第二节 酶联免疫分析
1971年瑞典学者Engvall和Perlmann，荷兰学者Van Weerman和Schuurs，分别报道将免疫技术发展为检测体液中微量物质的固相免疫测定方法，即酶联免疫吸附测定法（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）。ELISA现在已成为分析化学领域中的前沿分析技术，其是一种特殊的试剂分析方法，是在免疫酶标技术（immunoenzymatictechnique）的基础上发展起来的一种新型免疫测定技术。
一、基本原理
使抗原或抗体结合到某种固相载体表面，并保持其免疫活性。使抗原或抗体与某种酶连接成酶标抗原或抗体，这种酶标抗原或抗体既保留其免疫活性，又保留酶的活性。测定时，把受检标本（测定其中的抗体或抗原）和酶标抗原或抗体按不同的步骤与固相载体表面的抗原或抗体起反应。用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与其他物质分开，最后结合在固相载体上的酶量与标本中受检物质的量成一定比例。加入酶反应的底物后，底物被酶催化变为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据颜色反应的深浅来进行定性或定量分析。由于酶的催化频率很高，故可极大地放大反应效果，从而使测定方法达到很高的敏感度。
ELISA可用于测定抗原，也可用于测定抗体。在这种测定方法中有3种必要的试剂：固相的抗原或抗体、酶标记的抗原或抗体、酶作用的底物（显色剂）。根据试剂的来源和标本的性状以及检测的条件，可设计出各种不同类型的检测方法。
ELISA用血清来检测，首先血液要经过至少半小时的凝集，然后取血清。将酶复合物用稀释液稀释后，加血清及阴性、阳性对照，以及质控品。经过一个小时的孵育，然后洗板，加底物，半小时避光反应后加终止液即完成反应部分，然后读数。由数值来判断结果阴性或阳性。
二、检测方法
（一）双抗体夹心法
将大分子抗体分别制备固相抗原和酶标抗原结合物，即可用双抗原夹心法测定标本中的抗体。
在临床检验中，此法适用于检验各种蛋白质等大分子抗原，例如HBsAg、HBeAg、AFP、HCG等。只要获得针对受检抗原的特异性抗体，就可用于包被固相载体和制备酶结合物而建立此法。如抗体的来源为抗血清，包被和酶标用的抗体最好分别取自不同种属的动物。如应用单克隆抗体，一般选择两个针对抗原上不同决定簇的单抗，分别用于包被固相载体和制备酶结合物。这种双位点夹心法具有很高的特异性，而且可以将受检标本和酶标抗体一起保温反应，进行一步法检测。
在一步法测定中，当标本中受检抗原的含量很高时，过量抗原分别和固相抗体及酶标抗体结合，而不再形成“夹心复合物”，造成钩状效应（hook effect），因为标准曲线到达高峰后呈钩状弯落。因此在使用一步法试剂测定标本中含量可异常增高的物质（如血清中HBsAg、AFP和尿液HCG等）时，应注意可测范围的最高值。用高亲和力的单克隆抗体制备此类试剂可削弱钩状效应。
（二）双位点一步法
双抗体夹心法测定抗原时，如应用针对抗原分子上两个不同抗原决定簇的单克隆抗体分别作为固相抗体和酶标抗体，测定时可使标本的加入和酶标抗体的加入两步并作一步。这种双位点一步法不但简化了操作，缩短了反应时间，如应用高亲和力的单克隆抗体，测定的敏感性和特异性也显著提高。单克隆抗体的应用使测定抗原的ELISA提高到新水平。
（三）间接法测抗体
间接法是检测抗体最常用的方法，其原理为利用酶标记的抗体检测已与固相结合的受检抗体，故称为间接法。
间接法主要用于对病原体抗体的检测而进行传染病诊断。间接法的优点是只要变换包被抗原就可利用同一酶标抗记抗体建立检测相应抗体的方法。
间接法成功的关键在于抗原的纯度。应尽可能纯化，以提高试验的特异性。特别应注意除去能与一般健康人血清发生反应的杂质，抗原中也不能含有与酶标记抗体Ig反应的物质。另外，如抗原中含有无关蛋白，也会因竞争吸附而影响包被效果。另一种干扰因素为正常血清中所含的高浓度非特异性抗体。患者血清中受检的特异性IgG只占总IgG中的一小部分。IgG的吸附性很强，非特异IgG可直接吸附到固相载体上，有时也可吸附到包被抗原的表面。因此在间接法中，抗原包被后一般用无关蛋白质（例如牛血清蛋白）再包被一次，以封闭（blocking）固相上的空余间隙。此外，检测过程中标本必须先行稀释（1∶40～1∶200），以避免过高的阴性本底影响结果判断。
（四）竞争法
竞争法可用于测定抗原，也可用于测定抗体。以测定抗原为例，受检抗原和酶标抗原竞争与固相抗体结合，因此结合于固相的酶标抗原量与受检抗原的量成反比。
当抗原材料中的干扰物质不易除去，或不易得到足够的纯化抗原时，可用此法检测特异性抗体。其原理为标本中的抗体和一定量的酶标抗体竞争与固相抗原结合。标本中抗体量越多，结合在固相上的酶标抗体越少，因此阳性反应呈色浅于阴性反应。如抗原为高纯度的，可直接包被固相。如抗原中有干扰物质，直接包被不易成功，可采用捕获包被法，即先包被与固相抗原相应的抗体，然后加入抗原，形成固相抗原。洗涤除去抗原中的杂质，然后再加标本和酶标抗体进行竞争结合反应。竞争法测抗体有多种模式，可将标本和酶标抗体与固相抗原竞争结合，抗-HBc的检测一般采用此法。另一种模式为将标本与抗原一起加入固相抗体中进行竞争结合，洗涤后再加入酶标抗体，与结合在固相上的抗原反应，抗-HBe的检测一般采用此法。
（五）捕获法
血清中针对某些抗原的特异性IgM常和特异性IgG同时存在，后者会干扰IgM抗体的测定。因此测定IgM抗体多用捕获法，先将所有血清IgM（包括异性IgM和非特异性IgM）固定在固相上，去除IgG后再测定特异性IgM。