第五节 化学发光剂与标记技术
一、化学发光剂的分类
化学发光免疫分析中的发光物质是在化学发光反应中参与能量转移并最终以发射光子的形式释放能量的化合物，称为化学发光剂或发光底物。化学发光免疫分析应用中最常采用发光剂的氧化发光。
1.鲁米诺（luminol）、异鲁米诺（isoluminol）及其衍生物（ABEI）
鲁米诺类物质的发光为氧化反应发光。鲁米诺在碱性条件下和过氧化物酶或无机催化剂（包括卤素及Fe3+、Cu2+、Co2+及其配合物）的催化下，生成激发态中间体，当其回到基态时发射波长为425nm的光。直接作为标记物时，多使用异鲁米诺或其衍生物。早期用鲁米诺直接标记抗原（或抗体），但鲁米诺因标记后发光强度降低，经改良用过氧化物酶标记抗体，进行免疫反应后利用鲁米诺作为发光底物，在过氧化物酶和起动发光试剂（NaOH和H2O2）作用下，鲁米诺发光，同时还可以加入增强剂（6-羟基苯并噻唑衍生物类和对酚类物质）使体系的发光显著增强，发光强度可提高1 000倍，并且“本底”发光显著降低，发光时间也得到延长，便于重复测量，从而提高分析灵敏度和准确性，其发光原理如图1-2-10。增强剂的使用，使化学发光免疫分析在蛋白质、核酸分析领域得到广泛应用。
图1-2-10 鲁米诺化学发光原理
2.吖啶酯类（acridinium ester，AE）
包括吖啶酯Ⅰ、吖啶酯Ⅱ和吖啶酯Ⅲ，在碱性条件下被H2O2氧化，发出波长为470nm的光，是一类具有很高发光效率的发光剂，可用于半抗原和蛋白质的标记。吖啶酯作为标记物用于免疫分析，发光体系简单、快速，不需要加入催化剂，且标记效率高，本底低。吖啶酯的化学发光原理见图1-2-11。
图1-2-11 吖啶酯的化学发光原理（X = Cl，OCH3，OC2H5，OC6H5）
3.二氧杂环丁烷类
常用1,2-二氧环乙烷（AMPPD），是一种超灵敏的ALP底物，性质十分稳定，热分解活化能Ea = 136KJ/mol，5℃下保存的固态AMPPD几乎不分解。AMPPD在碱性磷酸酶（ALP）作用下，磷酸酯基水解脱去一个磷酸基，得到一个中等稳定的中间体AMPD-，AMPD-经分子内电子转移裂解为一分子的金刚烷酮和一分子处于激发态的间氧苯甲酸甲酯阴离子，当其回到基态时产生470nm的光，可持续几十分钟。其发光原理见图1-2-12。
图1-2-12 ALP-AMPPD发光原理
4.三联吡啶钌
三联吡啶钌标记抗体，三丙胺（TPA）参与氧化还原反应。其发生氧化还原反应产生光子的过程需在电极表面进行，因而，该系统专门用于电化学发光免疫分析，在电极表面，以上两种电化学活性物质可同时失去电子发生氧化反应，2价的［Ru（bpy）3］2+标记物被氧化生成3价的［Ru（bpy）3］3+，TPA被氧化成阳离子自由基TPA+*，TPA+*极不稳定，可自发失去1个质子，而形成自由基TPA*，TPA*为强还原剂，可将1个电子组3价的［Ru（bpy）3］3+还原，以便形成激发态的［Ru（bpy）3］2+*，TPA自身被氧化成氧化产物，激发态的［Ru（bpy）3］2+*衰减时可发射1个波长为620nm的光子，重新形成基态的［Ru（bpy）3］2+，该过程周而复始地进行，不断产生光子，其光子信号的强弱与免疫反应中形成的三联吡啶钌标记抗原-抗体复合物的量呈正相关，复合物越多，参与氧化还原反应的吡啶钌越多，光子信号越强。
二、发光剂及酶的标记
化学发光免疫分析过程中，无论发光剂还是参与发光反应的酶类物质，必须通过化学手段将一种分子共价连接到另一种分子上，参与偶联反应的两种物质分别称为标记物和被标记物。抗原和抗体的标记是化学发光免疫分析中十分关键的环节。标记免疫步骤不仅要求标记产物不易脱落、性质稳定，更主要的是标记后标记物应保持原抗原或抗体的活性、保持标记基团的发光活性。鲁米诺、异鲁米诺及其衍生物，吖啶类酯衍生物，辣根过氧化物酶（HRP）和碱性磷酸酶（ALP）是目前化学发光免疫中使用最多的四类标记物。
1.标记方法
（1）碳化二亚胺（EDC）缩合法：
常用试剂为1-乙基-3-（3-二甲氨基丙基）-碳二亚胺（EDC）或二环己基碳二亚胺（DCC），其特点为制备过程较温和，应用范围广。
（2）重氮盐偶联法：
常用试剂为NaNO2和HCl，适用于标记分子含芳香伯胺基、脂肪伯胺基发光剂，ABEI等伯胺基位于侧链者不适用，其特点为简易、成本低、重复性好。
（3）高碘酸盐氧化法：
常用试剂为高碘酸盐、硼氢化钠，适用于芳香伯胺或脂肪伯胺发光剂；不适用于无糖基的蛋白质和含有糖基但氧化后会影响免疫学活性的蛋白质，其特点是稳定且标志物不易脱落。
（4）琥珀酸酐法（环内酸酐法）：
常用试剂为琥珀酸酐+ EDC，琥珀酸酐+三乙胺+氯甲酸酯。该方法能避免双功能交联剂的不良反应，能实现标志物和蛋白质分子间的单向定量缩合，标记效率高。
（5）N-羟基琥珀酰亚胺活化法：
常用试剂为N-羟基琥珀酰亚胺。该方法能避免使用其他双功能交联剂时存在的不良反应，是标记物和蛋白质分子间的单项定量缩合，标记效率高。
（6）戊二醛法：
常用试剂为戊二醛。该方法的特点是在标记反应中双方分子间有较大距离，减少了抗原抗体反应时的空间位阻，但因偶联不易定量控制且缺乏特异性等而未得到广泛应用。
2.影响标记的因素
（1）发光剂的选择：
根据发光剂的结构和性质选择合适的标记方法。使用氨基苯二酰肼类发光剂作为标记物时，应优先选用带有侧链的衍生物如氨丁基乙基异鲁米诺。吖啶酯类发光剂多选用N-羟基琥珀酰亚胺法进行标记，发光效率比鲁米诺高，且在较温和条件下，仅需H2O2和高pH即可激发化学发光。
（2）被标记蛋白质的性质：
抗原作为被标记物时，应具有较高的纯度和免疫学稳定性；抗体作为被标记物时，应具有较高的效价。用提纯的IgG代替全血清以减少血清中氧化酶类的影响，亦可排除其他物质对发光免疫测定的干扰。
（3）标记方法的选择：
无论直接标记法还是间接标记法，都有其独特的反应条件和适用对象。应在熟悉标记方法原理和应用情况下，正确选择与发光剂和被标记物结构相适应的偶联方式。
（4）原料比：
制备发光剂-IgG结合物时，IgG∶发光剂∶交联剂的摩尔比（mol：mol：mol）会影响结合物的发光效率。当确定一种交联剂后，必须仔细选择它们的摩尔比，求出最佳比例。
（5）标记率：
指结合物中IgG与发光剂的摩尔比。由于每一种发光剂对应于被标记物都有最佳标记率，标记物选择不好，会造成标记率低、不易保存等现象。
（6）温度：
对于较稳定的小分子标记物，温度影响较小；当被标记物是抗原或抗体等大分子（蛋白质）时，由于蛋白质的热不稳定性，应尽量选择较低温度，避免蛋白质在标记过程中丧失活性。
（7）纯化与保存：
多数经偶联反应制备的结合物，使用前都需用透析法、凝胶过滤法或盐析法等及时进行纯化。对新制备或经长时间保存的结合物，使用前均需测定蛋白质的含量、免疫学活性及发光效率等指标以保证实验结果准确可靠。结合物一般可分装保存于-70℃，最好冷冻干燥保存，这样可以保存数年而不丧失活性。