、孔径0.20～0.25μm的滤膜过滤，过滤后HiCN试剂在750、540和504nm吸光度应为A750 值 ≤ 0.003，1.59 ≤ A540/A504 ≤ 1.63。

4.标本稀释倍数

推荐标本的稀释倍数在200～250倍之间，吸光度约为0.400。稀释方法为：①100μl充分混匀血液用25.0ml HiCN试剂稀释，采用A级容量瓶；②40μl充分混匀血液用10.0ml HiCN试剂稀释。稀释后充分混匀5次，静置3～5分钟使血红蛋白转化为HiCN。要求同一标本吸光度 CV ≤ 0.5%。

5.测定方法

采用经校准的分光光度计和匹配的1.000cm比色杯进行测定，在540nm处读取吸光度值，以HiCN试剂或水作空白对照。要求分光光度计光谱狭缝宽度 ≤ 6nm，使用汞、氢、氘发射光谱或氧化钬溶液校准分光光度计波长刻度，使用有证玻璃滤光片（如SRM930）校准分光光度计吸光度刻度，使用亚硝酸钠、碘化钾或特殊玻璃滤光片验证杂光。

6.计算Hb浓度

HiCN溶液符合Lambert-Beer定律可由计算Hb浓度，公式为：

式2-2中：：540nm处HiCN溶液吸光度；16 114.5：血红蛋白相对分子量；F：稀释因子；11.0：HiCN毫摩尔吸光系数的1/4；d：光径，通常为1.000cm；1 000：mg转换成g的因子。

（四）参考区间

男：131～172g/L；女：113～151g/L；新生儿：180～190g/L；婴儿：110～120g/L；儿童：120～140g/L；老年男性94～122g/L；老年女性87～112g/L。

（五）临床意义

1.生理性

增高见于新生儿、高原地区居住者。减低见于婴儿、老人和妊娠中晚期等。

2.病理性

增高见于真性红细胞增多症、代偿性红细胞增多症如先天性心脏病和慢性肺病等。减低见于各种贫血、白血病、产后、手术后和大量失血等。

二、红细胞计数

（一）红细胞计数-常规计数法

1.原理

采用等渗稀释液将血液标本稀释一定倍数，滴入血细胞计数室中，显微镜下计数一定区域内红细胞数，经换算得每升血液中红细胞计数（red blood cell count，RBC）数量。

2.器材和试剂

（1）红细胞稀释液：

枸橼酸钠1.0g，36%甲醛溶液1.0ml，氯化钠0.6g，加蒸馏水至100ml，混匀、过滤两次后备用。

（2）器材：

显微镜、改良Neubauer计数板和盖玻片、微量吸管等。

3.操作

（1）加稀释液：

取小试管1支，加入红细胞稀释液2.0ml。

（2）加标本血：

用清洁干燥微量吸管采集末梢血或抗凝血10μl，擦去管外余血，轻轻加至红细胞稀释液底部，再轻吸上层清液漱洗吸管2～3次，以洗净管腔内的残留血液，立即混匀。

（3）混匀混合液：

充分混匀后用干净微量吸管或玻璃棒将红细胞悬液充入计数池，室温下平放2～3分钟，待细胞下沉后于显微镜下计数。

（4）镜下计数：

用高倍镜依次计数中央大方格内四角和正中5个中方格内的红细胞。

（5）公式计算：

式2-3中：N：表示5个中方格内数得的红细胞数；×25/5：将5个中方格红细胞数换算成1个大方格红细胞数；×10：将1个大方格红细胞数换算成1.0μl血液内红细胞数；×201：血液的稀释倍数；×106：由1μl换算成1L。

4.方法学评价

（1）干扰因素：

①器材质量：均须清洁干燥。盖玻片、计数板、微量吸管应符合质量要求。②稀释液质量：应等渗、新鲜、无杂质。稀释液要过滤，以免杂质、微粒被误认为细胞。如无上述稀释液时，也可用新鲜配制的等渗盐水代替。③采血过程：不能过分挤压采血部位，针刺深部必须适当，采血应顺利、准确，采血部位不得有水肿、发绀、冻疮、炎症等，采血速度不应过慢，否则容易造成血内有凝块，导致细胞减少或计数分布不匀。如出现凝块，则应重新采血，并应充分混匀血液和抗凝剂，且在充池前再次混匀。④充液过程：将细胞悬液注入改良Neubauer计数板（improved Neubauer counting chamber）的过程称为充池。充池前应将细胞悬液充分混匀，但要防止因剧烈振荡而破坏红细胞，将细胞悬液充入计数池时要一次完成，不能产生满溢、气泡或充池不足的现象。⑤稀释倍数：红细胞数量明显增高时可适当加大稀释倍数，反之，则应适当减少稀释倍数，稀释倍数可通过改变稀释液加样量和/或血液加样量进行适度调节。

（2）质量保证：

①造成稀释倍数不准确的原因有：稀释液和/或血液加样量不准确；吸血时吸管内有气泡；未擦去吸管外余血；血液加入稀释液后，吸管带出部分稀释血液；稀释液放置时间过长，蒸发浓缩。②被检者采血姿势：应从直立位换成坐位15分钟后才采血。坐位采血较仰卧位15分钟后采血的红细胞计数值高5%～10%，剧烈运动后迅速采血可使红细胞计数增加约10%，静脉压迫时间超过2min会使红细胞计数平均增高10%。③计数原则：大小方格内压线细胞的计数遵循数上不数下、数左不数右的原则，避免多数或漏数。④细胞分布：红细胞在计数池中若分布不均，要重新充池计数。在参考值数值内，2次红细胞计数相差不得超过5%。⑤计数范围：血细胞在充入计数室呈随机分布或称Poisson分布（s为标准差，m为计数总数），造成分布误差或计数域误差。根据推断，欲将红细胞计数误差控制在CV（变异系数）5%以内，至少需要在计数室中计数400个红细胞，因此要求计数5个中方格得红细胞。⑥白细胞数量：经红细胞稀释液处理后，白细胞和红细胞同时存在，通常红细胞计数时已包含白细胞。在一般情况下，外周血中白细胞仅为红细胞的1/1 000～1/500，白细胞数量在正常范围时，对红细胞的影响可忽略不计，但如白细胞过高，则应对计数结果进行校正：实际RBC=所得RBC-WBC，如红细胞为3.5×1012/L，白细胞为100×109/L时，患者实际红细胞数应为3.4×1012/L；在高倍镜下计数时，不计数白细胞。白细胞体积比正常红细胞大，中央无凹陷，无草黄色折光，可隐约见到细胞核，但在外周血中出现有核红细胞时，则难以区别。⑦计数板质量：改良Neubauer计数板在启用前后每隔1年都要鉴定1次，以防不合格或磨损而影响计数结果的准确性，鉴定内容包括两项。一项是盖玻片检查，包括厚度和平整度，厚度检查使用千分尺对盖玻片的厚度进行多点测定，最少测9个区，每区测2点，要求区域间厚度差小于2μm，平整度检查使用平面平晶仪检测盖玻片两表面的干涉条纹，其条纹细密均匀或微量弯曲即为符合要求；另一项是计数池深度，将微米级千分尺尾部垂直架在计数板两堤上，移动尾部微米级千分尺，多点测量计数池的高度误差应在±2%以内。

（二）红细胞计数-参考方法

红细胞计数测定参考方法见于国际血液学标准委员会1994年发布的文件（ICSH. Reference method for the enumeration of erythrocytes and leucocytes.Clin Lab Haematol，1994，16 ：131-138）。

1.一般技术要求

（1）血标本要求：

①用符合要求的塑料注射器或真空采血系统采集新鲜静脉血标本，标本中不得有肉眼可见的溶血或小凝块；②标本的收集要求使用EDTA·K2作为抗凝剂，抗凝剂的浓度为3.7～5.4μmol/ml血，盛有标本的试管应有足够的剩余空间以便于血标本的混匀操作；③标本应置于18～22℃的温度条件下直至检测；④标本采集到标本检测的时间间隔应不超过4小时；⑤检测前应轻轻地颠倒盛有标本的试管，以便将标本充分混匀。

（2）加样器要求：

使用经过校准的移液器，不准确度应 ≤ ±0.5%，其不准确度应溯源至一级计量标准。

（3）容量瓶要求：

使用硅硼酸玻璃制成的一级容量瓶。每个容量瓶应有经国家标准计量机构检定的标示体积，其不准确度为±1%。

（4）计数杯要求：

①计数杯的体积应有10ml；②计数杯应有足够的高度以保证在计数前电子细胞计数仪小孔管的小孔约在液体高度一半的位置，完成计数后在小孔上方至少有1cm的液体高度；③使用前要保持计数杯的清洁，无化学污染物和颗粒物；④须确认是否因细胞黏附于计数杯上而导致计数值的持续下降。从每批计数杯中抽查检测。在计数杯内加入稀释标本，放置不同的时间进行检测，以确认计数杯是否合格，计数前样品杯内的稀释液必须充分混匀。

（5）仪器性能要求：

①电子细胞计数仪的设计要达到每个细胞只能计数一次的要求。细胞通过计数敏感区时颗粒回流的可能性要很小，由此产生的脉冲应低于相应的低阈值；②电子仪器装置应有能力通过脉冲高度来区分检测的细胞、其他细胞和电噪声，且能保证检测误差足够小；③仪器小孔的直径为80～100μm，小孔长度为直径的70%～100%；④计数过程中吸入的标本体积的准确度要求在1%以内，准确度应溯源至国家或国际计量标准；⑤通过水银柱或其他适当物质的移动吸入标本，吸入标本的体积受温度影响的程度应小于0.1%/℃；⑥为了避免人为因素的影响，设定阈值时要求保证信噪比在100：1以上。

（6）试剂要求：

①稀释液：应为无菌、无毒，适用于检测系统的缓冲盐溶液，要求标示稀释液的渗透压的大小在（280±15）mOsm范围内，在设定的阈值条件下稀释液的空白计数应小于1×105个/L；②溶血剂：在全血标本中计数白细胞时，红细胞须首先被溶解。溶血剂的作用不能影响白细胞计数，同时红细胞的碎片应被减至不被当作白细胞计入；③冲洗液：由稀释液经真空脱气或加热至90℃以去除气体。

2.计数方法

（1）冲洗：

计数前用冲洗液冲洗仪器。

（2）重叠计数校正的稀释要求：

计数的每一份标本都要进行重叠校正。进行重叠校正的标本稀释方法和检测次数：制备2份稀释原液（每份0.1ml血加20ml稀释液）。取0.02、0.04、0.06和0.08ml稀释原液分别加入20ml稀释液中以制备两套4个浓度的刺激稀释标本，浓度最高的次级稀释标本为（0.08ml+20ml），稀释倍数为1/50 451。每份次级稀释标本的计数次数分别为 12、6、4、3 次。

（3）混匀静置要求：

将稀释标本移入计数杯，轻轻混匀约30秒，混匀过程中不能有气泡。计数应在稀释后5min分钟内完成。

（4）计数过程：

标本通过小孔的时间可依照制造商的推荐而定，按规定检测次数，对每份次级稀释标本进行重复检测。

（5）阈值验证：

将低计数阈值设在血小板和红细胞脉冲信号之间波谷的位置。

（6）重叠计数校准方法：

使用回归分析方法来检查回归的线性，分析的数据点由检测两套4个浓度的次级稀释标本得出，Y轴代表每个水平的次级稀释标本的累积计数值，X轴上的刻度将最高浓度次级稀释标本的浓度定为1.0。如果变异的分析未显示非线性，那么回归直线的交叉点代表重叠校准的计数值。计数值为吸入小孔管的次级稀释最高浓度标本的红细胞计数值，因重复测定了3次，故用该计数值除以3，结果代表每毫升通过小孔的次级稀释标本内含的细胞数，最后，用计数值乘以50 451得RBC的计数值。

（7）误差分析：

红细胞计数的最大允许偏倚为2.0%。

（三）参考区间

男：（4.09～5.74）×1012/L；

女：（3.68～5.13）×1012/L；

新生儿：（5.2～6.4）×1012/L；

婴儿：（4.0～4.3）×1012/L；

儿童：（4.0～4.5）×1012/L。

（四）临床意义

红细胞增加或减少的临床意义与血红蛋白测定相似。但在各种贫血中，红细胞内血红蛋白含量不同，红细胞和血红蛋白减少程度可不一致。

三、血细胞比容测定

（一）毛细管法

1.原理

将定量的抗凝血液在一定的速度和时间离心沉淀后，血液中的各种不同成分互相分离，计算压实红细胞占全血的比值，即毛细管法（microhematocrit method）的血细胞比容（hematocrit，HCT）。

2.器材和试剂

（1）毛细管：

用钠玻璃制成专用玻管，长度为（75±0.5）mm；内径为（l.155±0.085）mm；管壁厚度为0.20mm，允许范围为0.18～0.23mm。

（2）密封胶：

应使用黏土样密封胶或符合要求的商品，用于密封毛细管。

（3）高速离心机：

专用离心机。离心半径应大于8.0cm，能在30秒内加速到最大转速，在转动圆周边的相对离心力（RCF）为10 000～15 000g时，转动5分钟，转盘的温度不超过45℃。

（4）读数尺：

特制读数换算尺。

3.操作

（1）吸取标本：

用虹吸法将血液充入专用毛细管中，至2/3（50mm）处，避免气泡产生。

（2）密封毛细管：

把毛细管未吸血的一端垂直插入密封胶，封口。密封胶柱应为4～6cm。

（3）离心：

把毛细管（封口端向外）放入专用高速离心机，以RCF 12 500g离心5分钟。

（4）读数：

取出离心后的毛细管置于专用读数板的凹槽中，移动滑尺刻度至还原红细胞层表层，读出相对应的数值。或用刻度尺分别测量红细胞层和全血层长度，计算其比值。

4.方法学评价

（1）干扰因素：

①器材：所用器具清洁干燥，防止溶血。②抗凝剂：量要准确，并与血液充分，特别是防止血液稀释、凝固。③密封操作：为防破坏红细胞，毛细管的密封不能采用烧熔的方法。④离心：离心速度直接影响结果，相对离心力以10 000～15 000g为宜，当读数为 ＞ 0.50时，应再离心5分钟，放置毛细管的沟槽平坦，胶垫富有弹性，防止离心时血液漏出；一旦发生漏血，应清洁离心盘后重新测定。⑤红细胞因素：结果假性增高：红细胞形态异常（如小红细胞、大红细胞、球形红细胞、椭圆形红细胞或镰形红细胞等）和红细胞增多时应注明，因红细胞的变形性减低和数量增多可使血浆残留量增加，高网织红细胞或高白细胞等也可使HCT假性增高。结果假性降低：体外溶血和自身凝集等。

（2）质量保证：

①读数方法：离心后血液分为5层，自上而下分别为血浆层、血小板层、白细胞层和有核红细胞层、还原红细胞层（紫黑红色）、氧合红细胞层（鲜红色）。读数以还原红细胞层表面为准。②红细胞因素：红细胞异常时因变形性减低使血浆残留量增加，结果假性增高，而体外溶血和自身凝集会使结果假性降低。③离心效果：因本法用高速离心，红细胞间残存的血浆量较少，因而结果较温氏法低。④重复性：同一标本的两次测量结果之差不可大于0.015。

（二）温氏法

1.原理

温氏法（Wintrobe method）血细胞比容测定原理同毛细管法，但使用常规中速离心。

2.器材和试剂

（1）温氏管：平底厚壁玻璃管，长110mm，内径3mm（内径不均匀性误差 ＜ 0.05mm），管上刻有0～100mm刻度，分度值为1mm，其读数一侧由下而上，供测血细胞比容用，另一侧由上而下，供红细胞沉降率测定用。

（2）细长毛细滴管。

（3）水平式离心机：RCF在2 264g以上。

3.操作

（1）吸取标本：

用细长毛细滴管吸取混匀的抗凝血，插入温氏管底部，然后将血液缓慢注入至刻度“10”处，并用小橡皮塞塞紧管口。

（2）离心：

将加好标本的温氏管置于离心机，以相对离心力RCF为2 264g离心30分钟，读取压实红细胞层柱高的毫米数，再以同样速度离心10分钟，至红细胞层高度不再下降为止。

（3）读数：

以还原红细胞层表面为准，读取红细胞层柱高的毫米数，乘以0.01，即为血细胞比容值。

4.方法学评价

（1）干扰因素：

①抗凝剂因素：将3.5mg的EDTA·K₂或0.2mg的肝素装于小试管内烘干，可抗凝2ml血液，应严格控制加入量，抗凝剂用量过大可使红细胞皱缩。②标本因素：以空腹采血为好，采血应顺利。因静脉压迫时间过长（超过2分钟）会引起血液淤积与浓缩，所以当针刺入血管后应立即除去止血带再抽血，以防HCT增加。上层血浆如有黄疸及溶血现象应予注明，供临床医师参考。③吸取标本因素：抗凝血在注入温氏管前应反复轻微振荡，使Hb与氧充分接触，注入温氏管时要避免产生气泡。

（2）质量保证：

要确保离心条件的规范。因红细胞的压缩程度受相对离心力大小和离心时间的影响较大，故要求RCF为2 264g，离心30分钟，相对离心力（g）=1.118×10-5×有效离心半径（cm）×每分钟转速2。如有效离心半径不足或转速不足均可使相对离心力降低，必须适当延长离心时间或提高离心速度加以纠正。本法离心力不足以完全排除红细胞之间残留血浆（残留2%～3%），且用血量大，已逐步被毛细管微量法取代。

（三）血细胞比容测定参考方法

血细胞比容测定参考方法见于国际血液学标准委员会2001年发布的文件（ICSH. Recommendation for the reference method for the packed cell volume.Lab Hematol，2001，7 ：148-170）。

1.一般技术要求

（1）血液标本：

静脉血使用EDTA·K₂抗凝，容器体积应足够大，使空气体积占试管体积20%以上，当颠倒混匀8～10次后血液能充分混合，并全部氧合。毛细血管血应使用特制的、内部涂抗凝剂（常为肝素铵）的微量血细胞比容管，采自手指、耳朵或足跟的穿刺部位，约需50μl血液。

（2）一次性玻璃毛细管性能：

Ⅱ型碱石灰玻璃，长度（75±0.5）mm，内径（1.155±0.085）mm，管壁厚度 0.18～0.23mm，粗细变化不超过内径与毛细管长度之比的2%。

（3）封胶：

特制的、柔软的、用于吸样后封闭毛细管一端。

（4）微量血细胞比容离心机性能：

半径 ＞ 8cm；相对离心力应10 000～15 000g，启动30秒内达最高转速，至少应保持5分钟无明显发热；转子温度不超过45℃；离心机有多个试管位置（如24个），样品轨道位置应有编号；有自动计时器。在使用前和每年应定期核查，用转速计核查离心速度，准确度应为±1转/min（rpm），用秒表核查计时器的准确度和精密度。

（5）比容时间：

选择1份正常和1份红细胞增多的血液标本，充分混匀，分别充满两根毛细管，离心2分钟，测量并记录结果。然后，再用充满新鲜血的毛细管，重复此过程，以30秒为增量，增加离心时间，直到HCT值稳定。如果4分钟后HCT值稳定，4.5分钟时不再改变，那么4.5分钟即为合适的离心时间。

（6）血细胞比容读数板：

应采用专用血细胞比容读数板，最好用防视差的游标，应定期用与血细胞比容管长度一致的、印有连续刻度的血细胞比容卡读数器对照核查。

2.操作方法

（1）混合：

充分混合血液标本，通常用手颠倒混匀8～10次或用机械混匀器混合2～3分钟。若4℃保存样品，使用前应先平衡至室温。

（2）吸样：

不超过毛细管总长度的2/3～3/4，待末端干燥，在未吸样端塞入特制封胶。良好的封口应使管内底部平整。

（3）离心：

毛细管吸样后放入离心机，记录每根管子位置，按预设时间（通常5分钟）以10 000～15 000g离心。

（4）读数：

由红细胞柱长度与全血柱总长度直接由血细胞比容读数器得出，应尽可能排除血小板和白细胞层所形成的棕黄层。

（5）判断结果：

两次测定结果相差不超过0.005l/L。

（四）参考区间

男：0.380～0.508；女：0.335～0.450。

（五）临床意义

临床意义与红细胞计数相似。增高可因红细胞数量绝对增加或血浆量减少所致。减低是诊断贫血的指标。

四、红细胞参数平均值测定

（一）方法学

1.原理

根据红细胞、血红蛋白浓度和血细胞比容结果，计算红细胞平均体积、红细胞平均血红蛋白量和红细胞平均血红蛋白浓度。

2.计算

（1）红细胞平均体积（mean corpuscular volume, MCV）：

是指全部红细胞体积的平均值。

举例：患者血红细胞数为3.6×1012/L，血细胞比容为0.392。因为 1L=1015fl，即：

（2）红细胞平均血红蛋白量（mean corpuscular hemoglobin, MCH）：

是指全部红细胞血红蛋白含量的平均值。

举例：患者红细胞数为3.6×1012/L，血红蛋白量为136g/L。因为1g=1012pg，即：

（3）红细胞平均血红蛋白浓度（mean corpuscular hemoglobin concentration, MCHC）：

是指全部红细胞血红蛋白浓度的平均值。

举例：患者血红蛋白量为136g/L，血细胞比容为0.392。即：

3.方法学评价

（1）红细胞平均指数测定由红细胞计数、血红蛋白量及血细胞比容测定后计算，因此，必须用同一份凝血标本，且所测数据必须准确。

（2）红细胞平均指数仅反映红细胞群体平均情况，无法阐明红细胞彼此之间的差异，对一些早期贫血也缺乏敏感性。

（二）参考区间

见表2-4。

（三）临床意义

红细胞平均指数可用于贫血形态学分类及提示贫血的可能原因（表2-5）。

五、异常红细胞形态检查

（一）方法学

1.原理

对血涂片进行染色后，不同形态的细胞，因化学成分和化学性质不同，对酸性和碱性染料的亲和作用、吸附作用就不一样，因而使不同形态的细胞呈现出各自的染色特点。利用光学显微镜可直接观察到正常红细胞的形态，并识别异常红细胞形态（erythrocyte morphology）。

2.器材和试剂

显微镜，载玻片。

3.操作

（1）低倍镜观察：

低倍镜下观察染色血涂片中红细胞的分布和染色情况。选择细胞分布均匀、染色良好、红细胞紧密排列但不重叠区域（一般在血涂片的体尾交界处）。

（2）油镜观察：

滴加香柏油1滴，在油镜下仔细观察上述区域中红细胞的形态，同时浏览全片是否存在其他异常细胞。

（3）记录描述：

观察记录标本中红细胞形态特别是异常红细胞的形态变化和/或数量。

4.方法学评价

（1）干扰因素：

在制片和染色过程中的人为因素会造成红细胞形态异常，如①涂片不当；②玻片不符合要求；③抗凝剂EDTA浓度太高，或血液长时间放置；④染色不当；⑤涂片干燥过慢或固定液中混有少许水分；⑥涂片末端附近，可见与长轴方向一致的假椭圆形红细胞等。

（2）质量保证：

①红细胞分布：在整张血涂片上通常不是均匀分布的，应先在低倍镜下估计细胞的分布和染色情况，理想的红细胞形态检查应在红细胞单个分散、毗邻而不重叠的区域。②浏览全片细胞：是否存在其他异常细胞，因异常成分常集中在涂片的边缘，容易漏检。一般真的异形红细胞全片都可见到同样异常，而假异形红细胞常局限于个别区域。③检验人员资质：有合格的血液细胞形态检验人员，经严格培训有理论与实践经验的血细胞检验人员是细胞形态学检查质量保证的前提。

（二）临床意义

红细胞形态定义的见于2015年Palmer等的最新权威性分类描述（ICSH. Recommendations for the standardization of nomenclature and grading of peripheral blood cell morphological features.Int Jnl Lab Med，2015，37 ：287-303）。

正常静态红细胞呈双面凹的圆盘形，其形态和大小的差异对贫血的鉴别有很大的价值。正常成人红细胞直径为7.5～8.7μm，随细胞衰老轻微变小，正常红细胞瑞特染色下呈红棕色，吉姆萨染色下呈粉红色，中心1/3染色相对灰白，表现出双面凹形态，是红细胞不受外界变形性应力支配时呈现出的形态，称（圆）盘形红细胞（discocyte）。在多种外界因素影响下，盘形红细胞可快速地转变为口形和棘形锯齿形红细胞两种形态。

1.红细胞形态异常

（1）棘形红细胞（acanthocyte）：

原称为刺细胞（spur cell）。红细胞呈圆形，高色素，表面有2～20个长度、厚度和形状不同的不规则凸起或针状凸起，针状凸起呈棒状，而尖状少见。常见于肝病、维生素E缺乏、脾切除后、无β脂蛋白血症和McLeod红细胞表型。

（2）咬红细胞（bite cell）：

因脾清除海因小体（Heinz body）或某些氧化剂性溶血，引起红细胞边缘出现单个或多个弓形缺陷。微血管病性溶血性贫血和机械损伤红细胞可产生典型特征红细胞（角形红细胞，keratocytes），红细胞边缘有假的空泡和红细胞膜融合情况。常见于G6PD缺乏症。

（3）疱状红细胞（blister cell）：

是红细胞内血红蛋白退缩到红细胞一半区域，形成致密团块，而其余部分是空的细胞膜。常见于氧化剂性溶血和G6PD缺乏症。

（4）椭圆形红细胞（elliptocyte）和卵圆形红细胞（ovalocyte）：

椭圆形红细胞呈椭圆形，长轴是短轴的2倍；而卵圆形红细胞呈卵圆形，长轴小于短轴的2倍。常见于遗传性椭圆形红细胞增多症和铁缺乏。

（5）刺红细胞（echinocyte）：

原称为锯齿形红细胞（burr cell）。红细胞不呈圆盘状，表面有10～30根短的、钝状凸起，针状凸起或相对规则形态。常见于肝病、肾病、丙酮酸激酶缺乏症和标本放置过久。

（6）不规则固缩红细胞（irregularly contracted cells）：

不规则固缩红细胞是更小、更致密、缺乏中央淡染区的红细胞，但形态又不像球形红细胞那样规则。常见于G6PD缺乏症和血红蛋白病。

（7）异形红细胞（poikilocyte）：

是红细胞形态异常，是非特异性异常，其特殊形态常伴特殊疾病，如椭圆形红细胞。常见于遗传性椭圆形红细胞增多症。

（8）裂红细胞（schizocyte）：

是红细胞碎片，较完整红细胞小，碎片常呈带锐角的、边界整齐的、小型新月形、盔形或角形红细胞。也可见微小球形红细胞。常见于微血管病性溶血性贫血、血栓性血小板减少性紫癜、溶血尿毒症综合征、弥散性血管内凝血和肾病。

（9）镰形红细胞（sickle cell）：

因含聚合的血红蛋白 S（HbS），使红细胞呈新月形或镰刀形，末端尖锐。常见于镰形细胞贫血和其他镰形细胞病。

（10）球形红细胞（spherocyte）：

直径小（＜ 6.5μm），呈致密球形，中央淡染区消失，MCV正常或减低，与细胞骨架和膜异常有关。常见于遗传性球形红细胞增多症、ABO和温抗体性自身免疫性溶血性贫血、产气荚膜梭菌败血症和烧伤。

（11）口形红细胞（stomatocyte）：

呈单凹的杯状红细胞，在染色血涂片上中央淡染区呈裂隙样。东南亚卵圆形红细胞增多症的每个口形红细胞可有两个口，呈长形、横断形、V形或Y形。常见于遗传性口形红细胞增多症和酒精性肝硬化。

（12）靶形红细胞（target cell）：

是薄形红细胞，表面积和体积比增加，中央淡染区内有深染区域。常见于肝病、血红蛋白病和地中海贫血。

（13）泪滴形红细胞（teardrop cells）：

红细胞呈梨形或泪滴形。常见于骨髓纤维化。

2.红细胞包涵体

（1）嗜碱性点彩颗粒（basophilic stippling）：

因异常聚集的核糖体呈细小、中等或粗大的颗粒状、均匀分布于整个红细胞。常见于铅中毒、血红蛋白病、地中海贫血和异常血红素合成。

（2）Howell-Jolly小体（Howell-Jolly bodies, H-J）：

是碎裂的核物质，常为单个、小的（1μm）、致密圆形嗜碱性包涵体。常见于脾功能减退、脾切除后、溶血性贫血和巨幼细胞贫血。

（3）红细胞内血红蛋白结晶（intracellular hemoglobin crystals）：

血红蛋白呈结晶样聚集，染色深，大小各异，边缘锐利。常见于HbC和HbSC病。

（4）Pappenheimer小体（Pappenheimer bodies）：

红细胞内有铁蛋白聚集，外周血涂片罗氏染色（Romanowsky stain）可见红细胞内含多个嗜碱性，大小、形态和分布各异的包涵体，常位于胞质某个区域。铁染色阳性。常见于铁粒幼细胞贫血、血红蛋白病和脾功能减退。

（5）红细胞内微生物（micro-organisms in RBC）：

细菌、真菌或寄生虫感染者，在红细胞内或红细胞间可见微生物。

（6）有核红细胞（nucleated red blood cell）：

是红细胞前体，外周血液循环中称为有核红细胞。

3.血涂片上红细胞分布不规则

（1）红细胞凝集（agglutination）：

红细胞不规则聚集成葡萄串样。常提示出现冷反应抗红细胞抗体。此时血细胞分析仪的MCV假性增高，RBC假性减低，导致MCH和MCHC假性增高。

（2）红细胞缗钱状形成（rouleaux formation）：

红细胞层叠呈钱串样。提示血浆蛋白质浓度增高。

4.红细胞大小和/或颜色异常

（1）红细胞大小不一（anisocytosis）：

红细胞大小变化较大，为非特异性变化。血细胞分析仪红细胞分布宽度（RDW）增加。

（2）红细胞双相形态（dimorphism）：

血细胞分析仪红细胞直方图上显示两群红细胞，伴RDW增高提示为红细胞双相形态。常为一群小细胞低色素细胞和另一群正常或大细胞正色素细胞。

（3）低色素红细胞（hypochromia）：

红细胞染色较淡，中央淡染区扩大，超过红细胞直径1/3。低色素者MCH减低，重度者MCHC减低。常伴小细胞增多。低色素红细胞较薄，血红蛋白浓度和量正常。常见于缺铁性贫血和地中海贫血。

（4）大红细胞（macrocyte）：

红细胞增大，直径大于 8.5μm（MCV ＞ 100fl）。MCV增高，但MCH正常或增高。红细胞呈圆形或卵圆形。应注意新生儿和婴儿可见较成人红细胞大的幼稚红细胞。常见于B₁₂/叶酸缺乏症、肝病和骨髓增生异常综合征（MDS）。

（5）小红细胞（microcyte）：

红细胞小，直径小于 7μm（MCV ＜ 80fl），常伴血红蛋白量减少。因表面积和体积比增加，可见中等量靶形红细胞，MCV假性减低。常见于缺铁性贫血和地中海贫血。

（6）多色素红细胞（polychromasia）：

为幼稚红细胞，因残留核糖体RNA而呈粉红蓝灰色，较成熟红细胞体积大。常见于溶血性贫血和补血药治疗。

六、网织红细胞计数

（一）试管法

1.原理

网织红细胞（reticulocyte，Ret）胞质内残存少量核蛋白体和核糖核酸（RNA）等嗜碱性物质，经煌焦油蓝或新亚甲蓝等染液活体染色后呈蓝色网织状或点粒状，可与完全成熟的红细胞区别。

2.器材和试剂

（1）10g/L煌焦油蓝生理盐水溶液：

煌焦油蓝1.0g，柠檬酸三钠0.4g，氯化钠0.85g，溶于双蒸水100ml中，混匀，过滤后贮存于棕色试剂瓶中备用。

（2）新亚甲蓝溶液：

新亚甲蓝0.5g，草酸钾1.4g，氯化钠0.8g，蒸馏水加至100ml，过滤后贮存于棕色试剂瓶中备用。

（3）器材：

显微镜、载玻片等。

3.操作

（1）加染液：

于小试管中加入染液2滴。

（2）加标本：

再加入新鲜全血2滴，立即混匀，室温下放置15～20分钟。

（3）制涂片：

取混匀染色血1小滴制成薄血涂片，自然干燥。

（4）低倍镜观察：

选择红细胞分布染色良好、分布均匀的部位。

（5）油镜观察：

在所选血片部位计数至少1 000个红细胞中的网织红细胞。

（6）计算结果：

网织红细胞绝对数（个/L）=网织红细胞百分数×红细胞数/L

（7）ICSH网织红细胞分型：

共4型。①Ⅰ型（丝球形）：红细胞几乎被网织物充满；②Ⅱ型（网型）：红细胞中央呈线团样结构松散；③Ⅲ型（破网型）：红细胞内网状结构稀少，呈不规则枝点状排列；④Ⅳ型（点粒型）：红细胞内嗜碱性物质少，呈分散的细颗粒、短丝状。

4.方法学评价

（1）干扰因素：

①细胞分布因素：选择红细胞分布均匀、网织红细胞着色好的部位计数，凡含2个以上网织颗粒的细胞均应计为网织红细胞。因网织红细胞体积较大，故应兼顾血片边缘和尾部。②易于混淆的形态：网织红细胞为蓝绿色网织状或点粒状结构，分布不均。HbH包涵体为蓝绿色圆形小体，均匀散在于整个红细胞内，一般在室温10～60分钟后出现。

（2）质量保证：

①染液质量：直接影响网织红细胞计数的准确性。煌焦油蓝染液长期普遍应用，但溶解度低，易形成沉渣吸附于红细胞表面；新亚甲蓝对Ret染色力强且稳定，是WHO推荐使用的染液。试剂应定期配制，以免变质沉淀。瑞特染液复染可使网织红细胞数值偏低。②染色时间：不能过短，室温低时，可放置37℃温箱或适当延长染色时间。染液与血液的比例以1：1为宜。③及时检测：因网织红细胞在体外仍继续成熟，其数量随着保存时间的延长而递减，所以标本采集后应及时处理、染色和测定，因染料吸附可人为地增高网织红细胞计数值。

（二）Miller窥盘法

1.原理

为了提高网织红细胞计数的精度和速度，ICSH推荐使用Miller窥盘（Miller disc）。将Miller窥盘放置于接目镜内，于Miller窥盘的小格内计数所有成熟红细胞，在大格内（含小格）计数网织红细胞。

2.器材和试剂

（1）Miller窥盘（图2-1）：

圆形玻片，厚 1mm，直径19mm。玻片上刻有大方格B和小方格A，面积比为9：1。

（2）其他：

同试管法。

3.操作

（1）操作基本步骤：

同试管法。

（2）置放Miller窥盘：

计数前，将Miller窥盘置于接目镜内。

（3）油镜计数：

计数小方格内成熟红细胞数，大方格内网织红细胞数。为达到规定精度水平，建议根据网织红细胞的数量决定所应计数的红细胞数量（表2-6）。

（4）计算：

4.方法学评价

（1）方法性能：

规范了计算区域，减少了试验误差，是ICSH推荐方法。

（2）质量保证：

网织红细胞生成指数：若贫血时骨髓生成红细胞增多，大量尚未成熟红细胞释放入血，仅用网织红细胞百分数或绝对数表达不能确切表达贫血情况，为此，提出在贫血时用网织红细胞生成指数（reticulocyte production index，RPI）报告，代表网织红细胞生成相当于正常人多少倍。若RPl ＞ 3，提示溶血性贫血或急性失血性贫血；RPI ＜ 1时，提示骨髓增生低下或红细胞系成熟障碍所致贫血。

式2-9中网织红细胞成熟天数与血细胞比容相关。正常人血细胞比容通常成人取0.45。患者血细胞比容：HCT为0.39～0.45，成熟天数为1天；HCT为0.34～0.38，成熟天数为1.5天；HCT为0.24～0.33，成熟天数为2.0天；HCT为0.15～0.23，成熟天数为2.5天；HCT为小于0.15，成熟天数为3.0天。

（三）网织红细胞计数测定参考方法

网织红细胞计数测定参考方法见于国际血液学标准委员会1992年发布的文件（ICSH.Guidelines for reticulocyte counting by microscopy on supravitally stained preparations WHO/LBS/92.3 Geneva：World Health Organization.1992）。

1.血液标本

（1.5～2.2）mg/ml的 EDTA·K₂抗凝全血标本。

2.染液

新亚甲蓝1.0g溶解于100ml等渗pH 7.4的磷酸盐缓冲液中，过滤后贮存在2～6℃黑暗环境中，可稳定1个月。

3.染色方法

（1）加染液：

在试管内加入100μl血液和100μl染液。

（2）染色：

室温染色3～5分钟。

（3）制片：

取细胞悬液制作涂片。

（4）镜检：

待干后镜检。

4.计数方法

（1）低倍镜观察：要求涂片上细胞分布均匀。

（2）油镜分类计数：每个视野红细胞内网织红细胞数量，按“城垛式”移动涂片，计数量应根据所需达到的精度而定（表2-7）。

（3）应由两位检验人员在视频成像系统或双头显微镜上同时计数，以获得最佳结果。

5.结果报告

采用下列公式计算网织红细胞百分率，通过乘以参考方法得到的红细胞计数值，可求得网织红细胞绝对值。

（四）参考区间

1.网织红细胞百分数

成人：0.005～0.025；新生儿：0.02～0.06。

2.网织红细胞绝对数

成人和儿童：（24～84）×109/L。

（五）临床意义

1.增加

表示骨髓造血功能旺盛，各种增生性贫血均可增多，溶血性贫血增加尤为显著。

2.减少

常见于再生障碍性贫血。

七、红细胞沉降率测定

（一）魏氏（Westergren）法

1.原理

将枸橼酸钠抗凝血置于特制刻度血沉管内，垂直立于室温1小时后，读取上层血浆的高度，即为红细胞沉降率。血沉测定实际上是测量单位时间内红细胞下沉后残留血浆段的高度或长度，而并非真正的红细胞下降速度，因此，IFCC和国际纯粹和应用化学联盟（International Union of Pure and Applied Chemistry，IUPAC）对ESR的重新定义为血液沉降的长度（length of sedimentation reaction in blood，LSRB）。

2.器材和试剂

（1）血沉管：ICSH规定，血沉管为全长（300±1.5）mm，两端相通，一端有规范的200mm刻度魏氏管（玻璃或塑料制品），管内径2.55mm，管内均匀误差小于5%，横轴与竖轴差小于 0.1mm，外径（5.5±0.5）mm，管壁刻度200mm，误差±0.35mm，最小分度值1mm，误差小于0.2mm。

（2）血沉架：应放置平稳，不摇动，不振动，避免直射阳光，血沉管直立 90°±1°，不漏血。

（3）1×109mmol/L枸橼酸钠溶液。

3.操作

（1）取静脉血1.6ml，加入含1×109mmo/L枸橼酸钠溶液0.4ml试管中，混匀。

（2）用血沉管吸取混匀抗凝血至0刻度处，拭去管外附着的血液，将血沉管直立在血沉架上。

（3）室温静置1小时后，观察红细胞下沉后血浆高度，读取结果。

4.方法学评价

（1）干扰因素：

红细胞在单位时间的下沉速度与血浆蛋白的量和质、血浆中脂类的量和质、红细胞大小与数量，是否成串钱状聚集、血沉管的内径、清洁度、放置是否垂直和温度高低等因素有关。血沉标本应在采血后3小时内测定，测定前要充分混匀。血沉测定室温要求为18～25℃，在测定期内温度不可上下波动，稳定在±1℃之内，室温过高时血沉加快，可以按温度系数校正，但室温过低时血沉减慢，无法校正。

（2）质量保证：

魏氏法是传统方法，已成为国内的规范方法。ICSH、临床及实验室标准协会（Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI，原为 NCCLS）以及 WHO 均对血沉的标准化发表过多个文件，其中影响最大的为ICSH的推荐法（1 993）及CLSI H2-A4血沉参考法和选择法认可标准，均以魏氏法为基础，规定了从采样至报告结果的各个环节。ICSH和CLSI均采用标准化等级分类，内容基本相似。血沉测定迄今仍未建立确定性方法，血沉测定目前首选为参考法，其次为标准化方法（相当于二级参考法），再次为选择法即工作法或常规法。血沉测定参考法或标准化方法制定了操作规程，新方法对血沉管规格、抗凝剂使用、血标本制备等重新作出了规定，其突出的优点是采用EDTA抗凝，可与血液分析仪共用1份抗凝静脉血标本，并在分析结果时易于综合白细胞的变化进行判断。

红细胞沉降最主要的原因是红细胞发生缗钱样聚集，成团的红细胞重量超过了血浆的阻逆力而下沉。红细胞沉降的影响因素很多，主要有血浆、红细胞及测定条件等。为保证结果的可靠性，血沉检测前患者应注意控制饮食及某些药物的使用（表2-8）。

1）血浆因素：

红细胞悬浮于流动的血浆中，红细胞表面具有Zeta电位，带负电荷，血液流动时细胞间的互相撞击和红细胞表面负电荷的相互排斥，使血流中的红细胞沉降缓慢。如果血浆中有任何降低红细胞表面负电荷的物质，则红细胞间距缩小，易形成缗钱样，此时红细胞群的沉降速度比单个红细胞要快得多；血浆中清蛋白带负电荷，球蛋白和纤维蛋白原带正电荷，正常血浆蛋白质整体呈电中性。当机体发生感染、应激、异常免疫球蛋白合成增加等病变时，带正电荷的球蛋白和纤维蛋白原等含量增加，中和红细胞表面的负电荷，使细胞彼此之间排斥力降低；长链状结构的纤维蛋白原对红细胞显著的“桥联”作用，促使红细胞聚集成缗钱状，缗钱状红细胞团块与血液接触的总面积减少，受到血浆阻逆力减弱而使血沉增快。血沉加快主要是血浆蛋白质的成分与比例发生了改变，而与总蛋白的浓度无关。

2）红细胞因素：

血沉与红细胞数量、形态和表面带电情况有关，红细胞沉降速度与红细胞体积（或聚集状态）成正比，与红细胞表面积成反比。

3）测定因素：

影响血沉的测定因素有抗凝剂、标本溶血、血沉管及温度等因素。

（二）自动血沉仪法

1.原理

红细胞下沉分为3个阶段：①红细胞缗钱样聚集期，约需10分钟；②红细胞快速沉降期，约40分钟；③细胞堆积期，约10分钟，此期红细胞缓慢下降，紧密堆积于容器底部。全自动血沉仪根据红细胞下沉过程中血浆浊度的改变，采用光电比浊、红外线扫描或摄影法动态分析红细胞下沉各个时段血浆的透光度，以微电脑记录并打印结果。

2.器材和试剂

（1）自动血沉仪：均用红外线扫描检测。根据型号不同，可有5～100根试管同时检测，有的还有恒温装置。

（2）试管：应使用与仪器匹配的试管或一次性专用管。

（3）109mmol/L枸橼酸钠溶液。

3.操作

详细阅读说明书，严格按厂商操作规程进行。

4.方法学评价

（1）方法性能：

可记录红细胞下沉全过程及各个时段的改变。测定结果应与“参考方法”比较，制定参考范围。

（2）质量保证：

目前仪器型号较多，工作原理各有不同，方法也尚未达到标准化，原则上要求把好采血、混匀、仪器熟练操作等环节。

（三）参考区间

＜ 50 岁：男性 ＜ 15mm/h，女性 ＜ 20mm/h。

＞ 50 岁：男性 ＜ 20mm/h，女性 ＜ 30mm/h。

＞ 85 岁：男性 ＜ 30mm/h，女性 ＜ 42mm/h。

儿童 ＜ 10mm/h。

（四）临床意义

血沉是一项灵敏但缺乏特异性的指标，不能用于疾病的诊断，但对于疾病的鉴别和动态观察具有一定的参考价值。血沉加快有一定的临床应用价值（表2-9），血沉减慢的临床意义不大。

（胡晓波　丛玉隆）