第一节　标本采集与染色技术

一、血液标本采集

（一）标本采集准备

常规静脉采血时要求保证患者安全，并有利于静脉定位和标本采集。目前，大多数静脉采血是采用双向多重采样针，能通过负压方式将血液分配到盖子颜色不同的采血管中。盖子的颜色提示试管内添加剂不同、用途不同，具体可见表2-1。

若需要采集多种不同用途和类型血液标本，采血顺序为：①无菌黄色盖；②淡蓝色盖；③红色盖；④金黄色或红灰色盖；⑤绿色盖；⑥紫色盖；⑦灰色盖。其他颜色盖子的采血管应排在以上序列后。通常，首先采集血培养标本，以防细菌污染无菌试管。其次采集凝血检验标本，以防其他试管中抗凝剂或促凝剂污染枸橼酸钠抗凝试管；若仅做凝血检验，应采用淡蓝色盖试管，若使用蝶形针采集标本时，必须丢弃第一管血液，以防采血量不足。EDTA作为抗凝剂，会与钙离子和许多金属离子结合而影响许多检验的结果，如导致钙假性减低、钾假性增高，因此EDTA抗凝管尽可能放在其他抗凝管后采集。含草酸钾的灰色盖试管在采集标本时应特别注意，可能会导致血钾假性增高和细胞膜损伤，若添加了氟化钠还会导致血钠假性增高，并抑制许多酶的活性。

1.抗凝剂

抗凝剂能防止血液凝固。EDTA钠盐或钾盐能与钙离子结合，而抑制凝血过程。其他添加物，如枸橼酸钠、草酸钾、聚茴香脑磺酸钠（SPS）也能与钙结合。肝素钠盐、锂盐或铵盐能防止凝血酶原转为凝血酶而起到抗凝作用，应注意血液和抗凝剂的比例恰当，且采血后抗凝剂须与血液充分颠倒混匀。

抗凝剂选择与检验项目有关，EDTA能良好地保存细胞完整性，防止血小板聚集，适用于血涂片染色，但干扰凝血试验。枸橼酸盐抗凝剂适用于凝血试验。SPS适用于血培养，能抑制免疫系统某些补体破坏血源性细菌的作用，并能中和抗体。肝素最适用于血浆化学成分测定和血气分析。草酸钾和氟化钠或碘乙酸组合适用于血糖测定项目。

2.促凝剂

促凝剂能促进血液凝固。通常情况，血清管中血液凝固的时间需要60分钟，当添加促凝剂后可缩短至30分钟。凝血酶能直接缩短凝固时间，适用于急诊血清化学分析。玻璃或硅化物能提供更多的血小板活化接触表面。促凝剂常黏附在试管一侧，所以采集的标本应颠倒混匀5次，使血液与促凝剂充分接触。

3.聚合凝胶

聚合凝胶也称为触变胶，是一种合成物质，其密度介于细胞和血清或血浆之间。当标本离心后，胶体能起到分隔下层细胞和上层血清或血浆的作用。如用于测定血钾的淡绿色盖试管，胶体能防止血浆被红细胞中钾污染，从而使血钾测定结果更可靠。

（二）静脉采血

静脉采血（venipuncture）是最常用采血技术，在静脉采血步骤中最重要的是患者身份的识别。需核对患者身份和申请单（门诊）信息或病历号（住院）信息的一致性。静脉采血有针筒采血法和负压采血法。大多数患者采用负压法采血，少数血管脆性差的患者可采用针筒法采血。以针筒采血法为例进行介绍。

1.操作步骤

（1）采血人员准备：仔细阅读患者申请单，决定采血量，准备每个试验所需的试管，并按一定顺序排列。

（2）患者准备：要求患者坐在采血台前。将前臂放在检验台上，掌心向上，并在肘下放一枕垫。卧床患者，要求前臂伸展，暴露穿刺部位。常用采血位置是肘前弯曲处静脉。

（3）采血人员手消毒，并戴上手套。

（4）使用压脉带：在采血部位上端（通常离采血部位7.5～10cm处），将压脉带绕手臂一圈，用右手握住末端，用左手握住另一端形成一个十字。要求患者握紧和放松拳头几次，使静脉隆起。压脉带应能减缓远端静脉血液回流，但又不能紧到压迫动脉血流。

（5）确定穿刺部位：采用左手示指，触摸进针部位的静脉。

（6）检查器材：打开一次性注射器包装，左手持针头下座，右手持针筒，将针头和针筒紧密连接，并使针头斜面对准针筒刻度，抽拉针栓检查有无阻塞和漏气。最后排尽注射器中的空气，备用。使用前，保持针头无菌状态。

（7）消毒皮肤：按从内向外、顺时针方向的顺序，用浸过碘酊或（碘酒+乙醇）的棉签消毒皮肤，待干。

（8）重新使用压脉带：为了防止血液浓缩或溶血，在消毒皮肤前可取下压脉带，此时，需重新再次扎上压脉带。如果操作熟练，即静脉定位、消毒、待干、检查器材和进针的总计时间不超过30～60秒，可省略重新使用压脉带的步骤。

（9）实施进针：取下针头无菌帽，以左手拇指固定静脉穿刺部位下端，右手持注射器，示指固定针头下座。保持针头斜面和针筒刻度向上，沿静脉走向使针头与皮肤成30°角斜行快速刺入皮肤，然后呈0°角向前穿破静脉壁进入静脉腔。确认穿刺入静脉中心位置，并沿着静脉走向将针头推入10～15mm。

（10）放松压脉带：用左手缓缓向后拉注射器针栓，见少量回血后，松开压脉带。然后，向后拉针栓达到需要的血液量。

（11）防止血肿：用干脱脂棉压住进针部位，迅速向后拔出针头。要求患者紧按住干脱脂棉3分钟，并保持手臂自然伸展状态。不能弯曲手臂，以免形成血肿。

（12）移入试管：从注射器上取下针头。将血液沿试管壁缓缓注入，到达标记处。含抗凝剂试管，应按各具体要求，迅速轻轻颠倒混匀数次。防止溶血和泡沫产生。切忌振荡试管。

（13）针头处理：将一次性针头和针筒放入锐器盒中。

（14）标记试管：在试管上贴上标签，注明患者姓名、采集日期、门诊或住院号。

（15）关心患者：检查穿刺部位出血是否停止，并为患者贴上创可贴。

（16）运送标本：在规定时间内，将标本送达实验室。

2.注意事项

（1）患者准备：

①心理准备：采血前应向患者耐心解释，以消除不必要的疑虑和恐惧心理。②意外处理预案：如遇个别患者进针时或采血后发生眩晕，应立即拔出针头，让其平卧休息片刻，即可恢复。必要时可给患者嗅吸芳香酊、针刺（或拇指压掐）人中和合谷等穴位。若因低血糖诱发眩晕，可立即静注葡萄糖或嘱患者服糖水即可。如有其他情况，应立即找医生共同处理。

（2）确定静脉：

如果肥胖患者的静脉暴露不明显，可以左手示指经碘酊、乙醇消毒后，在采血部位触摸，发现静脉走向后凭手感的方向与深度试探性穿刺。

（3）器材准备：

静脉采血前要仔细检查针头是否安装牢固，针筒内是否有空气和水分。所用针头应锐利、光滑、通气，针筒不漏气。抽血时针栓只能向外抽，不能向静脉内推，以免形成空气栓塞，造成严重后果。

（4）压脉带压迫时间：

采血时压脉带压迫时间不能过长，要求不超过1分钟，绑扎不能过紧，以避免淤血和血液浓缩，影响部分检验结果，如造成血红蛋白和血细胞比容增高。

（5）掌握进针手感：

不能从静脉侧面进针。针头进入静脉感觉是：皮肤有一定阻力，而静脉壁阻力较小，更富弹性。

（6）防止凝块和溶血：

血液加入抗凝试管中应与抗凝剂充分混匀以达到抗凝目的；无需抗凝时则将血液直接注入试管中。防止血液标本溶血，因为溶血后标本不仅红细胞和血细胞比容减低，还会使血清（浆）化学成分发生变化。

（7）及时送检：

血液标本采集后应立即送检，检验室接到标本后应尽快检测。抗凝静脉血可稳定8～12小时，如不能及时测定，应将其置于较稳定的环境中。测定前，若标本从冰箱内取出，需恢复至室温状态，混匀后再测定。用于生物化学检查的标本若不能及时检查，应将血清或血浆与细胞分离，进行适当的处理。

（8）保证生物安全：

整个采血过程保证生物安全。一次性器材只能使用一次，不能再次使用。

（9）负压采血法：

在抽血过程中，若使用一次性负压采血装置，当针头进入血管后会见少量回血，将负压采血管插入采血针中，因试管内负压作用，血液自动流入试管，到达采血量刻度后拔出试管即可。

（三）皮肤采血

皮肤采血法（skin puncture）是常用的采血法之一，适用于静脉采血不可能或不建议的情况，也可用于出血时间测定、快速血糖测定或代替动脉血气的标本采集。

1.操作

（1）检查器材：

仔细阅读患者申请单，决定采血量，准备每个试验所需的试管。取微量吸管和乳胶吸头相连，检查连接处是否漏气，或取一次性微量吸管备用。

（2）确定部位：

婴幼儿选择足跟采血，其他患者选择中指、环指或耳垂。

（3）按摩充血：

轻轻按摩皮肤或用热毛巾温暖皮肤，使局部组织自然充血。

（4）消毒皮肤：

用75%乙醇脱脂棉球或碘酊脱脂棉球擦拭采血部位皮肤，待干。

（5）穿刺进针：

用左手拇指和示指固定采血部位使其皮肤和皮下组织绷紧，右手持一次性消毒采血针自指尖腹内侧迅速刺入，深度2～3mm，立即出针。

（6）拭去血滴：

待血液自然流出或稍加压力流出后，用干脱脂棉擦去第一滴血。

（7）吸取血量：

血液自然流出时，用微量吸管吸血至10μl刻度，然后用干脱脂棉压住伤口止血。如血流不畅，可以用左手自采血部位远端向指尖稍施压使血液流出。

（8）止血压迫：

采血完成后，用干脱脂棉压住采血部位止血，若有可能，贴上创可贴。

（9）血液稀释：

用干脱脂棉擦净微量吸管外部后，将吸管伸入装有稀释溶液的试管底部，慢慢排出吸管内的血液，并用上清液冲洗管内余血3次，最后将试管内的液体混匀。

2.注意事项

（1）采血准备：

①患者准备：在采集标本前，应使患者尽量保持平静，减少运动。住院患者应尽量在早晨卧床时采血。尽量避免药物及饮食对检验结果的影响。②采血顺序：在进行多项检查时，采集血液标本的顺序是血小板计数、红细胞计数、血红蛋白测定和白细胞计数与分类。③采血部位：所选择采血部位的皮肤应完整，无烧伤、冻疮、发绀、水肿或炎症等。除特殊情况外，不要在耳垂、示指、拇指采血。半岁以下婴幼儿因手指小，可自拇指、脚趾或足跟内、外侧缘采血；严重烧伤者可选皮肤完整处采血。

（2）消毒要求：

皮肤消毒后，应待乙醇或碘酊挥发后采血，否则流出的血液不易成滴。

（3）生物安全：

因试验具有创伤性，必须严格按无菌技术操作，防止采血部位感染，做到一人一针一管，避免交叉感染，最好用一次性采血针。

（4）进针技术：

进出针速度要迅速，伤口要有足够深度。

（5）标本质量：

因第一滴血混有组织液，应擦去。如血流不畅切勿用力挤压，以免造成组织液混入，影响结果的准确性。如采血用于自动血液分析仪，最好以优质无菌纸巾擦血，以免棉纤维混入，造成仪器堵孔。

（6）器材校准：

微量吸管应定期进行校准，容量误差 ≤ 1%。血液充入管内的速度不宜过快，避免出现气泡，血液弯月面达到刻度线处即可。

（7）检测时间：

标本采集后应及时测定，最好在2小时内完成，不宜在冰箱内存放。

二、血涂片制备

血涂片制备（preparation of blood smears）是显微镜血细胞形态观察的前提。

1.操作

（1）血标本：

①静脉采血标本：用EDTA·K₂抗凝1～2小时内的标本，使用玻棒、毛细管、注射针头等在距载玻片一端1cm处加1滴抗凝血，直径约4mm；②皮肤采血标本：选择第3、4手指，并先采红细胞、白细胞计数，再采血1滴置清洁玻片上用于血涂片制备。

（2）推片：

左手平执载玻片，或放在类似桌子等平坦地方，右手持推片从后方移动接近血滴，使推片与载玻片呈30°～45°角，用均匀速度向前将血液推成厚薄适宜的血涂片，血涂片应呈舌状，头、体、尾三部分，且清晰可见。所有血液必须在推片到达末端前用完。贫血患者推片速度要快。

（3）干燥涂片：

①空气干燥：将推好的血涂片在空气中晃动，使其迅速干燥；②加热干燥：握住涂片，在距离酒精灯或Bunsen灯火焰上方50mm处晃动，但不能直接对着火焰。

（4）标记信息：

在载玻片的一端用记号笔编号，注明患者姓名或门诊/住院号。

2.注意事项

（1）采血：

①不能采集示指或拇指血液、感染部位血液和耳垂部位血液。②不能使用肝素抗凝标本。

（2）玻片：

必须清洁、干燥、无尘。新玻片应在清洁液中浸泡过夜，然后用水冲洗，最后用蒸馏水冲洗。已用过玻片应在60℃清洁液中加热20分钟，然后用水冲洗，最后用蒸馏水冲洗。边缘破碎、表面有划痕的玻片不能再用。使用玻片时，只能手持玻片边缘，切勿触及玻片表面，以保持玻片清洁、干燥、中性和无油腻。

（3）推片：

许多因素可影响血涂片的厚度，针对不同患者应有的放矢，对血细胞比容高、血黏度高的患者应采用小血滴、小角度和慢推，而贫血患者则应采用大血滴、大角度和快推。涂片质量不佳和可能的原因见表2-2。

（4）固定：

血涂片干透后方可固定染色，否则细胞尚未牢固地吸附在玻片上，在染色过程中容易脱落。

三、血涂片染色

（一）瑞特染色法

1.原理

瑞特染色（Wright stain）液由酸性染料伊红和碱性染料亚甲蓝溶解于甲醇而成。不同的细胞因所含化学成分不同，对各种染料的亲和力也不同，其中，碱性（阳离子）染料能与细胞内酸性物质，如核酸（DNA和RNA）、核蛋白、嗜碱性颗粒、中性颗粒等阴离子结合染成蓝灰色。酸性（阴离子）染料能与细胞内碱性物质，如血红蛋白、嗜酸性颗粒等阳离子结合染成橘红色。

2.试剂

（1）瑞特染液（Ⅰ液）：

含瑞特染料1.0g、纯甲醇［分析纯（AR）级以上］600ml、甘油15ml。将全部染料放入清洁干燥的乳钵中，先加少量甲醇慢慢地研磨（至少30分钟），以使染料充分溶解，再加一些甲醇混匀，然后将溶解的部分倒入洁净的棕色瓶内，乳钵内剩余的未溶解的染料，再加入少许甲醇细研，如此多次研磨，直至染料全部溶解，甲醇用完为止。再加15ml甘油密闭保存。

（2）磷酸盐缓冲液（Ⅱ液，pH 6.4～6.8）：

含磷酸二氢钾（KH₂PO₄）0.3g、磷酸氢二钠（Na₂HPO₄）0.2g、蒸馏水加至1 000ml。配好后用磷酸盐溶液校正pH，塞紧瓶口贮存。如无缓冲液可用新鲜蒸馏水代替。

3.操作

（1）画线：

待血涂片干透后，用蜡笔在两端画线，以防染色时染液外溢。

（2）加染色：

将玻片平置于染色架上，滴加染液（Ⅰ液）3～5滴，使其迅速盖满血涂片。

（3）加缓冲液：

0.5～1分钟后，滴加等量或稍多的缓冲液（Ⅱ液），轻轻摇动玻片或用吸球对准血涂片吹气，使染液充分混合。

（4）冲洗玻片：

5～10分钟后用流水冲去染液，待干。

（二）瑞-吉染色法

1.原理

瑞-吉染色（Wright-Giemsa stain）法与瑞特染色法基本相同。吉姆萨染色法提高了噻嗪染料的质量，加强了天青的作用，对细胞核和寄生虫着色较好，结构显示清晰，而胞质和中性颗粒则着色较差。

2.试剂

（1）Ⅰ液：

含瑞特染料1g、吉姆萨染料0.3g、甲醇500ml、中性甘油10ml。将瑞特染料和吉姆萨染料置洁净研钵中，加少量甲醇，研磨片刻，再吸出上液。如此连续几次，共用甲醇500ml。收集于棕色玻璃瓶中，每天早、晚各摇3分钟，共5天，存放1周以后即能使用。

（2）Ⅱ液：

即磷酸盐缓冲液（pH 6.4～6.8）。包含无水磷酸二氢钾6.64g、无水磷酸氢二钠2.56g，加少量蒸馏水溶解，用磷酸盐调整pH，加水至1 000ml。

3.操作

操作步骤同瑞特染色法，只是染色时将瑞-吉复合染液Ⅰ液和Ⅱ液替代瑞特染液和磷酸盐缓冲液。

（三）方法学评价

1.干扰因素

（1）标本部位：

不能采用的标本：①示指或拇指血液；②感染部位血液，如甲沟炎；③耳垂部位血液，含单核细胞太多。不能使用肝素抗凝标本。

（2）载片质量：

要制备良好的血细胞涂片，玻片必须清洁、干燥、无尘。新玻片应在清洁液中浸泡过夜或已用过的玻片应在60℃清洁液中加热20分钟，然后用水冲洗，最后用蒸馏水冲洗。边缘破碎、表面有划痕的玻片不能再用。使用玻片时，只能手持玻片边缘，切勿触及玻片表面，以保持玻片清洁、干燥、中性和无油腻。

（3）涂片质量：

①干燥性：干透后方可固定染色，否则细胞尚未牢固地吸附在玻片上，在染色过程中容易脱落。②血膜分布：低倍镜下观察血涂片应厚薄适宜，细胞不重叠，头尾及两侧有一定空隙，一些体积大的特殊细胞常在血涂片尾部出现。如有可能，干燥后血涂片先用中性树胶封片后再观察，不仅能长期保存血涂片，而且观察效果更佳。

（4）染液质量：

新鲜配制的染液偏碱，染色效果较差，经在室温下贮存一定时间，亚甲蓝逐渐转变为天青B后方可使用，这一过程称染料成熟。放置时间愈久，天青愈多，染色效果愈好，但必须盖严瓶口，以免甲醇挥发或氧化成甲酸。甲醇必须用AR（无丙酮）。染液中也可加中性甘油3ml，防止甲醇挥发，使细胞染色较清晰。

（5）操作规范：

应规范操作，操作不当会影响血片质量（表2-3）。

2.质量保证

（1）涂片制作：

质量不佳包括：①不规则间断和尾部太长，因推片污染、推片速度不连续、载玻片太脏造成；②有空洞，因载玻片污染脂肪、油脂造成；③白细胞和血小板尾部分布不规则，因制片技术差造成；④涂片太长或太短，因推片角度不佳造成；⑤涂片没有尾部，因血滴太大造成；⑥涂片很短：因血滴太小造成；⑦涂片没有边缘空隙，因推片太宽造成；⑧有细胞退变现象，因固定延迟、固定时间太短、甲醇污染造成。

（2）涂片厚度：

影响因素包括：①血滴大、血黏度高、推片角度大、推片速度快则血涂片厚，反之则血涂片薄；②对血细胞比容高、血黏度高患者应采用小血滴、小角度、慢推，而贫血患者则应采用大血滴、大角度、快推；③推片时如用力过猛，白细胞容易破损。

（3）染色色泽：

质量不佳包括：①太蓝，因涂片太厚、冲洗时间太短、中性水pH太高、染色时间太长、稀释染液重复使用、贮存染液暴露于阳光造成；②太红，因冲洗时间太长、中性水pH太低、贮存染液质量不佳、涂片干燥前加封片造成；③太淡，因染色时间太短、冲洗时间太长造成；④染料沉积，因染料沉淀、染液未过滤、涂片太脏造成；⑤蓝色背景，因固定不当、涂片未固定贮存过久、使用肝素抗凝剂造成。

加染液应适量，过少则易蒸发沉淀，一旦染料沉积在血涂片上，则不易冲洗，使细胞深染不易检查。冲洗时不能先倒掉染液，应以流水冲洗，以防染料沉着在血涂片上。冲洗时间不能过久，以防脱色。冲洗完的血涂片应立放于支架上，防止剩余水分浸泡脱色。

（4）染色时长：

染色需要时间的长短与染液浓度、室温及细胞量有关。染液淡、室温低、细胞多则染色时间长；反之，可减少染色时间。必要时可增加染液量或延长时间。冲洗前，应先在低倍镜下观察有核细胞是否染色清楚，核质是否分明。每批染色液和缓冲液均需试染，以便掌握染色时间和加缓冲液比例。血细胞中各种有机物质，特别是蛋白质，对染色环境中氢离子浓度十分敏感。染色环境偏酸，增强伊红着色，红细胞、嗜酸性粒细胞染色偏红，核呈淡蓝色或不着色；染色环境偏碱，增强天青着色，所有细胞呈灰蓝色，颗粒呈深蓝；嗜酸性颗粒呈暗褐，甚至棕黑色；中性颗粒偏粗呈紫黑色，故应使用新鲜配制的中性水。如血涂片上有染料颗粒沉积，可用甲醇冲洗2次，并立即用水冲掉甲醇，待干后复染。染色太蓝，在含1%硼酸95%乙醇溶液冲洗2次，用中性水冲洗，待干镜检。染色过淡，可以复染。复染时应先加缓冲液，创造良好染色环境后加染液，或加染液与缓冲液混合液，不可先加染液。

（胡晓波　丛玉隆）