第三节　免疫层析检测法

1971年，Taylor和Faulk把胶体金带入免疫化学，借助免疫胶体金标记，金标抗原抗体复合物大量聚集，可见红色或粉红色斑点。免疫层析检测法，也叫胶体金免疫层析试纸条技术（gold immunochromatography assay，GICA），是近年来发展起来的一类将层析技术与免疫标记技术相结合的检测技术。具有检测更加迅速、操作更加简单、携带更加方便的优势。免疫层析试纸条的本质是亲和层析，主要由五个功能组成部分：①样品垫：样品垫的功能是接收检测样品，并以一种均匀一致的方式将样品转运至结合物释放区域。样品垫也有保证检测时不发生样品浸渍过重的功能，同时也可以过滤掉样品中过大的颗粒物质和细胞等，还可被化学物质浸润从而对样品进行修饰。②结合物释放垫：由于免疫层析试纸条所用的检测试剂通常都是抗体，并在其上标记了信号标记物（示踪标记物），因此结合物释放垫的功能即吸收这些检测试剂，使这些物质在保质期内处于有效的状态，并能在样品流经释放垫时将其进行有效释放。同时，还需要有良好的流动性以保证样品能均一可靠地转移和结合到反应膜上。③反应膜：反应膜的功能是在检测线和控制线位置吸附并将特定目的分子（捕获分子）固定，通常为蛋白质类物质，同时引导样品和检测结合物流向反应区域。要达到这样的目的，反应膜必须具有统一的蛋白高吸附能力，同时还需具备一定的孔隙度和润湿性以保证水性样品的毛细流动。虽然许多聚合物多孔膜的特性能满足部分乃至全部要求，但目前最常用的膜材料仍是硝酸纤维素（nitrocellulose，NC）。④吸收垫：主要功能是作为试剂槽并为整个装置提供吸水动力，因此必须采用具有强吸水力和大吸水体积的亲水材料。⑤背衬：主要用于黏附上述构成部件，使其成为一个整体。

进行检测时，待测样品在检测装置的毛细管作用带动下流经由捕获分子固定后形成的捕获线，并在流经捕获线时捕获分子与样品中的待测分子形成复合物。按照原理可将免疫层析试纸条划分为两类：一是检测大分子物质（如肿瘤标志物）的三明治检测法；二是检测小分子物质（如毒品）的竞争性法。

目前市场上基于免疫层析检测产品的数量正快速并呈持续上升，主要原因在于试纸条的构成组件价格低廉，性价比高，成品试纸条适用于现场快速检测和诊断。在免疫层析发展初期，免疫层析法的信号标记物以胶体金和酶为主，检测多用来提供定性的结果以及用于简单回答“是”和“否”的试验检测。现在，简单的定性检测结果显然已经不能满足各种现场检测的需求，半定量甚至定量检测的需求日益增多，因此越来越多的电子识别装置已经开始与试纸条检测装置整合在一起。尽管这些检测装置设计上具有多样化，可选择不同的信号源（如磁信号或荧光信号），但归根结底，将免疫反应转化为信号的仍然是信号标记物，因此寻找更好的信号标记物为试纸条的检测提供更灵敏、准确的定量检测是免疫试纸条亟须解决的任务。

免疫层析可应用于各种传染病、早期癌症、性病、艾滋病、早孕、排卵、胎儿畸形早期检测等临床检测项目。对临床测定的样品要求、检测时间、仪器设备、人员要求、测试费用、安全性等诸多方面具有一般常规方法所不可比拟的优点。短短的10分钟左右就可以以极低的成本，快捷、简便、直观地检测出许多物质。

一、胶体金在免疫层析快速诊断技术中的应用

免疫层析法（immunochromatography）是近年来兴起的一种快速诊断技术，其原理是将特异的抗体先固定于硝酸纤维素膜的某一区带，当该干燥的硝酸纤维素一端浸入样品（尿液或血清）后，由于毛细管作用，样品将沿着该膜向前移动。当移动至固定有抗体的区域时，样品中相应的抗原即与该抗体发生特异性结合，若用免疫胶体金或免疫酶染色可使该区域显示一定的颜色，从而实现特异性的免疫诊断。

早孕诊断用的免疫层析试纸条（通常又叫尿妊娠试纸）的装配结构如下：在塑料底板上分别将吸尿用玻璃纤维、冻干金标记抗α-HCG玻璃纤维、已固定有抗β-HCG抗体的NC膜及硬质吸水滤纸按要求装配，配件与塑料底板的结合可用双面胶或其他黏性材料黏接。装配好的纸板按纵向剪切，裁成宽度为4mm的条状，即尿妊娠试纸。

本法检测速度快，一般1～2分钟可出结果；灵敏度高，可达50IU/L；好的试纸条结果也是准确可靠的，这也是其能在尿妊娠诊断中得到广泛应用的主要原因。尿妊娠试纸条的快速特性来源于胶体金免疫层析法的固有特性，但与原材料选择特别是NC膜的孔径大小密切相关，准确性取决于抗β-HCG的特异性。

二、胶体金在快速斑点渗滤技术中的应用

ELISA法耗时较长的主要原因，是由于液相中的抗原（或抗体）需经扩散才能与固相上的抗原或抗体反应，不适当地缩短反应时间将使灵敏度降至临床要求以下。为满足临床快速检测的需要，近年来发展了多种简便、快速的免疫学检测方法，快速斑点渗滤法即为其中一种，其标记物质用胶体金即称为快速斑点免疫金渗滤法（dot-immunogold filtration assay），又称滴金免疫法。

快速斑点渗滤法的基本原理仍是间接法或夹心法。间接法测抗体：固定于膜上的特异性抗原+标本中的相应抗体+金标记的抗抗体或SPA显色。夹心法测抗原：固定于膜上的多克隆抗体+标本中待测抗原+金标记的特异性单克隆抗体显色。

结果判断：快速斑点免疫金渗滤法在操作完成后即可直接观察结果。根据测定模式的不同可有不同的判定结果。快速斑点免疫金渗滤法检测速度快，结果观察一目了然，已应用于多种临床检测项目。