第三节　酶

一、酶的定义

酶（enzyme）是由活细胞产生的，对其底物具有高度特异性和高度催化效能的蛋白质或RNA。酶的催化作用依赖于酶分子的一级结构及空间结构的完整性。若酶分子变性或亚基解聚均可导致酶活性丧失。酶作为检测系统中的检测组分，在生物标记化学中有非常广泛的应用。酶可以催化底物分子生成有颜色的、荧光的或化学发光的产物，很容易通过成像、显微镜或光谱学检测或量化。如果一种酶被偶联到特定的目标分子，然后对某些物质进行分析，就可以开发成一个分析系统，用来定位或测量分析物。

生物学和医学中常用的酶联免疫吸附试验（ELISA）是利用酶标记的抗原或抗体来检测、分析样本中的抗体或抗原的方法。ELISA方法重要的三个要素包含抗原抗体的特异性反应、标记抗体的酶进行的催化反应、底物显色后信号的检测。需要标记的酶能特异性、快速催化底物产生有色物质，然后对信号进行检测，根据信号的强弱判断抗原抗体复合物相互作用的情况。ELISA方法分析的灵敏度与偶联物上酶的活性高度相关，同时ELISA方法标记用的酶要求性质稳定，在标记抗原或抗体后不影响酶的催化活性，另外其相应的底物应易于制备和保存。ELISA中标记的酶主要有辣根过氧化物酶（HRP）和碱性磷酸酶（AP），也有报道使用β-半乳糖苷酶（β-galactosidase）。

二、酶的分类

（一）辣根过氧化物酶

HRP最早是在辣根中提取的一种过氧化物酶，因此称为辣根过氧化物酶，酶学委员会编号EC 1.11.1.7。HRP是分子量约44kD的糖蛋白，由无色的酶蛋白和深棕色的辅基铁卟啉（又称亚铁血红素）结合形成一个球状分子，由一个短的β折叠、多个α-螺旋结构组成（图1-2-5）。中性糖和氨基糖约占18%，主要有甘露糖、木糖、阿拉伯糖和己糖胺等。HRP的多糖链常用作偶联反应的位点。这些糖链经温和氧化可与高碘酸钠相结合生成活性醛基，然后与抗体中的氨基结合。实验中常用的偶联剂还有戊二醛和SMCC［succinimidyl-4-（N-maleimidomethyl）cyclohexane-1-carboxylate］。

HRP是一种以光血红素Ⅸ为辅基的血红蛋白。血红素结构的存在使HRP具有其特有的颜色和在403nm处的最大吸收率。溶液中403nm处的吸光度与275nm处的吸光度之比，称为Rz或Reinheitahl比值，可用来检测HRP的纯度，Rz > 3.0表明血红素相对含量高，酶纯度高。然而，HRP至少存在7种同工酶，Rz从2.5～4.19不等。因此除非酶的Rz非常确定，否则在酶标记产物中依靠Rz来测定HRP的纯度将产生较大误差。

HRP常见的制备方法是以新鲜辣根为原料，经过水的抽提、硫酸铵和丙酮分级分离、锌离子纯化、透析除盐、冷冻干燥，最后制得高纯度的HRP。

纯HRP在干燥、-20℃环境可稳定保存，纯化后的酶可在4℃溶液中保存数月而不显著丧失活性。使用1.36mol/L甘油、10mmol/L磷酸钠、30µmol/L牛血清白蛋白和20µmol/L细胞色素C（pH 7.4）溶液作为基质在4℃保存，可使酶结合物稳定数年。HRP非常好的稳定性是选择HRP标记抗体的显著优势。另外，HRP即使在和抗体偶联之后，也能保持非常高的活性。HRP对热及有机溶剂的作用都比较稳定，用甲苯与石蜡切片处理或用纯乙醇或l0%甲醛水溶液固定做冷冻切片，均不能使其活性改变。氰化物或硫化物浓度为105～106mol/L时具有可逆性抑制HRP的作用；氟化物、叠氮化合物或羟胺仅在浓度高于103mol/L时抑制HRP；HRP还可被羟甲基过氧化氢不可逆地抑制；强酸如浓盐酸和浓硫酸也是HRP的强烈抑制剂。因此，酶免疫测定常选用硫酸和盐酸作为反应的终止剂。此外，配制酶免疫测定的稀释缓冲液时，为防止酶失活，应避免使用叠氮化钠作为防腐剂，尤其是在酶标记抗体的过程中，抗体保存缓冲液中常有叠氮化钠，需要特别注意去除。

许多化合物都可以作为HRP的供氢体，即作为HRP的底物，例如邻苯二胺（orthopenylenediamine，OPD）、四甲基联苯胺（3,3′,5,5′-tetramethyl-benzidine，TMB）和2,2′-连氮-双（3-乙基苯并噻唑啉磺酸铵盐）［2,2′-azino-di-（3-ehtylbenzthiazolinesulfonate），ABTS］。其中OPD和TMB是ELISA中最常用的底物。一些底物与HRP形成可溶性有色产物，可用于分光光度检测系统；一些底物形成不可溶性产物，特别适用于染色技术；一些底物可在HRP氧化后产生荧光或化学发光产物。

在HRP催化底物过程中发生的级联反应，还可以通过添加各种增强分子显著提高，这些增强子可产生氧化中间体，导致化学发光底物（如鲁米诺）的氧化和光发射。这就让使用抗体-HRP或链霉亲和素-HRP偶联物开发的增强化学发光分析成为最敏感的检测方法之一。

HRP分子大小是制备酶标抗体的一个优势，整个酶标抗体复合物相对不大。分子量较小的HRP偶联复合物比分子量大的AP偶联复合物能更好地穿透细胞结构。所以HRP酶标抗体通常是免疫组化（immunohistochemisty，IHC）和免疫细胞染色技术的优先选择。

近年来关于辣根过氧化物酶（HRP）的研究主要集中在酶学特性、利用多种表达系统进行重组表达，以及通过突变和化学工程方法进行改进及其应用。迄今为止，绝大多数的HRP研究都集中于一种HRP同工酶C1A（UniProtKB：P00433）。

20世纪60年代，Shannon等通过分离纯化得到了多个同工酶，在特异性、反应的最佳pH、与底物结合能力等多个方面都不完全一样。2014年Näätsaari等报道了70多种编码HRP的基因序列，根据对模型植物拟南芥的研究发现，这些HRP基因都有一个保守的外显子/内含子结构，由4个外显子和3个内含子组成。HRP-C1A蛋白序列包含9个Asn-X-Ser/Thr-X结构域，其中X代表除了Pro的任意氨基酸。植物中的HRP-C1A除了Asn286，其他所有Asn都是潜在的糖基化位点，并且都在蛋白分子表面。HRPC1A蛋白结构的表面有3个赖氨酸（Lys174、Lys232、Lys241）可用于化学修饰或共价连接。

目前商业化的HRP多数是通过直接法从植物辣根中纯化分离。但这种分离方法中得到的是多种同工酶混合物，一些重组表达的方法可以选择性制备其中一种如C1A重组蛋白。HRP-C1A有4个二硫键，所以在重组制备时如果选择大肠杆菌作为宿主，则会形成包涵体，如果用酵母表达系统则不需要变性复性的过程。大肠杆菌表达制备最早见于1988年的一篇专利报道，克隆了HRP基因，然后在大肠杆菌中成功表达。随后也有报道在大肠杆菌中成功表达并复性C1A，制备时去掉了C1A的信号肽和羧基端的前肽。目前大多数通过大肠杆菌表达制备都是通过包涵体复性的方法。有些研究者尝试用pelB信号肽将HRP进行细胞周质表达，从而避免复性过程直接得到有活性的HRP，但这个方法的产量很低。

酵母表达系统中能形成正确的二硫键，且具有糖基化修饰，所以许多研究者选择酵母表达系统进行重组表达HRP。Vlamis等1992年在酵母中成功制备了具有活性的高度糖基化HRP。还有研究者发现Asn175突变成Ser，能显著提高热稳定性。Capone等将C1A所有能糖基化修饰的Asn位点进行了突变，发现催化活性下降了接近300倍。Utashima等利用Cryptococcus sp.S-2酵母成功发酵制备了C1A，且产量高达100mg/L，是目前的报道中产量最高的。Segura等使用昆虫表达系统制备的产量只有40mg/L左右。Kawaoka等在烟草中对HRP成功进行了过量表达。Walwyn等在烟草中进行瞬时表达，最后成功得到的HRP产量为240mg/kg。

（二）碱性磷酸酶

碱性磷酸酶（ALP，E.C.3.1.3.1.）是一种从细菌到动物的生物体中普遍存在的膜结合糖蛋白，在碱性环境下催化磷酸单酯的水解。ALP是一个同工酶大家族，根据在组织中的表达部位可分为四种同工酶，分别是肠碱性磷酸酶、胎盘碱性磷酸酶、生殖细胞碱性磷酸酶和组织非特异性碱性磷酸酶[肝/骨/肾（L/B/K）ALP）。它们的共同特征是，磷酸酶活性在pH为8～10碱性条件下最佳，因此称为碱性磷酸酶，都是被二价阳离子激活，被半胱氨酸、氰化物、砷酸盐各种金属螯合剂和磷酸盐离子抑制。哺乳动物的碱性磷酸酶是含有Zn离子的二聚体金属酶，人体的ALP（UniProtKB：P10696）还有一个结合Mg2+离子的位点，有500多个氨基酸。人血清中的碱性磷酸酶是临床疾病诊断的指标，但绝大多数用于标记抗体或偶联的碱性磷酸酶是从小牛肠上皮细胞分离的，因此重点介绍与标记相关的碱性磷酸酶。

小牛肠碱性磷酸（calf intestinal alkaline phosphatases，CIAP）是由500多个氨基酸构成的分子量约为140kD的二聚体（图1-2-6）。CIAP的活性部位含有两个锌离子和一个镁离子，两个二价金属离子是酶活性必需的。因此，在开发使用CIAP时，缓冲液中应含有低浓度的这两种二价金属离子，才能维持CIAP的最佳活性构象，避免金属螯合剂比如EDTA的存在，螯合剂会严重抑制酶的活性。AP反应的最适pH是8到10，不同类型的同工酶有所差别。CIAP通常在pH为9.8的二乙醇胺缓冲液中具有最高的催化速率常数，并且CIAP的催化速率常数相对其他同工酶更高，因此在生产上作为偶联物的应用较多。

CIAP纯品在溶液中保存一般都需要稳定剂，通常是3M NaCl。CIAP也可以冻干，但随着每次冻融循环，酶的活性可能下降。CIAP在酸性条件下不稳定。将AP溶液的pH降低到4.5会可逆性地抑制酶活性。因此建议所有处理、储存和使用CIAP都在pH > 7.0的条件下进行，以尽可能保持最高的催化活性。

碱性磷酸酶在用交联剂修饰或与抗体分子偶联后可能发生活性降低。简单地按照已有的酶标抗体实验方案并不能确保酶活性的保留，通常在标记不同待标记物时需要摸索最佳条件。在偶联蛋白前应选择纯度高、活性好的碱性磷酸酶，有时活性损失可以追溯到供应商的某个批次。但AP的敏感性很高，空白值也较低，所以生产中偶联蛋白或抗体也会经常使用。

辣根过氧化物酶和碱性磷酸酶底物的比较见表1-2-2。

（三）β-半乳糖苷酶

除了HRP和AP外，生产中用于标记蛋白或抗体的酶还有β-半乳糖苷酶（β-d-galactohydrolase，β-Gal，EC 3.2.1.23）。β-Gal由4个相同的分子量为135kD的亚基组成分子量为540kD的四聚体，每个亚基都有一个独立的活性单位，在水存在下催化β-d-半乳糖水解成半乳糖和醇，其结构见图1-2-7。β-Gal含有大量的巯基和糖基化修饰。β-Gal也需要二价金属离子例如Mg2+激活和维持活性，在反应体系中加入适量的NaCl和低分子醇，如甲醇和乙醇，可增强底物的转化。β-Gal常用的底物4-甲基伞酮基-β-D-半乳糖苷，经酶水解后产生荧光物质，可用荧光计检测。β-Gal在微生物、植物和动物中广泛存在，商业用β-Gal通常从大肠杆菌中分离，最佳的反应pH是7～7.5，对应的人源β-Gal最佳pH是5.5～6.0，因此可以在一定程度上减少使用时的干扰。

由于β-Gal分子量较大，在偶联蛋白时，相对AP和HRP可以在更加广泛的条件下进行，但同时也因为β-Gal分子量太大，β-Gal标记的抗体很难穿透细胞结构，应用中受到很大限制。β-Gal可用于液体中乳糖的测定，被用于食品加工操作，也常被用作监测基因激活和转录的报告酶。