第二节　组合式光学显微镜

对于固定样品或活体组织的观察与研究时，有时发现上述亮视野透射光图像质量并不令人满意。于是不同的显微镜技术，如相差、荧光、偏振光和暗视野等应运而生，或改变照明技术而增强样品的反差，或采用特殊染色以改良细节的识别。本节以组合式光学显微镜为例予以阐述。

一、工作原理

对未做常规染色样品，在普通显微镜下观察各部分结构折射系数仅存在细微差别，因此各部分传导光线强度产生的影响也非常细微。一般说来，亮背景照明所形成图像缺乏反差，不能揭示样品细微结构。有些技术如使用暗背景、相差或偏光干涉能提高反差；通过特殊染色方法，如荧光染色改变光吸收成像可显示细微部分。当不同组织由于具有不同折射系数而呈现光波波长差别越大时，产生反差越强，分辨率越高。表1-2列举了利用光学原理加强反差常用显微镜技术。

二、基本结构

如图1-3所示，组合式光学显微镜以上述普通光学显微镜基本结构为骨架，镜臂或镜筒中还有一些特殊光路插件，如荧光、偏光、照相和摄像等，并附有各种适配聚光器，如暗视野、相差聚光器。组合式光学显微镜构件与技术完善配套不但满足了各种特殊显微镜专业需要，还能应对较为复杂实验要求，如显微荧光分析技术同时应具备落射式荧光与相差光源、展示不同照明方式时显微照相/摄像样品原位特征等。

1.相差光阑与相位板

相差显微镜与普通显微镜结构明显区别即在聚光器下部加设环状光阑，且物镜后焦面处有相位板。环状光阑由一环状孔构成，一组环状光阑可用旋转方式进入光路，也有用抽插的方式将单个不同的环状光阑置于光路中相差装置。其作用是使光源光线形成环形光束，减少不必要直射光干扰。通过巧妙光学设计，使环状光阑与相位板共轭成像，进而调整经过相位板的直射光线与衍射光线间相位关系而产生相干光和干涉条件。

2.荧光滤片组件

常用荧光滤片系统由激发滤片、阻断滤片和二色分光镜构成。激发滤片作用是选择与特定荧光基团对应激发光波长范围，有带通特性；阻断滤片允许有限范围波长光通过，有长波通特性；二色分光镜即反射入射激发光至样品，同时允许样品被激发后所产生的长波长荧光通过。如异硫氰基荧光素（fluorescein isothiocyanate，FITC）激发滤片波长为450～490nm、阻断滤片波长为520nm、分光镜波长即位于510nm。针对不同的荧光基团，厂家往往将常用的荧光滤片系统组合安装于一个模块组件中并予以标识，插入显微镜的光路中便于选用，或与多重荧光基团检测时匹配。

3.偏振光装置

基本装置在聚光器下方设有偏振片（起偏器），物镜后方装有第二块偏振片（检偏器）。两者透光轴相互平行时透过光最强，方向正交时完全消光。偏振片至少有一块是可以转动的，当样品中有旋光性物质时，能按比例旋转偏振光平面，通过检偏器可检测并被观察。

4.暗视野聚光器

暗视野聚光器以环形暗场光阑来遮挡中间部位的直射光线，形成中空的光锥体，光源光线从聚光器周缘部位斜射到样品上，仅有高衍射级参与成像过程，形成黑色背景下明亮的像。

三、技术评价

（一）正确调校柯勒照明的重要性

1.控制照明光束的大小，使所观察视场能受到均匀照明。

2.应用荧光显微镜时，可把激发光限制在所需激发样品视场范围内，以防视场外样品过早受到激发。

3.控制杂散光在成像光路系统中影响，特别是免除杂散光对反差增强方式影响，避免对照相系统干扰，使显微照相底片不至于蒙上一层灰雾。

（二）合理选配特殊光学构件

在组合式光学显微镜购置时，依据拟开展显微镜技术而合理选配光学构件是十分重要环节。以荧光显微镜装置为例，激发光光源中发出较短波长光通过物镜（同时作为聚光器使用）作用在标本上，并激发荧光基团而发出相应较长波长的荧光；荧光返回投射至物镜，经物镜形成实像后被目镜放大观察。只有在分析中科学地选用荧光滤片组件，才能有效透过激发光而仅观测到标记荧光。在白细胞分化群荧光免疫分析时，因涉及荧光显微术和相差显微术，故需配有荧光光源组件和滤光片组件、完善平场萤石玻璃消色差相差物镜，聚光器应附有相差光阑。

（三）无限远色差校正光学系统（infinity color-corrected system, ICS）

ICS是近年推出的一种新型物镜，在显微镜镜筒内有一特制镜筒透镜（tube lens）与物镜相配，两者结合起来，对物镜色差与像差都作出了十分完善的校正，且物镜视域相当宽阔，比传统物镜视域扩大约40%；由物镜射出成像光束是一束平行光，将形成的中间实像投射至无限远，并可在成像光路中按需插入任意多光学部件，如滤光片、检偏器、光束分配器、光学变倍器等而不影响成像质量。

（四）技术应用

荧光、相差、偏光和暗视场等反差增强技术拓宽了显微镜的应用领域，在生物医学和生命科学实验和研究中发挥越来越重要作用。在临床实验室，以荧光显微术和相差显微术最为常用。

1.荧光显微术（fluorescence microscopy）

（1）在免疫细胞化学分析中的应用：

免疫细胞化学技术基本原理是用标记的抗体检测细胞或组织中相应的抗原。荧光色素标记抗体灵敏度高、操作简便。若以这种标记抗体与细胞的相应抗原反应，即形成抗原-抗体复合物，经激发后发射荧光。通过荧光显微术进行观察或显微荧光光度计进行定量测定细胞和组织所产生的荧光（图1-4a）。例如白血病免疫分型、免疫性粒细胞减少症的荧光免疫分析法等。

（2）在荧光核酸染色和原位杂交检测中的应用：

荧光核酸染色技术除能快速检测抗酸杆菌、疟原虫等病原微生物外，现广泛应用于荧光原位杂交技术（图1-4b），其基本原理是用荧光色素标记的核酸作为探针，按照碱基互补的原则，与待检样品中的间期细胞核酸进行特异性结合，形成杂交双链核酸后可用荧光显微术观察，以检测突变基因；由于DNA分子在染色体上呈线性排列，因此还可以用基因片段作为探针与分裂象中染色体进行荧光原位杂交，从而实现染色体上肿瘤基因定位。

2.相差显微术（phase contrast microscopy）

由于相差技术最大特点是在观察未染色样品和活细胞时增强反差，因而能够极其简便地观察未经任何物理学和化学处理的细胞，有其独特应用价值。例如，以普通照明方式观察计数板中血小板，边缘模糊、有光晕，立体感不强；而草酸铵-相差显微镜法计数血小板是经典的参考方法，在相差显微镜下观察血小板，折光明晰、轮廓清楚，极易辨识（图1-5a）。在细胞（或组织）培养时，以倒置相差显微镜观察活细胞动态变化并进行显微操作是一常规方法（图1-5b）。

四、质量保证

（一）观察前质控

1.完成柯勒照明调整步骤

在应用柯勒照明系统之前，要注意选用×10目镜和物镜，将聚光器上升至最高位，NAc刻度调至约为NAo的2/3来调整柯勒照明的效果。其步骤（图1-6）为：①将样品的像调焦清晰，视场亮度适合，其他因素暂不考虑；②将视场光阑收小，此时像的边缘可能模糊；③调整聚光器位置的高低，使视场光阑的像在样品平面上最为清晰时为止；④调整聚光器的对中螺丝，使视场光阑的像位于视野中心；⑤将视场光阑逐渐放大，使其像与视野相等（或外切），从目镜观察，视野恰好全部均匀照明，以避免侧旁多余的杂光漫射。观察时如果物镜更换了，视场光阑和聚光器的孔径光阑大小也要相应地改变，以便与物镜的孔径相符，但聚光镜位置高低不能改变。

2.正确调节聚光器孔径光阑

样品像调节清晰后，将聚光器可变孔径光阑关小，取出目镜，眼睛距目镜筒口约100mm处直接从目镜筒中观察物镜末端的通光孔，边观察边打开聚光器孔径光阑，直至孔径光阑像（多边形）为物镜通光孔的2/3～3/4（图1-7）。

（二）观察中质控

1.由于许多荧光标本在激发光照射下，荧光会很快淬灭，为此须在荧光滤片组件前设置一挡板，可随时关闭或开启。在暂停观察荧光时，应该将激发光挡住。在需采用透射照明方式寻找靶细胞时，宜使用相差技术，以避免强光直射。

2.对于相差技术，由于相位板固定在物镜内，因此不同倍率的物镜要选用相应的环形光阑。对中望远镜插入目镜管可以观察到环形光阑图像与环形相位板对中状况（图1-8）。通过2只六角螺钉扳手可以对环形光阑进行调中。

（三）观察后质控

组合式光学显微镜的分析后注意事项以普通光学显微镜为基础，但由于组合复杂、构件精密，维护保养尤其重要。使用完毕应还原为明场观察模式，逐一切断各部件电源后再将显微镜电源关闭。待灯室冷却后盖上防尘罩。

若以汞灯用作荧光光源，在开启与关闭之间应间隔15分钟以上。否则可能会导致汞灯爆裂，不但损坏荧光部件，还会使有毒的水银蒸气逸出而污染环境。更换汞灯后，应进行光源调节：①打开光源，使之映照于白色背景，即呈现主要光（强光）及附属光（较弱）两种光斑，通过灯箱后方的上、左、右3个调节器，使两种光斑平行靠近且大小接近后，装上灯箱。②调节灯箱上聚焦调节旋钮，使之通过聚光镜的荧光光源达到最强或最为合适，使用时不再随意调节。

（王昌富　邓明凤）