第四节　荧光免疫测定法

荧光免疫检测是标记免疫技术中最早发展起来的，以一种荧光素为示踪标记物的免疫分析方法，是建立在免疫学、生物化学与显微镜技术基础上的一项技术。早期主要通过荧光显微镜对待测物质进行观察和检测。基本原理是将荧光素标记在抗原分子或抗体分子上，被标记的抗原或抗体分子发生免疫反应时，会形成含有荧光素的免疫复合物，因此可以在荧光显微镜下观察免疫复合物是否能发出荧光，从而检测出目标抗体或抗原。

免疫荧光标记技术始创于20世纪40年代初，最先使用荧光素标记抗体的是Coons研究小组，他们在1942年报道了用异氰酸标记相应的抗体，用于检测小鼠组织切片中的可溶性肺炎球菌多糖抗原。但由于异氰酸荧光素本身的缺陷，该方法未能得到进一步推广使用。具有突破性的进展是，1958年，Riggs等研究小组报道了异硫氰酸荧光素（fluorescein isothiocyanate，FITC）的合成，同时还改进了荧光素标记抗体的方法，从而使免疫荧光技术逐渐推广应用。常用的荧光素有异硫氰酸荧光素和四甲基异硫氰酸罗达明。根据抗原抗体结合步骤的不同，免疫荧光标记技术可分为直接法、间接法、补体法和双重免疫荧光法四种。直接法是指用标记了荧光素的抗体直接与相应的抗原发生特异性反应，从而直接检测出待测抗原。间接法是指用荧光素标记的抗抗体与已经完成抗原抗体免疫反应的免疫复合物反应，形成抗原-特异性抗体-荧光抗抗体的复合物。由于间接法能使更多标记了荧光素的抗抗体与免疫复合物反应，因此灵敏度高于直接法。补体法是指先用与待测抗原能发生特异性反应的抗体和补体混合液进行反应，再将标记了荧光素的抗补体与免疫复合物反应，形成抗原-抗体-补体-抗补体荧光抗体复合物，该方法具有更高的灵敏度。双重免疫荧光法指需要同时检测两种抗原时，可将两种特异性抗体分别标记上具有不同颜色的荧光素，按照一定比例将二者混合之后，加于待测物上，通过此方法可以明确显示出两种抗原的位置。

荧光免疫检测具有特异性强、敏感性高、结果直观等优点，可用于微量检测，但也存在易发生荧光淬灭、荧光染色标本保存困难、易出现非特异性吸附等问题，导致镜检判断结果不准确。

荧光免疫检测可应用于快速检测病原体，也可检测患者血清中特异性抗体水平；检测抗核抗体、抗平滑肌抗体、抗线粒体抗体等自身抗体；检测组织中免疫球蛋白、补体、抗原抗体复合物以及肿瘤组织中肿瘤相关抗原的鉴定；淋巴细胞表面CD抗原、抗原受体、补体受体、Fc受体等检测以及淋巴细胞及其亚群的鉴定和计数；将游离细胞作荧光抗体特异染色后，在流式细胞分析中通过喷嘴逐个流出，经单色激光照射发出的荧光信号由荧光检测计检测，并自动处理各种数据。