第四节　显微数字图像分析

显微图像分析系统（microimage analysis process system）常有3种方式摄取图像：①数码相机；②CCD摄像机+真彩色图像采集卡；③数字摄像机。在临床实验室，显微图像分析常用于图文诊断报告、动态轨迹分析、智能聚类判别和远程会诊报告。

一、工作原理

摄像是通过摄像机将被摄体的光像连续转变为电信号的过程，其成像原理主要是因为镜头将被摄体结成影像投在摄像管或固体摄像器件的成像面上。当前模拟固体器件摄像机仍然是显微图像分析的主要视频图像设备。由于其静态图像分辨率和动态图像的采集速率受到限制，使得数字摄像机成为图像的摄取的发展方向。通常摄像时，来自CCD的信号经彩色校正后，通过模拟/数字（A/D）转换为数字信号，写入动态存储器（DRAM）中的帧缓冲区域作为图像数据。这些数据被传送至NTSC/PAL编码器进行编码，图像由LCD显示；若传送至动态图像专家组（moving picture experts group，MPEG）编解码器中，则按所选取压缩比对数据编码后存储到DRAM中的MPEG编码区域，由微处理器把压缩文件转换成文件格式数据，可写入外部存储器中。

二、基本结构

以CCD摄像方式为例，在临床实验室，显微数字图像分析系统是一种执行显微图像输入和处理、形态学参数测量和光度分析任务的计算机系统（图1-9a）。其基本硬件由计算机、电荷耦合器件（charge-coupled device，CCD），摄像机与图像采集板（或数码相机）、打印机、显微镜及连接构件等部分组成，如图1-9b所示。软件结构大致分为基础运算库、图像获取、图像管理、图像处理与分析以及用户界面等5个模块。

三、技术评价

（一）显微图像中细胞的特征参数提取

1.图像的几何和密度定标

（1）图像的几何定标：

测量定标是用一个已知长度的标准物镜刻度尺，其尺度总长度为1mm，分为100等分，每一分度值为0.01mm，即10μm，刻度线外有一直径为3mm，线粗为0.01mm的圆，以便调焦时寻找线条。刻度线上覆有0.17mm的盖玻片。

由于每一台显微镜的物镜都不完全相同，需用对每台显微镜分别进行几何定标。首先采集×4物镜的水平刻度图像，如果屏幕上的刻度尺不是处于水平位置，可松开显微镜上的视频接口（U-PMTVC）的固定螺丝，转动接口使图像水平；然后将摄像头转动90°，再采集垂直方向的刻度图像。接着分别采集×10、×20、×40和×100水平和垂直的刻度尺图像（图1-10A）。

定标完成后，将每个物镜的定标值保存起来，在之后的测量中，只需根据物镜选择各自的定标值即可，若测量体系不变，一般无需重新定标（图1-10B）。

（2）图像的密度定标：

显微镜的入射光照射在组织或者细胞上，组织或者细胞内的化学物质会吸收照射光或者被激发产生荧光，前者吸收照射光的能力越强即吸光度越大，形成的图像越暗；后者产生的荧光越强，形成的图像越亮。吸光度的大小与组织细胞内化学物质的含量多少有关，与照射光的强弱无关；激发荧光的强度不但与组织细胞内化学物质的含量多少有关，还与照射光的强弱和发光物质的种类有关。

无论是吸光的组织细胞，还是发出荧光的组织细胞，图像分析系统都是用其图像的灰度定量其明暗程度，而定量参数中所提供的吸光度是通过计算得到的。由于灰度是一个无量纲参数，它会随照射光的变化而任意改变，因此，灰度的测量必须进行有效定标（图1-10C）。

1）背景灰度定标：

在对组织细胞的明暗程度测量中，如果能够用相同强度的光去照射组织细胞，其得到的灰度值才具有可比性。在图像分析系统中有的利用图像处理功能将图像的背底减为零，使定量分析的图像处于同一本底灰度上。

2）摄像机线性标定：

系统可采用国家计量研究所提供的标准光密度片对摄像机进行光密度标定。已知标准密度片的密度值，然后用图像分析系统测量其灰度值，用这两个值作二维散点图，就能明显地看出其线性程度。只有直线区段内的灰度值，才能用于组织细胞的吸光度测量，因为这个区段的组织细胞所含的化学成分与图像分析系统的检测数据成比例。

3）标准倍体细胞的标定：

可用鸡红细胞和鼠肝细胞悬液涂片，经福尔根染色（Feulgen staining），在图像分析系统下测量其倍体关系，如果其直方图能反映出2、4、8倍体的关系，则证明系统测量的吸光度值是线性的（图1-11、图1-12）。

2.细胞计量学参数的算法

一幅细胞图像经过平滑滤波、灰度变换、二值化等处理后，图像中就只剩下两个区域，白色的背景和黑色的细胞。如果用0表示图像的背景，用1表示图像中的细胞，就得到二值化后的细胞图像，以提取细胞计量学参数。例如通过采取边界跟踪或区域生长算法寻找连通区，可以提取细胞的面积和周长。

显微图像分析所需要的特征参数是细胞的大小、形状、吸光度等，其大小用面积、周长、直径等参数来衡量；其形状用形状因子、圆形度、矩形度等参数来衡量；其黑暗程度用吸光度、灰度等参数来衡量。

（二）临床应用

1.图文报告与信息交流

（1）细胞形态学图文报告：

利用图像采集功能，可将显微镜下的病理组织、血液细胞图像等采集到计算机中，配合图文报告编辑软件和档案管理软件，便可开展病理、骨髓及细胞学图文报告单的打印。清晰的组织和细胞学图片及简要明了的文字说明不仅加深了临床医师对病理和细胞学诊断的感性认识、为鉴别细胞图像积累了宝贵的经验，也增强了与服务对象亲和力。

（2）远程显微技术：

远程显微技术将显微图片通过远程连接设备实现共享，用于专家咨询和会诊。目前，远程显微技术不但能够选择疑难病例的数码照片，通过电子邮件传送给血液学专家，还可以运行交互式的图像传递，显微镜可以被远程的顾问所控制。ELN（欧洲白血病网，European Leukemia Net）等丰富了网上数据库，包括血液肿瘤患者的数据和图片，具体内容包括病例介绍、细胞学、病理学、细胞遗传学、原位荧光杂交等信息，用于评价远程病理学在血液学研究、临床会诊和教学方面的意义。

2.静态图像参数定量分析和智能判别

静态图像参数定量分析主要应用于细胞形态学的模式识别。检测时将经染色组织切片或细胞涂片以显微数字图像分析系统观察，或基于大量测定的不同群体的细胞（如正常细胞与肿瘤细胞，染色阳性与阴性的细胞）形态学参数；或据各种肿瘤细胞特点，选择最具代表性的参数。获得的定量数据可直接以列表方式分析比较，并经统计分析后所建立图像数据库文件、索引文件和判别公式，或是进行细胞性质的鉴别，或对于肿瘤细胞进一步判别不同类型。常用的细胞特征参数如下：

（1）几何参数：

①细胞及细胞核周长；②细胞及细胞核面积；③细胞及细胞核形状因子；④细胞及细胞核圆形度；⑤细胞质面积及核浆比；⑥偏心度等。

（2）光度参数：

①细胞、细胞核及细胞质的平均吸光度；②细胞、细胞核及细胞质吸光度方差；③细胞、细胞核及细胞质吸光度变异系数；④细胞核及细胞质光扭曲度；⑤细胞核及细胞质的峰态；⑥细胞最大与最小吸光度比等。

一些学者采用显微图像分析技术对白血病细胞形态特征、分型与诊断进行探讨。Jukema等研究了33例儿童患急性淋巴细胞白血病（acute lymphocytic leukemia，ALL）病例，并且比较细胞形态学特征与血液学特征在疾病预后判断方面的价值，研究发现核质比是对预后判断最有价值的形态学特征。Tosi等研究发现在ALL中，细胞核与细胞的面积比率以及细胞的面积这两项指标都是有助于ALL预后判断的独立指标。国内资料采用图像分析技术定量测定急性巨核细胞白血病（M₇）、急性淋巴细胞白血病（L₁，L₂）、急性未分化型粒细胞白血病（M₁）和急性未分化型单核细胞白血病（M_5a）的原始细胞形态学参数。在临床实验中，将待判别的白血病病例按本法测定100个原始细胞，将其相应参数代入判别公式，求得5个Y值；Y值最大者，即为判属的细胞类型。21例白血病回代试验符合率为95.2%（20/21）。国内另有报道对宫颈刷落细胞行液基薄层制片及Feulgen染色，用AcCell全自动细胞图像分析仪扫描并以定量DNA分析方法进行宫颈癌筛查，对于宫颈上皮内瘤变3级（CIN3）以上的宫颈病变的敏感性为82%、特异性为71%，明显优于常规细胞学方法而提高宫颈癌普查的阳性检出率。

3.运动轨迹分析

在细胞行为学研究中，细胞的增殖、细菌的生长、男性精子运动能力的分析等都需要采集动态的图像。动态图像的采集分实时动态采集和定时动态采集。实时动态采集可以同时拍摄大体图像及动态序列图像。利用定时设置功能，系统可按一定时间自动采集镜下图像，并利用减影功能显示出细菌或细胞运动的轨迹。

精子图像的动态采集及分析：将液化后的精液置于显微镜下，采集3秒钟共72帧图像，对这些图像进行叠加运算得到精子的运动图像，再对其进行细化等处理，可分析得出精液中的精子总数、密度、活动力、活动率、速度及活力分级的直方图、精子轨迹图等数十个参数。

四、质量保证

（一）过程控制

1.样品制备

细胞或组织图像是经过显微摄像后加以识别的，因而选取合格的样品为首要步骤。对于病理组织，要求切片宜薄；而细胞涂片应密度均匀，尽量不出现细胞重叠，理想的细胞浓度为40个/mm2。在组织切片或细胞涂片的制备过程中，同一批待测样品最好是在同一标准下进行处理及染色，染色反差要好，无杂质污染，以减少误差。故而要求染色及制备过程的应该统一化及标准化。

2.获取显微数字

图像显微镜按照柯勒照明方式调整后选择适当倍数的物镜调焦。通过摄像机采集显微镜下的图像时，摄像机首先将细胞图像经光/电转换成视频电信号输出给图像采集板，图像采集板再通过模/数转换将模拟的电信号转换为数字图像信号。

3.系统定标

定标的目的是将像素的大小与目标真实大小之间建立起数据上的对应关系。值得注意的是，当更换显微图像分析系统中任何构件（如物镜、摄像机等）时，原有的对应关系都会发生改变而需重新定标。由于灰度是一个无量纲参数，它会随照射光的变化而任意改变，因此，灰度的测量也必须进行有效定标。

4.图像分割与处理

一幅数字化后的显微图像中除了有要分析的细胞外，时常还有其他非测定的细胞和一些杂质。图像分割的目的在于分离需要测定的细胞与不需要测定的细胞和杂质。对于所分析的对象，也常常需要去噪声、对比度增强、直方图均衡、图像锐化等处理手段，以提高被分析图像的质量，获得更加准确的数据。

5.特征抽提与数据选择

细胞图像能抽提的特征很多，其几何特征有面积、周长、圆形度、形状因子等；光学特征有吸光度、积分光密度等。现代计算机的内存和硬盘一般都比较大，较好的图像分析软件往往是同时提取所有特征的数据，在之后分析时再根据需要取舍这些参数。

6.统计分析

将测量结果依据目的要求进行处理与分析，并以表格和图形的形式输出。如获得的细胞特征参数与系统所建立的细胞数据库进行比较判别；或将数据转入SAS或SPSS等统计学专业软件中处理。

（二）分析误差及控制

图像分析系统在使用过程中由于仪器因素和人为原因等会带来各种误差。只有了解这些误差的来源才能有效地防止各种误差的影响，使测量的结果更加可靠。

1.仪器误差

仪器误差包括摄像机非线性带来的误差，摄像机的电子噪声，分割时的阈值设置误差，标定误差等。

（1）摄像机非线性带来的误差：

在用CCD摄像机将显微镜下的光图像转换为电信号图像的过程中，输入的光信号与输出的电信号之间不是一个线性的关系。在实际应用中使用曲线中满足线性度要求的线性段来测量，既可以符合对测量线性度的要求，又不需要作复杂的线性校正。

（2）显微镜视场光不均匀的误差：

显微镜照射到样品上的光线在整个视场内均匀，是显微定量分析的必要条件。如果视场本身不均匀，同一个细胞落在屏幕不同的位置上测量的结果不同，这就失去定量的意义。因此，国际分析细胞学会要求用同一个细胞在屏幕27个位置上测量的结果的变异系数应 ≤ 2%。因此用于定量分析使用的显微镜应该选择性能优良的显微镜。

（3）显微镜视场光不稳定的误差：

显微镜除了视场不均匀以外，还会出现视场光随时间变化的误差。这种变化主要是由于电源电压和频率的变化引起的；或是电位器长期使用的磨损带来的接触不良，显微镜光源受振动引起的光线改变等。出现上述情况时，同一个细胞即使在显微镜视野的同一个位置上，在不同的时间内测量的结果也不一致。

减小这种误差最有效的方法是配备高精度的稳压电源，稳压精度要达到0.1%。在实际工作中可采取先在很短时间存储图像，之后再慢慢测量的方法。另外，采集图像时可一次采集多幅图像进行滤波处理，减小电源变化带来的影响。

（4）灰度阈值设置误差：

细胞的测量最后都要通过阈值分割，将需要测量的细胞与本底灰度分离开来。阈值设置过大会引起测量的细胞面积变大，阈值设置过小会引起测量的细胞面积变小。在多幅图像测量过程中，忽大忽小的阈值会带来较大的误差。因此，灰度阈值不仅设置要准确，而且还要求一致。

（5）图像的空间分辨率和标定误差：

数字图像是由点阵组成的，如果所测量的物体组成的点阵较小，其测量误差较大。例如，一个细胞的长度如果由100个像素点组成，其长度测量的精确度不会优于1%；如果其长度只有10个像素点，其长度测量的精确度不会优于10%。

（6）边缘误差：

在显微图像测量过程中，有些细胞不可避免地会落在屏幕的边缘上，测量边缘的细胞会因为细胞不全带来边缘误差。为了减小这类误差，国外的有些图像分析仪设置了保护区（guard region），设置了保护区后，细胞在测量框内或框上的测量，测量框以外的不测量。当保护区的宽度等于或大于细胞的最大投影直径时，保护区的设置可以完全消除边缘误差。如果细胞的最大投影直径大于保护区的宽度，则保护区的设置不足以完全消除边缘误差。边缘误差可通过设置大于细胞最大投影直径的保护区宽度来消除。但是较大的保护区宽度会影响屏幕上有效地测量区域。

（7）滤波误差：

当显微镜下的细胞图像经摄像机输入计算机的时候，由于仪器本身的质量及周围环境的影响等，使数字化后的图像中含有各种各样的噪声和失真。为了可靠地提取图像的特殊特征，必须消除这些噪声，增强图像中人眼不容易看到的部分。滤波和灰度变换是消除噪声，增强对比度常用的方法，但要针对具体情况使用。例如中值滤波在清除图像上的随机脉冲噪声甚为有效，但对于某些作用形式较为缓和的噪声，效果就要差些；平均值滤波是将某点的灰度值由所取区域内各点灰度的平均值来表示，可能会使图像灰度急剧变化的边缘（轮廓）部分模糊，这是在使用平均值滤波时必须注意的地方。

2.人为误差

人为的误差是最不易发现的且随机出现的误差，这种误差有时会比测量的精确度高出数倍，使测量结果完全失去意义。如人为不正确地设置灰度阈值，人为原因造成的定标错误，采集图像时更换了物镜而忘记了定标，测量中只追求速度而在较低倍率下测量；有技术人员在对组织切片中的肿瘤细胞进行手动测量时，没有仔细地沿细胞边缘画线，而是粗糙地任意勾画；有些不可能出现的特别大和特别小的数据，往往是相连的细胞和没有完全删除的二值化后留下的噪声点等。

在人为误差中，大部分误差是因为工作不仔细而造成，工作人员只要本着对工作认真负责的态度，这种误差就是可以克服的。然而，由于显微图像预处理时，因图而异、情况复杂，因此要求技术人员了解统计学抽样知识，并有良好的技术素养，才能避免人为误差。

（王昌富　邓明凤）