第三节　显微照相术

“眼见为实”——人类视觉具有完善的感知能力。图像所展示的直观性远不是描述手段能够替代的，因而现代临床实验室有许多信息借助于图像予以表述，比如，血细胞分析仪和流式细胞仪显示的散点图，电泳和色谱技术所记录的积分图等。记录、展示与交流显微图像，无疑对疾病的诊疗起着十分重要的作用。在临床实验室，显微照相术（micrography）是记录显微图像最为经典和重要的方式，它是一种将经显微镜成像后，通过照相手段，将检验样品信息以胶卷或电子形式记录的专门技术。

一、工作原理

照相，亦称摄影，是使用照相机将物体、景物、人物以彩色或黑白方式拍摄下来进行保存的过程。其分为：①胶卷照相：先使被摄体的影像通过光学镜头聚焦在感光片上产生曝光；曝光后的感光片上的感光剂随光发生变化，经冲洗过程而得到呈现被摄体方位相反、色彩互补的负像底片；再经洗印加工便获得与被摄体基本一致的光学照片。如使用反转感光材料摄影，经冲洗加工，能直接获得正像。其成像原理是物体的反射光线经过镜头的会聚，在胶片上形成潜影，这个潜影是光和胶片上的乳剂产生化学反应的结果。②数码照相：被摄体的影像经过光学镜头聚焦在感光器件［如电荷藕合器件（charge-coupled device，CCD）］或互补金属氧化物导体器件（COMS）上成像，由感光器件光电转换形成电流信号，并通过处理器转换成为计算机能够识别的数字信号，利用数码压缩技术处理后贮存，再经过电光转换而呈现被摄体，或通过打印形成照片；或以电脑处理以便进行图片传输和分析处理。

二、基本结构

1.显微镜及其连接构件

显微镜应具备：①密闭稳固的连接照相机的接口和构件；②色温转换、调整反差及亮度的滤光片组件；③必要时内置适当放大倍数的照相目镜，性能与物镜相宜；④可有调焦目镜，并设有照相取景框。

2.光学相机及控制器

光学照相机可采用135胶卷的专用相机（如接口合适，也可用卸去镜头的普通135相机）；或大幅面附装式相机，配装9cm×12cm/4″×5″散页底片暗盒或一步成像照片暗盒。胶卷或底片应分清日光型或灯光型、反转片或负片等。自动化曝光控制器的技术性能依据不同厂家而略有不同，如实时曝光、多重曝光、重复曝光和条件曝光等。普通相机由自身测光和快门装置控制曝光。

3.数码相机（digital camera）

又称数字相机，它集传统照相技术、图像处理技术和计算机技术于一体，是由光学镜头、固体图像传感器、图像处理芯片、图像存储介质和高精度封装技术组成的图像记录设备。数码相机与光学相机的根本区别在于：它彻底告别了卤化银胶卷，以数字存储器取代感光材料；图像立刻显示在液晶显示（liquid crystal display，LCD）屏上，可用不同的分辨率选择存贮。在拍摄显微图像后，数码相机的输出通常是与计算机相连接，将存储器中的数字照片信息传送到计算机中，通过图像处理软件，可实现对照片的亮度、对比度和色彩变换等处理，最后通过彩色打印机打印出照片，或对图像特征实施科学分析和比较研究。

三、技术评价

（一）显微图像相关术语

1.模拟图像

在空间分布和亮度取值上都是连续的图像称为模拟图像。在显微镜的目镜下所见到的光学图像属模拟图像。

2.数字图像

将连续的模拟图像经过离散化处理后变成计算机能够辨别的点阵图像称为数字图像。一幅数字图像是一个被量化的采样数值的二维数组。

3.像素

即图像元素，用来度量图像数据的最小的单元。在点阵图像中的每一个像素有四个特性：大小、色调、色深度和位置。

4.数字图像的分辨率

指的是单位长度中，数字图像所表达或获取的像素数目。其说明了数字图像的数量或密度，是反映图像分析系统质量的主要指标。

5.色温

发光物体的光谱主要频率可以用一定温度下的黑体辐射光谱来描述，这个温度被称为这个发光物体的色温。色温越高，颜色越偏蓝（冷），而色温越低，颜色越偏红（暖）。国际标准规定日光的平均色温是5 500K，人眼可辨别的色温为2 790～11 000K。

6.白平衡

平衡色温差异的功能。使数字相机拍摄出的图像色彩与人眼所看到的完全一样，这就需要“白平衡”来调整。

（二）技术特点

1.光学相机成像后一般不能对图像进行处理，是较为客观的记录。但它必须使用胶卷，在拍摄完后要经过暗房冲洗才能看到照片，因而不便于对图像的及时取舍，更不能直接对图像进行科学研究。

2.数字图像有以下优点　①即拍即现：数字摄像在拍摄后数秒内就可呈现图像结果，而且可以连续拍摄多张图像，以便从中选取一张效果最好的进行存储；②精度高：可以将图像数字化为任意大的二维数组，与彩色照片图像相差无几；③处理方便：由于数字图像是一组数据，可用计算机进行任意修改，可以放大、缩小、改变颜色，复制、提取和删除某一部分等；④重现性好：模拟图像如照片，即便使用非常好的底片和相纸，也会随着时间的消逝而退色、发黄。数字图像可存储在光盘中上百年后，再用计算机重现时不会有丝毫的改变；⑤易于存储：由于计算机外部存储设备新产品不断涌现，对于海量数据存储提供了无限可能。

四、质量控制

显微照相并非购置了最好的仪器和相机，放上样品后一按快门就可成功，要想记录十分满意的显微图像，必须对显微照相术的技术要点有深刻的了解。

1.严格调整照明系统

按照柯勒照明方式调整后，拍照过程中，每次更换物镜时都应调整孔径光阑和视场光阑。只有这样，才能使给定的物镜/目镜组合所观察的样品区域光源均匀分布于视野，没有漫射光或干扰光产生而影响照片的清晰度，提供了最高的分辨率、最好的反差和最佳的景深。显微镜越高级，照明系统的调节就要越仔细正确，否则难以显现显微镜的优良性能。

2.样品制备得当

制备不良的样品，比如涂片太脏太厚、染色失真、有水渍或指印等来进行显微照相是不适宜的，显微照相装置再好也无法获取满意的照片。

3.光路洁净、调焦清晰

调焦准确清晰，拍出的照片才清秀。在调焦之前先要清洁光路元件，尤其要注意物镜、聚光镜等最靠近样品的前端透镜及滤光片不得有灰尘或油垢等污染物。调焦时先调整在目镜中与照相底片共轭的成像面上的双线十字的取景框，并记下调焦目镜上所标记的屈光度数据以供个人选用；然后再将样品聚焦。如显微镜经他人使用后未再调焦；或调焦目镜未与眼睛的屈光度调整配合，即使所观察的物像清晰，得到的照片也多较模糊。

4.注意感光度

感光度是光学照相时用来表示银盐感光材料对接受入射光线进行化学反应速度的指标。照相时一般根据所用胶卷上的标识来对照相装置相应地设定。较低的感光度有更细腻的成像质量，但进行荧光显微照相时，由于荧光较弱、分布稀疏且易于猝灭的原因，往往选用超高速感光度的胶卷。由于数码相机固体图像传感器光敏元件转换性质不变，所以只能通过变换光敏元件的组合关系来改变感光度。若ISO 100代表用1个光敏元件，当指数提高到400时，则需将4个光敏元件当成1个光敏元件，便能获得4倍的感光速度。

5.运用滤色片

在显微彩色照相时，若照明光源的色温与彩色胶卷的色温不符时，则拍出的照片就会有色彩方面的偏差，即色偏。其预防对策是在照明光路中加入补偿滤色片，如蓝色色温转换滤色片，可把2 800～3 200K灯光色温转换成日光型彩色底片所需的5 500K色温。黑白胶卷对各种波长的可见光同样敏感，若某样品色彩中可见光光谱两端的光占有一定比例时，因这两端波长的光易发生像差，因此照片可能会不十分满意；此时如插入绿色滤光片，以吸收光谱两端的光而突出中间段（550nm）波长的光，可以提高成像的反差。

6.曝光时间正确

当前，显微照相装置都附有自动控制曝光的组件，其曝光时间的确定多是依据对约60%视野面积的亮度测量后演算所得，即平均测光法。但对于显微照相，有时会出现极端的例子，如在暗视野条件下或荧光检测时，背景几乎全是暗的，只有稀疏的发光体，采用平均测光法显然没有可行性。这时就应针对观察主体实施重点测光法，其测光目标为拍照主体，测光面积约占视野面积的1%；或人为增减曝光时间/改变感光度值来拍出系列照片，从而选择正确的曝光时间。

7.注意显微数码照相各种功能

近年来数码相机新品种不断涌现，结合显微摄影的要求，在选择数码相机时尤其需要注意：①固体图像传感器的像素；②液晶显示能否实时显示；③最长曝光时间；④白平衡的校正范围是否满足显微镜的色温；⑤是否能够与显微镜接口连接；⑥能否直接利用计算机的超大容量硬盘存储数字显微图像。用于显微照相的数码相机不但其硬件方面对拍摄条件与参数、图像分辨率与传输速度提出了比普通数码相机更高的要求，而且所附带的软件功能是否丰富，人机界面是否友好也是非常关键的指标。

（王昌富　邓明凤）