第六节　免疫层析原材料

一、免疫层析简介

（一）免疫层析技术简介

免疫层析技术是20世纪60年代在发达国家兴起并用于检测血清蛋白的一种结合免疫技术和色谱层析技术的快速检测分析方法。该分析技术操作简单、便捷，结果易于判断，无需特殊的检测设备。其原理是利用胶体金、磁性纳米材料、稀土纳米材料、量子点等着色标记物，层析时标记物与待测物的络合物被相应的配体捕获而浓集显色于硝酸纤维素膜上的检测线，以纤维膜上显色条带的有无、颜色深浅和反射光线来定性或定量，在医学、农牧业、食品安全、环境监测等领域应用较为广泛。

（二）免疫层析试纸条的基本组成

常见的免疫层析试纸条由样品垫、结合垫、硝酸纤维素（NC）膜、吸水垫、聚氯乙烯（PVC）底板等部分组成。按图1-2-13所示顺序，以层层叠加方式黏附于支撑底板上面，形成一个完整的试纸条结构。

层析膜上一般固定有两条或多条具有不同生物活性的捕获分子作为检测线（test line，T线）与质控线（control line，C线）。T线是判断检测结果的依据，C线则是判断试纸条是否失效的依据。免疫层析试纸条的灵敏度、特异性与稳定性等关键性能参数与以下四部分材料密切相关。

1.样品垫

一般为纤维膜或玻璃纤维，其作用是快速吸收层析液，提高样品层析的均匀性，提升待检物与检测试剂的结合效率，并在一定程度上消除样品的基质干扰，进而提高检测灵敏度与稳定性。在实际应用中，样品垫需要进行相应的预处理，一般使用包含增稠剂、去污剂、阻滞剂等成分的溶液进行浸渍。

2.结合垫

结合垫是吸附具有生物活性的标记材料的载体，应具有优异的释放性能、较低的非特异性吸附、均一的层析性能及较低的阻逆性等特点。与样品垫类似，结合垫主要材料为纤维膜或玻璃纤维，使用前也需要用包含增稠剂、去污剂、阻滞剂等成分的溶液进行浸渍处理。

3.层析膜

层析膜是免疫层析试纸条的核心材料。其承载了T线与C线，是标记材料与待检物发生免疫反应的场所，也是检测结果的判读场所，直接影响免疫层析试纸条的检测灵敏度与检测时间。硝酸纤维素膜（NC膜）由于具有较高的蛋白吸附容量与优异的亲水特性，是目前应用最广泛的层析膜材料。由于NC膜孔径可影响层析液在膜上的层析速度，因此可通过改变NC膜的孔径调控层析液中待检物与T线的反应时间进而调节检测灵敏度与检测时间。

4.吸水垫

吸水垫应为具有良好吸水能力的纸制材料，其作用是吸收流过层析膜的层析液，为层析提供动力，促使更多层析液流经T线与C线。可使用不同吸水效率的吸水垫调控待检物与T线的反应时间进而调节检测灵敏度与检测时间。

（三）免疫层析试纸条的分类

实际应用中，根据免疫层析时待检物与抗体结合方式的不同，免疫层析试纸条主要可分为双抗体夹心模式及竞争抑制模式。

1.双抗体夹心模式

双抗体夹心免疫层析试纸条常用于检测含有两个以上抗原表位的目标物，如病毒、细菌、大分子蛋白与脂多糖等。其基本原理和检测流程如图1-2-14所示，将偶联有检测抗体的标记探针喷涂于结合垫上，并将与相应抗原另一表位结合的捕获抗体固定于T线，将抗检测探针的抗抗体固定于C线。检测时，将样品上样液滴加至试纸条样品垫上，在毛细管力作用下泳动至结合垫，并与标记探针发生免疫学反应形成“标记探针-抗原复合物”，随后该复合物进一步泳动至T线，被捕获抗体拦截并不断积累，从而产生肉眼或仪器可检测的条带。样品中待检抗原越多，积累于T线的标记探针也相应增加，进而产生更强的检测信号。未被T线拦截的标记探针将被C线捕获，同时产生可检测条带。C线主要用于判断试纸条检测结果是否可信，当C线无可检测条带时，则判断试纸条检测结果无效。

2.竞争抑制模式

竞争抑制免疫层析试纸条常用于检测只含有单抗原表位的分子，如真菌毒素、抗生素等。其基本原理和检测流程如图1-2-15所示，将偶联检测抗体的标记探针喷涂于结合垫上，T线与C线分别固定有抗原与载体分子（载体分子通常为蛋白分子）的偶联物以及抗检测探针的抗体。检测时，将样品上样液滴加至试纸条样品垫上，在毛细管力作用下泳动至结合垫，并与标记探针发生免疫学反应形成“标记探针抗体-抗原”复合物，并进一步泳动至T线，由于待检抗原占据了标记探针上抗体的结合位点，使其无法与T线抗原反应，导致T线无法产生可检测条带。样品中待检抗原越多，T线条带越弱，而未与T线反应的标记探针将被C线捕获，同时产生可检测条带。同样，当C线无可检测条带时，判断试纸条检测结果无效。

（四）免疫层析试纸的性能评估

诊断用试剂主要的性能评估指标包括特异度、灵敏度、线性范围、精密度及稳定性等。一个好的项目应具有较高的临床应用价值，能够有助于临床诊断、风险评估或疗效监测等。

1.精密度

精密度（precision）指在规定条件下所获得独立检测结果的接近程度。精密度是检测系统的基本分析性能之一，也是各种方法学的评价基础。常用的术语包括不精密度、重复性、再现性、中间精密度。

2.稳定性

稳定性是体外诊断试剂随时间推移保持其特性一致性的能力，是试剂必须具有的基本属性，也是确保试剂使用过程中有效性的重要指标。

3.线性范围

线性范围（linear range）指覆盖检测系统的可接受线性关系的范围，非线性误差小于设定标准。当某分析物浓度或活性的测量值与真值呈数学上的直线关系时，则认为这种定量测定方法是线性的。对于分析和临床试验方法来说，线性特征非常重要。线性关系代表一种最简单的数学关系，使分析物的结果测量变得简单而容易。

4.灵敏度

灵敏度（sensitivity）又称真阳性率（true positive rate，TPR），指在某疾病的患者中，用待评价诊断试验检出患者的百分率，即真阳性的病例数（a）占金标准诊断的病例数（a + c）的比例，TPR =［a/（a + c）］× 100%。

5.特异度

特异度（specificity）又称真阴性率（true negative rate，TNR），指在非某疾病的患者中，用待评价诊断试验排除患者的百分率，即真阴性的病例数（d）占金标准诊断的非病例数（b + d）的比例，TNR =［d/（b + d）］× 100%。

任何诊断试验必须具备灵敏度、特异度这两大基本特性，两者缺一不可。对于某一诊断试验方法而言，可以通过调整临界值（critical value）提高灵敏度或特异度，但两者不能同时提高，提高灵敏度，必然会降低特异度；反之提高特异度，必然降低灵敏度。因此在选择临界值时必须权衡利弊，兼顾灵敏度和特异度。

在免疫层析试纸条的研发和制备中常为提高试剂灵敏度选择不同的层析标记物。

二、免疫层析技术中的标记材料

免疫层析试纸条的标记材料须同时具备将检测结果“可视化”与“抗体标记”两大功能，是影响灵敏度与稳定性的关键因素之一。优越的标记材料应具有强大的信号能力与简单快速的生物偶联特性。近年来，得益于材料学科的迅猛发展，大量新型标记物材料，包括碳纳米材料、超顺磁纳米颗粒、量子点、上转换荧光材料等被制备，并成功应用于免疫层析试纸条中，大幅度提高了其检测性能。

按照标记物的发展，侧向免疫层析技术经历了胶体金、彩色乳胶微球、纳米标记物三个主要阶段，与之对应，检测结果也经历了定性、半定量、定量三个阶段。纳米标记物的成功应用使LFIAs迈向定量检测的新台阶，根据标记物产生的信号不同，将其大致分为两类：有色型标记材料（如胶体金、超顺磁、碳纳米材料与乳胶微球等）与荧光型标记材料（如量子点、上转换荧光材料、荧光微球等）。

有色型标记物：

胶体金（aurum nanoparticles，AuNPs）在水溶液中由于表面静电作用呈胶体状态，具有优异的理化性质且易于功能化，是LFIAs中最常用的标记物，其特点是会产生肉眼可见的颜色。

荧光标记物：

由于有色型标记物信号放大能力有限，现已将许多新型荧光材料用于LFIAs的定量检测，常用的荧光标记物有量子点、荧光微球、镧系元素等。

（一）胶体金

胶体金（AuNPs）是最早应用于免疫层析试纸条的标记材料，其吸收波长在可见光区，且随着粒径与形貌的变化颜色呈红色、紫色、蓝色，易于肉眼直接观测。胶体金一般采用柠檬酸三钠还原氯金酸制备获得，该制备方法简单可靠，制备的胶体金表面携带大量负电荷，使其在溶液中或干燥状态下非常稳定。此外，大量的负电荷表面使其能够通过静电吸附的简单方式与蛋白质、核苷酸、多肽等生物分子进行温和的偶联，而这种静电结合能最大限度地保留生物分子的活性。以上优势使得胶体金成为免疫层析试纸条中应用最广泛的标记材料。

（1）优点：

①特异性好，胶体金标记物多为特异性单抗或多抗，基本排除非特异性吸附作用。②灵敏度高且操作简便，无需任何仪器和设备，也无需专业人员的指导便可完成。③检测时间短，15min左右，比ELISA、PCR等实验室方法大大缩短检测时间，肉眼便可直观判定，试纸条稳定性好，可长时间室温保存。④检测过程中无放射性同位素和有害物质的参与，不危害检测人员的身体健康，也不污染环境，是一种绿色环保的诊断手段。

（2）缺点：

胶体金免疫层析技术已成为许多疾病的诊断手段，虽然目前已被广泛应用，但仍存在一些不可克服的问题。例如，由于不同产品的质量差异，检测过程中会出现假阳性和假阴性结果，影响试验结果的准确性；还存在制备胶体金过程中对使用的器皿要求高、胶体金溶液稳定性较差等缺点。

胶体金技术已在临床检验、食品安全监督与环境监控各领域得到了广泛应用。然而，胶体金在灵敏度和准确度方面仍受到很多质疑，只能应用于定性检测以及对准确度要求不高的项目，临床上通常只能用于筛查试验，呈现阳性反应后仍需要更精确的方法复检。

（二）彩色乳胶微球

乳胶微球一般由聚苯乙烯材料通过一定的化学反应聚合而成，并可以在其表面进行不同功能基团的修饰，如羧基（－COOH）、氨基（－NH₂）及醛基（－CHO）等，同时拥有高度的分散性、良好的重悬性，可以作为一种载体与生物抗原/抗体相结合，并结合仪器的测量达到相应的检测目的。实验分析中经常会用到乳胶微球等作为以免疫反应为基础的实验分析底物和支持物，包括最早应用的乳胶凝集实验和目前应用较多的乳胶增强免疫比浊分析、固相免疫分析以及捕获酶联免疫分析等。

（1）优点：

色彩鲜艳而丰富，彩虹系列色彩均可调整，可实现多重检测；粒度均一、单分散性好、检测结果可重复性强；检测结果直观，肉眼可观察，使用方便；与胶体金相比，灵敏度更高。

（2）缺点：

只能给出定性或半定量结果。

（三）荧光微球

荧光微球（fluorescent microspheres，FM）是一种新型的荧光标记材料，将荧光物质通过物理吸附法、化学键合法、共聚法、自组装法和包埋法等形成直径在纳米至微米级，通过相应激发光源激发后能发出荧光的固相球体。具有制备简单、球体比表面积大和吸附性强等特点，并且具有稳定的形态结构和高效的发光效率，在许多领域尤其是生物医学领域有重要的应用。

1.荧光微球的优缺点

①优点：荧光微球具有相对稳定的形态结构，粒度均一、单分散性好、偶联效率高、发光效率高；可进行定量检测且检测结果重复性好；有较好的生物相容性且基本不受外界环境变化的影响。②缺点：荧光微球的价格略高于彩色微球。

2.荧光微球的制备

制备抗体与荧光纳米微球偶联后的免疫荧光微球是荧光免疫层析方法得以开展的前提，并且荧光纳米微球与抗体不同的标记条件会对荧光免疫层析试剂盒的检出限和灵敏度产生影响。

免疫荧光微球的制备是将荧光纳米微球通过共价偶联的方式和抗原或抗体结合的标记技术，而免疫荧光乳胶由荧光纳米微球以及共价偶联的抗原抗体组成。其基本步骤包括：①荧光微球乳胶清洗；②荧光微球活化；③抗体偶联；④微球封闭；⑤免疫荧光微球保存。

免疫荧光微球的制备通常使用共价偶联以及高分子微球功能化两种方式。由于共价偶联方法的功能度和交联度更好，通过共价键的结合方式也更为牢固，并且能延长荧光纳米微球的使用时间，因此更为常用。

（四）时间分辨荧光微球

时间分辨荧光微球（time-resolved fluorescent nanobeads，TRFN）是基于镧系元素发光的新型标记材料，其内部包埋稀土——镧系元素（如Eu3+、Tb3+、Sm3+、Dy3+），镧系元素螯合物在紫外光源的激发下能发射特殊的荧光。时间分辨荧光免疫层析技术（time-resolved fluoroimmunoassay，TRFIA）是以微球作为标记物，标记抗原、抗体等物质，利用时间分辨荧光分析仪，确定待测抗原、抗体的量。其特点是通过延迟读取发射光时间以区分特异性荧光信号和基质背景荧光信号，是现在较为常用的标记研究材料。

（1）优点：

灵敏度高，比金标、普通荧光灵敏度高2～3个数量级；标记物稳定，抗干扰强，检测结果重复性好；操作简便，检测时间短，可用于现场检查；可定量检测，无放射性污染。

（2）缺点：

仪器设备要求和成本相对较高。

（五）量子点

量子点（quantum dots，QDs；又称半导体纳米粒子）是近年来发展起来的半导体纳米晶材料，是由Ⅱ～Ⅵ族或Ⅲ～Ⅴ族元素组成，半径小于或接近激光玻尔半径，能接受激发光产生荧光的一类半导体纳米颗粒。其中，研究较多的主要是CdX（X = S、Se、Te），直径为2～6nm，存在显著的量子尺寸效应和表面效应，具有常规材料所不具备的光吸收特性，其应用领域越来越广泛，特别是在免疫生物学和临床检验学等研究中的潜在应用价值，引起广大科学工作者的极大关注，近年来已从细胞标记等应用逐渐向多个领域的检测与诊断方向渗透。量子点作为荧光试剂探针标记生物大分子，是纳米材料在生物分析领域的重要应用之一，目前国内许多体外诊断企业开始采用这一材料作为其荧光免疫层析平台的标记物。

1.量子点的优缺点

（1）与传统的标记材料相比，量子点具有以下特性和优点：

①荧光强度高：量子点效率级数为0.5，稳定性好，抗光致漂白，ZnS包裹的CdSe比罗丹明6G分子亮20倍，稳定性高100～200倍，且可以耐受多次激发。②发光颜色多样：不同粒径大小的量子点发射光的颜色不同，也可以通过改变纳米晶的组成来达到调色功能，如：CdS发射蓝光，InP发射红光。③适应于空间及光谱的多重传输。④量子点的冷光寿命一般在30～100ns，这个时间比背景荧光及大部分样本基质的拉曼散射光要长很多，因此可以减弱甚至消除背景荧光的影响。⑤量子点波谱范围宽：量子点有较宽的吸收光谱，吸收光谱刚好延伸到紫外区域。量子点的发射光波长基本上独立于激发光波长。因此，单一波长激发光、一个波段的光谱或整个激发光源均可激发量子点，使其在整个可见光区域产生一个波谱比较窄的荧光。

（2）缺点：

量子点标记能诱导氧自由基的产生，因此对生物活性物质具有一定毒性，但这些毒性可以通过偶联到蛋白质分子上或覆盖一层低毒物质来降低。量子点和某些蛋白质结合后可能导致量子点的荧光减弱或淬灭，如铜/锌-超氧化物歧化酶对CdSe量子点的荧光有明显的淬灭作用。如果量子点标记用于试纸的制备，其使用过程中需要紫外光源用于色泽变化的观察，与肉眼观察即可判断检测结果的其他类型试纸相比，操作程序稍显复杂。

2.量子点的制备

现阶段，在进行量子点纳米晶体的制备方面，依制备环境的差异可分为两类：有机相环境、水相环境。在有机相环境中，进行量子点纳米晶体的制备优点是具有较高的产率，量子点的稳定性和分散性都很好。然而，在有机相中制备量子点也有不少缺点，比如有机相中制备的量子点纳米晶体实验成本高，制备量子点所用试剂的毒性强，而且制备量子点的操作缺乏安全性。水相环境中，进行量子点的制备具有重复率高、操作简单、环境友好、廉价等优点。同时，在水相中制备的量子点生物相容性较为突出，能够在生物体上直接使用。但在水相环境中，早期制备得到的量子点大都不具有良好的发光性能（HgTe、CdTe除外）。因此，当在水相环境中制备量子点纳米晶体时，通常需采取紫外光照、选择性沉淀、变动量子点结构等方法来提高量子点纳米晶体的荧光量子产率。

（1）在有机相中制备量子点主要采用有机金属法：

将有机金属前驱体溶液注入250～300℃的配体溶液中，前驱体在高温条件下迅速热解并成核，晶核缓慢生长成为量子点，通过配体的吸附作用阻滞晶核生长，并稳定存在于溶剂中。前驱体主要为烷基金属（如二甲基镉）或烷基非金属（如二三甲基硅烷基硒）化合物，主配体可选择三辛基氧化膦（TOP）、十二胺（DDA）吡啶或呋喃等，溶剂兼次配体为三辛基膦（TOP）。该法制备的量子点具有种类多、荧光量子产率高、光学性能优异、粒径可控等优点，是目前制备量子点的主要方法。

（2）在水相中制备量子点主要采用水热法和辅助微波法：

水相制备量子点具有试剂无毒廉价、操作简单、重现性好、表面电荷和表面性质容易控制，容易引入官能团分子等优点，同时，水相制备的量子点具有优越的生物相容性，因此，量子点的水相制备技术已成为量子点制备中的新宠。目前水热法、辅助微波法是水相制备量子点的新技术。①水热法：在特制的密闭反应器（如高压反应釜）中，通过将水加热到超临界温度或接近超临界温度（此时，反应器内将产生高压）而制备量子点的一种方法。水热法继承和发展了水相法的全部优点，克服了常压下水相制备量子点的回流温度不能超过100℃的缺点。由于反应温度的提高，使得量子点的制备周期明显缩短；因成核与生长过程的相互分离，量子点表面缺陷明显改善，显著提高了量子点的荧光量子产率。②辅助微波法：利用微波辐射从分子内部加热，避免了普通水浴或油浴局部过热以及量子点生长速度缓慢等问题，制得的量子点具有尺寸分布均匀、半峰宽较窄和荧光量子产率较高等特点。