第二节　抗体

一、抗体的定义及结构

（一）抗体的定义

抗体是免疫系统受到抗原刺激，由B细胞产生的一种免疫球蛋白，有独特的结构特点和结构域，能识别抗原并与之特异性结合。最初针对某种抗原制备抗血清得到的抗体数量有限，并且会由于不同批次而产生不同的种类、特异性以及结合能力，限制了抗体在临床和实验中的应用。直到1975年Kohler和Milstein建立了杂交瘤融合技术，使得分泌预定特异性抗体的融合细胞能够持续培养，从而可以利用融合细胞不断生产单克隆抗体。这种方法得到的抗体具有高度均质性、高度特异性、较高亲和力以及可以无限扩大产能等特点。随着现代生物技术的发展，已经能够根据不同需求对抗体进行抗体工程改造，通过改变抗体的大小、特异性、亲和力等特性，调节抗体与抗原的相互作用，或调节抗体与免疫受体相关的免疫效应等。这些创新的形式极大地突破了抗体分子结构固有的局限性，抗体在各个方面的应用得到极大的推广。如今，抗体已经用于多种疾病的诊断以及治疗，同时成为许多免疫学方法常用和必要的研究工具。

（二）抗体的结构

抗体有两个相同的重链（heavy chain）和两个相同的轻链（light chain），每一条轻链（L）通过链间二硫键和一条重链（H）连接在一起，两个重链也通过链间二硫键连接，这四条链H₂L₂连接形成一个Y字形（图1-2-1），称为免疫球蛋白折叠。抗体轻链包含一个可变区（variable region，VL）和一个恒定区（constant region，CL）。重链包含一个可变区（VH），恒定区则会根据抗体不同亚类含有不同数量的恒定区（CH₁～CH₄）。可变区的氨基酸序列在不同B细胞系的产生过程中是可变的，即不同抗体可变区序列不完全相同，而恒定区则相对保守。可变区中含有高变区（hypervariable region），该区域的氨基酸序列具有高度可变性，从而使抗体具有高度的多样性，由于该区域是抗体与抗原相互作用时直接接触的部位，因此又称为互补决定区（complimentarity-determining region）。轻链和重链的可变区共同参与抗原的识别与结合，重链的羧基端恒定区参与调理免疫效应功能，而轻链羧基端恒定区只是可能有助于稳定整个抗体分子的结构以及增加抗体分子多样性。

不同种属的抗体结构总体上是相似的，人类的抗体根据重链结构分为5种类型（α、δ、ε、γ和μ），根据轻链的类型分为两个子类（κ和λ）。通常抗体IgA为（α）重链组成，IgD为（δ）重链组成，IgG为（γ）重链组成，IgE为（ε）重链组成，IgM为（μ）重链组成。IgG、IgE、IgD通常都是H₂L₂的单体形式；IgA除了在血液中以单体形式存在，也可能在唾液和眼泪中通过J链（joining chain）连接形成二聚体形式，J链是一个多肽链；IgM也能通过J链或链间二硫键连接形成5聚体的形式。这些不同亚类在免疫系统中有不同的生物学特性以及功能，同时也在科研以及临床使用中有不同的应用场景。

抗体的不同亚类中，IgG在血液免疫球蛋白中的占比高达80%，通常也用作免疫球蛋白结构的范例，同时也是在各个领域应用最广的。人类的IgG有4种亚类：IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。鼠类的IgG有IgG1、IgG2a、IgG2b和IgG3。IgG分子是最典型的Y字形结构，含有两个相同的轻链，轻链的氨基酸数量在220个左右，分子量约为25kD；含有两个相同的重链，重链氨基酸数量在450个左右，分子量在50kD左右。轻链和重链连接在一起后分子量在150kD左右。IgG的重链恒定区CH₁和CH₂通过铰链区连接，铰链区易被木瓜蛋白酶、胃蛋白酶等水解，产生不同的水解片段。用木瓜蛋白酶水解产生3个片段，2个相同的片段分子量为45kD，具有抗原结合活性，称为抗原结合片段（fragment antigen binding，Fab）；另一个55kD片段在冷存储期间可结晶，称为可结晶片段（fragment crystallizable，Fc）。胃蛋白酶水解产生100kD的可与抗原结合的F（ab′）₂，以及一些小片段Fc′。在诊断和治疗中可以根据需求制备不同的片段，同时也可以利用基因工程技术制备不同的抗体片段产物。

二、抗体的分类

（一）单克隆抗体

1.杂交瘤技术

1975年，英国剑桥大学Kohler和Milstein共同创立了杂交瘤技术，利用该技术成功制备出单克隆抗体，将生物技术带入了一个新时代，因此也获得了1984年的诺贝尔生理学或医学奖。杂交瘤技术是将免疫后的脾细胞和骨髓瘤细胞在诱导剂的作用下，融合形成一个新的细胞，即杂交瘤细胞，融合后的杂交瘤细胞含有双亲本细胞的染色体，因而可以不断快速增殖的同时也能分泌表达抗体。通过对杂交瘤细胞株的筛选以及克隆化，得到纯一的单克隆细胞系，由此单克隆细胞系表达得到的抗体就是各种特性相同的高纯度单克隆抗体，所以该技术也称为单克隆抗体制备技术。整个过程可能需要几个月，涉及多个实验环节。首先要有目的抗原，然后免疫小鼠，多次免疫之后采集小鼠血清，测定血清中抗体滴度，在确定有目的抗原的抗体后取小鼠脾脏细胞与骨髓瘤细胞进行融合，融合完成的细胞使用药物进行筛选，去除没有融合的骨髓瘤细胞，然后利用如酶联免疫吸附试验（ELISA）选出能够表达抗体的杂交瘤细胞，再通过克隆化等方法得到杂交瘤单克隆细胞。

获得稳定的杂交瘤单克隆细胞后，根据不同的需求可选择多种方法制备单克隆抗体。目前大量制备单克隆抗体的方法主要包含动物体内诱生法和体外无血清培养法。动物体内诱生法是将杂交瘤细胞株接种于小鼠腹腔内，诱生出腹水瘤，从而产生含有单克隆抗体的腹水。体外培养制备单克隆抗体的方法是将杂交瘤细胞扩大培养，一种是贴附在固相基质上生长，然后收集含有单克隆抗体的细胞上清，但这种方法得到的抗体量有限，不适合规模化单克隆抗体的制备；另一种方法是将杂交瘤细胞驯化后在无血清培养基中高密度悬浮培养，通过在相应的培养系统中大量高密度培养，细胞数量越多，单克隆抗体产量就越高（图1-2-2）。

2.鼠单克隆抗体生产纯化

通过上述方法制备得到的是含有抗体的混合物，其中含有大量杂质，包括其他抗体、白蛋白、转铁蛋白、脂蛋白、脂质、核酸和病毒等，需要将抗体从中分离纯化才能应用到其他实验和临床中。不同抗体的分子量、等电点、疏水性、溶解性以及和其他物质结合的特异性具有很大差别，也正是利用这些不同的理化性质将抗体分离纯化出来，制备成纯度高、活性好的抗体，以满足后续实验研究和临床需要。通常抗体纯化包括样品准备、样品捕获或粗提纯、中等纯度纯化和精细纯化的四个步骤。常用的方法包括沉淀法、离子交换层析、亲和层析、疏水层析和凝胶过滤层析等。通常需要将几种方法进行组合，没有一种组合方式适用于所有抗体，必须根据使用需求、抗体的理化性质来摸索方案。

3.杂交瘤融合技术以及单克隆抗体生产流程

（1）免疫：

按照免疫佐剂说明书，用抗原注射Balb/c小鼠，通常采用8～12周龄的雌性鼠。一般需要多次免疫，每次免疫抗原的剂量为50～100μg。多次免疫后采用ELISA方法测定小鼠血清中抗体的滴度，抗体滴度越高，免疫效果越好，也与抗原的免疫原性相关。

（2）细胞融合前准备：

选择对数生长期的小鼠骨髓瘤细胞SP2/0，并且骨髓瘤细胞活率要尽可能高，一般大于95%的情况下，后续可以得到较好的融合效果。由于骨髓瘤细胞和脾细胞在选择性培养基中会大量死亡，单个的融合细胞不易存活，所以在融合的前一天准备饲养层细胞，目前有很多厂家提供饲养层细胞替代品。

（3）细胞融合：

细胞融合的过程是细胞在促融剂的作用下，两种细胞的细胞膜和细胞质融合为一个，常用促溶剂是聚乙二醇（PEG），融合的操作手法非常重要，融合后立即进行选择性培养，最常用的是加含HAT的培养基，非正确融合的细胞会在选择性培养基中死亡，正确融合克隆才能正常生长。

（4）细胞筛选：

检测杂交瘤细胞能否正确表达目的抗原特异性抗体，是非常关键的。一般在融合后第10～11天，可以对有克隆生长孔的培养上清进行ELISA检测。

（5）亚克隆：

通常融合后长出细胞克隆的孔中会有多个克隆，成团的细胞集落不一定来自单个细胞，因此需要对阳性克隆孔进行亚克隆，通过有限稀释等方法得到单个细胞增殖形成的细胞系。

（6）细胞冻存和扩大培养：

得到单克隆细胞系后应及时将一部分细胞进行冻存，另一部分再进行扩大培养，用于后续实验。

（7）单克隆抗体鉴定：

扩大培养的细胞可以通过注射到小鼠体内，诱生腹水从而制备单克隆抗体，通过一定的纯化方法进行纯化，得到纯度较高的单克隆抗体后进行相关验证。此外，也可以大量收集培养上清，但培养上清中抗体含量一般较低，得到的抗体可能不足以用于后续鉴定。

（二）多克隆抗体

鼠单克隆抗体是用免疫原免疫小鼠后通过一系列技术手段获得，但由于一些蛋白与小鼠的蛋白同源性高，导致很难通过免疫小鼠获得高亲和力和特异性的抗体。因此除了免疫小鼠，通常还会免疫兔或山羊等实验动物而获得多克隆抗体。多次免疫后，动物的免疫系统将产生针对该抗原的抗体。通过收集动物体内含有这些抗体的血清（也称抗血清），抗血清中可能含有大量白蛋白，以及在动物生存期间受到其他物质刺激免疫系统产生的其他抗体。收集到的血清通过各种方法纯化，可以得到该抗原的多克隆抗体。由于大多数抗原是具有多个抗原表位的复杂结构，从而在实验动物体内产生多种针对不同表位的抗体。最后通过分离纯化得到的抗体就是多个表位抗体的混合物。

多克隆抗体在许多临床检测中都发挥着重要作用，可用来检测和量化多种蛋白质、病毒、细菌等抗原。多克隆抗体在制备过程中相对于单克隆抗体周期短，没有融合筛选等烦琐的步骤，并且一只动物通常可以提供大量抗血清，因此多克隆抗体产量通常也较高，成本低。多克隆抗体包含有针对抗原多个表位的抗体，所以即使抗原在环境中存在微弱变化也不会影响多克隆抗体和抗原的结合，并且一种抗原可以在不同种属的动物体内产生不同多克隆抗体，有利于筛选到适合后续研究的抗体。但是，多克隆抗体由于是多种表位抗体的混合物，可能与其他同源抗原存在交叉反应，导致临床检测中出现假阳性。此外，大规模生产多克隆抗体，需要大量的抗原以及大量的动物，然而动物的生命周期是有限的，同一种动物之间还有个体差异，导致多克隆抗体生产时每一批都可能出现较大差异，也就是批间差很难控制。

（三）基因工程抗体

通过杂交瘤技术制备的是鼠单克隆抗体，在鼠单克隆抗体用于治疗患者的过程中，对于人体来说是一个外源物质，会产生抗鼠抗体的抗体即人抗鼠抗体（human anti-mouse antibodies，HAMA），可能引起患者过敏反应，产生的免疫复合物对人体伤害大。例如世界上第一个鼠单克隆抗体药物OKT3，是获得FDA批准的第一个治疗性单克隆抗体，用于治疗患者器官移植后的排斥反应。由于OKT3是鼠单克隆抗体，在人体中存在很强的免疫原性，会引起细胞因子风暴的过敏反应，并且疗效也不佳。

随着对抗体基因结构和功能的深入了解，以及基因工程技术的快速发展，为了减少鼠单克隆抗体的免疫原性，将鼠单克隆抗体的可变区嵌合到人的恒定区，可以很大程度上降低抗体的免疫原性，这种将不同种属的抗体组装在一起称为嵌合抗体（chimeric antibodies）。嵌合抗体的可变区相对于亲本抗体来说没有改变，恒定区对于抗体和抗原相互作用影响不大，因此能够保留亲本抗体的亲和力和特异性。通过基因工程的方法将鼠杂交瘤细胞中的轻链和重链可变区扩增得到可变区基因，然后和人恒定区的基因片段连接，转染细胞表达就可以成功制备人鼠嵌合抗体（图1-2-3）。构建嵌合抗体时，可以根据后续研究的需要，有目的地选择恒定区类型，例如一个鼠单克隆抗体可变区可以嵌合到人IgG、IgM、IgE及IgA等不同亚类的结构上，组装成研究所需要的嵌合抗体类型。不同恒定区的Fc不仅有不同的免疫效应，而且对于整个嵌合抗体的结构稳定性都有影响。

嵌合抗体中鼠源成分占25%左右，所以仍存在较高的免疫原性。后来许多研究人员成功将鼠抗体的与抗原有结合功能的互补决定区移植到人源抗体中，使得该抗体分子中人源成分占到95%左右，称为人源化抗体。在人源化过程中可能会使抗体活性发生改变，所以通常还需要对抗体进行亲和力成熟，才能达到亲本抗体的特性。随着生物信息学的快速发展，通过对抗体蛋白结构深入的认知，结合抗体建模等方法，极大地提高了人源化的成功率。尽管已经最大程度将抗体进行人源化，但在人体内应用时仍有可能存在一定的免疫原性，因此后来通过构建转基因动物，使得小鼠等动物能够表达人的抗体基因，对动物进行免疫后，理论上就可以使人的抗体基因在动物体内进行表达，得到全人源的抗体。但是这个技术难度较大，通常只在研发抗体药物时使用，甚至是在某些自身免疫性疾病中作为检测的对象，例如类风湿关节炎患者体内会针对自身的环瓜氨酸产生抗体，而检测患者自身的抗环瓜氨酸抗体是类风湿关节炎的一个诊断标准。本章不介绍全人源抗体的应用，成本相对较低的嵌合抗体和人源化抗体在疾病的诊断和其他学科的研究中有更广泛的应用。

嵌合抗体和人源化抗体不仅可以用于治疗疾病，还可以在临床检验中作为诊断试剂的原料。例如HIV、HCV、COVID-2019等全球流行的传染病检测中，通常用胶体金免疫层析法、ELISA法等。为了保证产品质量，即检测结果准确性，临床实验室需要用阳性质控品进行质量控制，质评机构也需要质控品进行相应产品的质量评价。通常用于检测病原体的质控品为感染者的阳性血清或血浆，来源有限，且传染性强的血液样本不适合作为质控品，因此通过制备这些病原体的嵌合抗体或人源抗体，可以替代传统的血清样本，并可以通过基因工程的办法提高质控物的稳定性和通用性。鼠单克隆抗体是常用的诊断试剂原料，但有些鼠单克隆抗体由于本身的理化特性导致其结构不稳定，也有可能患者曾接受过鼠单克隆抗体的治疗，体内有HAMA抗体，就会产生假阳性结果，或干扰产品的灵敏度和准确性，因此也可以将该鼠单克隆抗体的可变区和人源的恒定区组装成嵌合抗体或人源化改造，尽可能避免结构不稳定和HAMA效应。

随着嵌合抗体等基因工程抗体技术以及基因组学的发展，现在很容易将抗体基因从细胞株或动物体内扩增出来，可以只是可变区也可以是完整的抗体基因，然后通过细胞发酵技术表达得到相应抗体。目前扩增这些基因的来源包括：杂交瘤细胞、脾细胞、外周血淋巴细胞。从杂交瘤单克隆细胞中扩增出靶蛋白抗体基因，可以直接体外表达生产抗体，不需要使用腹水生产，也不受动物培养规模的限制，可以减少动物的痛苦，而且抗体的基因保存起来更加方便和安全。除了基因扩增的办法，目前单细胞测序技术或高通量测序技术都能成功获取抗体基因。从脾细胞或外周血淋巴细胞中克隆抗体基因，一方面减少了杂交瘤融合筛选的过程，节约大量人力和物力；另一方面，如果获得了免疫的兔、羊或其他动物的多克隆抗体基因，就能解决多克隆抗体的批间差较大、成本高、不易扩大生产等问题。一旦成功将这些动物体内的靶蛋白抗体基因扩增出来，就不需要再饲养这些动物，只要有了抗体基因，通过转染哺乳动物细胞就能永久性生产该抗体，并且生产规模理论上可以无限放大。例如，临床诊断中已有兔单抗和羊单抗应用到产品中，很多都是通过将抗体基因克隆出来进行体外表达生产的，并且有了抗体基因序列和抗体蛋白序列，抗体结构可以进一步工程优化以提高亲和力和特异性。因此基因工程抗体可以解决多克隆抗体的问题，并进一步降低生产成本，更好地应用于临床治疗和免疫检测中。

（四）纳米抗体

单域抗体（single domain）或纳米抗体（nanobody，Nb）不同于传统IgG。近些年科学家在鲨鱼和骆驼体内发现的一种新型免疫球蛋白，只有重链，没有轻链，重链包含恒定区CH₂和CH₃，通过一个较长的铰链区连接结合抗原的区域重链可变区（VHH）。VHH中含有决定簇互补区（CDRs），相对保守的框架区，单独克隆并表达出来的VHH结构具有与原重链抗体相当的稳定性以及结合抗原的活性和特异性。虽然和传统抗体结构不一样，但纳米抗体仍然能够高亲和力和特异性地结合抗原，并且纳米抗体分子量只有约15kD，晶体结构纳米级，所以被称为纳米抗体。纳米抗体很容易通过基因工程技术制备生产，同时纳米抗体可以融合其他标签蛋白而不改变其特性，例如组氨酸标签和绿色荧光蛋白等；纳米抗体分子量较小，具有更好的组织穿透性，因此在诊断和治疗中有非常好的应用前景。

已有纳米抗体应用于体外诊断试剂的报道，体内诊断包括免疫成像等。有研究报道：基于纳米抗体开发的侧向层析用于检测刚果锥虫，检测结果灵敏度和特异性都较好；基于纳米抗体成功开发了检测单核细胞增多性李斯特氏菌的ELISA试剂盒；基于纳米抗体可检测小分子（小于1 000Da），例如甲氨蝶呤和嘧菌酯；基于纳米抗体的方法用在食品安全方面，可检测真菌毒素。尽管纳米抗体也有半衰期较短的缺点，但其具有的多方面优势正在被开发应用于多种检测方法和疾病治疗中。

（五）IgY抗体

免疫球蛋白IgY是鸡和鸟类产生的主要抗体，IgY的结构和IgG类似，但有重链恒定区4个，并且重链CH₁和CH₂之间没有铰链区，分子量在180kD左右。IgY与IgG相比较有多个特点：①容易生产制备，因为IgY在血清中含量高达7mg/ml，在鸡蛋黄里可以高达100mg/个，而一只鸡每个月可以产20个鸡蛋，因此一个月可以产出近2 000mg的IgY，通过提取鸡蛋黄中的IgY生产成本较低；②鸡的抗体和哺乳动物抗体特异性会有很大差别，可以得到在哺乳动物中高度保守蛋白的抗体，理论上可以得到哺乳动物蛋白更多表位的抗体；③制备时只需要采集鸡蛋，无须收集动物血液，可以减少动物疼痛；④IgY不会和类风湿因子结合，类风湿因子通常会和哺乳动物抗体结合，在许多检测系统中造成假阳性或背景高的结果，而利用IgY时可以避免类风湿因子的影响。

IgY在临床中应用广泛，特别是在病毒、真菌和寄生虫等病原体的诊断和治疗方面。早在1985年，Gottstein等就成功制备出特异性抗寄生虫的IgY抗体。2007年，有研究人员基于IgY开发了可以检测血吸虫的ELISA试剂，检测血吸虫可溶性抗原的灵敏度可以达到2ng/ml。2000年，Lee等通过构建IgY的噬菌体展示库，筛选得到能特异性结合SARS-CoV病毒的刺突蛋白（spike protein）蛋白抗体，为SARSCoV的诊断和治疗奠定了基础。2020年，多篇文章报道抗SARS-CoV-2的IgY对诊断和治疗新冠病毒感染有较大的临床价值。许多机构研发出针对包括人流感病毒、禽流感病毒和猪流感病毒的IgY，主要是抗特异的流感病毒蛋白，如流感病毒基质蛋白2，该蛋白在感染期间会高表达，抗该蛋白的IgY就可以用于流感的诊断和治疗。此外，还有IgY成功用于诊断登革热、水产养殖中的呼肠孤病毒等。总之，基于IgY开发的ELISA方法已成功应用到多种病原体检测中，基于IgY的诊断方法可以作为基于哺乳动物抗体诊断方法的良好补充。

三、抗体的标记及应用

（一）抗体的标记

抗体在微生物学、基础医学等多个研究领域，多种疾病诊断和治疗中发挥着重要作用，目前已有数百种基于单克隆抗体的诊断试剂产品。这些诊断试剂特别是在体液如血液和尿液的样品检测中应用最广泛。例如基于单克隆抗体开发的人绒毛膜促性腺激素快速检验试纸，可以在15分钟内判断妇女是否怀孕。检测原理是利用抗人绒毛膜促性腺激素制备的双抗体夹心一步法，以胶体金作为指示标记，检测尿液中的人绒毛膜促性腺激素含量，判断是否怀孕。这一方法快捷方便，成本低廉，已得到市场的极大认可。

大多数免疫方法学研究中，抗体通常都是不可缺少的核心原料。这些免疫学方法中一般都需要有一个指示剂来定性或定量检测抗体和目标物质的结合情况。为了实现这一目标，通常会对抗体进行标记，也常称为偶联抗体，是通过一定的方法如稳定的化学键，同时又不影响抗体结合抗原特性的条件下，将特殊的标签连接到抗体分子上。抗体分子上常用偶联的位点是赖氨酸的游离氨基，一个抗体分子约有20个赖氨酸可以偶联标签，通过化学键或酶形成稳定的酶-抗体复合物。另一个可用的位点是抗体分子中的巯基，但由于抗体通常都是成对的半胱氨酸，会形成较稳定的二硫键，游离的二硫键不常见，还原后抗体结构会被改变，所以使用该位点的报道较少。随着基因工程技术的发展，可以对抗体基因工程改造后进行定点偶联，但这种情况多数都应用在抗体偶联药物中。标记抗体的物质包括放射性核素、酶、生物素、胶体金等。

20世纪70年代就有应用核素标记抗体的报道，131I是早期用于抗体标记的核素之一，在肿瘤诊断和治疗中有很长的应用历史。但由于同位素具有放射性的安全性问题，在常见的研究领域中还广泛使用荧光素和酶进行标记抗体。荧光素标记抗体将抗体抗原特异性反应和荧光的敏感性结合起来，随着现代制造业技术的发展，大量新型的荧光和荧光检测仪出现，使得荧光标记抗体广泛应用于各个领域。常用于标记抗体的酶包括辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）、碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，AP）和β-半乳糖苷酶（β-galactosidase，β-Gal）等。带标记的抗体结合目标物质后，经过酶催化底物，会产生一种可被检测的信号，然后通过仪器进行测定，从而对抗体或抗原进行定性或定量分析，以及对抗原抗体进行定位分析。另外，也可以将抗体进行生物素标记，生物素标记反应简单、条件温和且几乎不会抑制抗体活性，生物素标记的抗体可存放多年而不失活，通过亲和素和生物素级联反应后有助于放大信号，提高检测的灵敏度。

（二）抗体的标记方法

常用的抗体标记方法包括酶标记法、生物素标记法、荧光素标记法和胶体金标记法等。通过共价键经适当方法将酶连接在抗体上，制成酶标抗体，实验中常用偶联剂使酶与抗体结合，采用单、双或多功能试剂如戊二醛和高碘酸钠，戊二醛分子上对称的醛基分别与酶和蛋白质分子中游离的氨基、酚基等以共价键结合，生成酶-抗体偶联复合物。高碘酸钠先将HRP表面的糖分子氧化成醛基，然后再与抗体上的氨基相结合，所获酶标记抗体的产率高，近70%的HRP和抗体结合，酶与抗体的活性无重大损失。过碘酸钠标记法与其他偶联方法相比，具有操作简单、反应条件温和等优点，最常用。酶标记抗体的质量主要取决于纯度好、活性强及亲和力高的酶和抗体。

1.酶标记法

（1）HRP标记抗体-高碘酸钠（NaIO₄）法

1）称取5mg HRP溶解于1ml蒸馏水中。加入0.2ml新配的0.1M NaIO₄溶液，室温下避光搅拌20分钟。

2）将上述溶液装入透析袋中，对1mM pH为4.4的醋酸钠缓冲液透析，至少100倍体积，4℃过夜。

3）加20µl 0.2M pH为9.5的碳酸盐缓冲液，使已经醛化的HRP pH升高到9.0～9.5，然后立即加入10mg待标记抗体，在0.01M碳酸盐缓冲液中，室温避光轻轻搅拌2小时。加0.1ml新配的4mg/ml NaBH₄溶液，混匀，4℃放置2小时。将上述液体装入透析袋中，用0.15M pH为7.4的PBS透析，至少100倍体积，4℃过夜。

4）4℃、10 000rpm离心30分钟，去除沉淀，上清液即为酶结合物，加入等体积甘油后分装，4℃保存，不能加入叠氮化钠作为防腐剂，可以加入BSA或脱脂牛奶作为保护剂，使用时现配现用。

5）结果判定：以直接ELISA法对酶标抗体进行鉴定，检测酶标抗体活性、效价以及特异性。

（2）HRP标记抗体-戊二醛法

1）称取HRP 25mg溶于1.25%戊二醛溶液中，室温静置过夜。

2）反应后的酶溶液用生理盐水透析，至少100倍体积。如体积大于5ml，需浓缩至5ml再透析。完成后放置25ml小烧杯中，室温缓慢搅拌。

3）取待标记的抗体12.5mg用生理盐水透析至少100倍体积，透析完成后逐滴加入酶溶液中，室温缓慢搅拌。

4）加1M pH为9.5碳酸缓冲液0.25ml，室温继续搅拌3小时。

5）加0.2M赖氨酸0.25ml，混匀后，室温静置2小时。

6）搅拌下逐滴加入等体积饱和硫酸铵，4℃静置1小时。

7）4℃、3 000rpm离心30分钟，弃上清。沉淀物用半饱和硫酸铵再洗一次，最后沉淀物溶于少量0.15M的PBS（pH为7.4）中。

8）将上述溶液装入透析袋中，用0.15M pH为7.4的PB缓冲盐水透析至少100倍体积，去除铵离子后，可用奈氏试剂检测。

9）4℃、10 000rpm离心30分钟，去除沉淀，上清液即为酶结合物，加入等体积甘油后分装，4℃保存，不能加入叠氮化钠作为防腐剂，可以加入BSA或脱脂奶粉作为保护剂，使用时现配现用。鉴定方法同上。

（3）碱性磷酸酶（AP）标记：

常用戊二醛一步法即可获得满意的抗体——AP结合物。该方法对酶和抗体的纯度要求比较高，并且生物体内有内源性碱性磷酸酶，所以AP标记抗体的使用有一定的限制。碱性磷酸酶的反应体系中不能使用磷酸盐缓冲液，不能有金属螯合剂EDTA等。其标记步骤如下：

1）将5mg AP加入1ml抗体溶液（10mg/ml）中溶解，装入透析袋，于4℃用0.1mol/L、pH 6.8 PBS透析过夜，最好中间换液三次。

2）加入2.5%戊二醛20μl，室温作用2小时，然后于4℃用PBS透析过夜，其间换液三次。

3）换用0.05mol/L pH 8.0 Tris-HCl缓冲液透析，4℃过夜，换液三次。

4）取出标记抗体，用含1%BSA的Tris-HCl缓冲液稀释至4ml，即为AP标记物原液。

5）原液在4℃，12 000rpm离心15分钟，取上清，然后每毫升中加入0.5ml甘油，小量分装，保存备用。

2.抗体的生物素化标记

生物素标记可使抗体氨基与酰化的生物素共价结合，然后生物素化的抗体与酶标-亲和素或荧光染料-链霉亲和素复合物相结合，从而催化底物产生有色物质。其主要步骤为：

（1）将待生物素化的蛋白质用0.1mol/L碳酸氢钠缓冲液（pH 8.0）或0.5mol/L硼酸缓冲液（pH 8.6）稀释到1mg/ml，一般实验室应用的生物素化体积为1～2.5ml；

（2）用0.1mol/L碳酸氢钠缓冲液（pH 8.0）或0.5mol/L硼酸缓冲液（pH 8.6），对蛋白质充分透析；

（3）用1ml DMSO溶解生物素琥珀酰亚胺酯（NHSB）1mg；

（4）向1ml溶解抗体溶液（1mg）加入120µl NHSB溶液（含NHSB 120µg）；

（5）在室温下持续搅拌，保温2～4小时；

（6）加入9.6µl 1mol/L NH₄Cl（每25µg NHSB加1µl），室温下搅拌10分钟；

（7）在4℃对PBS充分透析，至少100倍体积，以除去游离的生物素；

（8）样品4℃、12 000rpm离心10分钟，取上清，加入5%BSA。将生物素化产物置4℃、避光保存，也可以加入50%甘油，置-20℃保存。

3.荧光素标记法

一些物质在光的照射下，吸收光能进入激发态，从激发态回到基态时，可以电磁辐射形式放出所吸收的光能，此现象称为光致发光。此现象中，如用短波长的光照射该物质，在极短的时间内能发射出波长比照射光长的光，即为荧光。异硫氰酸荧光素（fluorescein isothiocyanate，FITC）是目前较为常用的标记抗体的方法，FITC一般呈黄色、褐色或褐黄色粉末或结晶，性质稳定，在低温中能保存多年。FITC的碳酰胺键可与抗体蛋白上的赖氨酸氨基共价结合，形成FITC-抗体结合物。FITC标记抗体可以准确、特异、高灵敏、快速地检测或定位抗原，目前广泛应用于生物学、临床医学等多个领域。

（1）直接标记法

1）抗体的准备：

抗体溶于0.5mol/L、pH 9.5碳酸盐缓冲液，冰浴中搅拌10分钟；

2）荧光素的准备：

按每毫克蛋白质加0.02mg FITC计算，准确称取后加入抗体溶液中；

3）标记：

边缓慢搅拌边加入荧光素，避免粉末黏附于壁上，置于4℃冰箱继续搅拌过夜；

4）透析：

反应完成后，先将结合物以3 000rpm离心20分钟，除去少量沉淀物后装入透析袋中，再置于pH 8.0磷酸缓冲盐的烧杯中透析过夜，至少3次换液；

5）收集保存：

取透析过夜的标记物，4℃、12 000rpm离心15分钟，取上清，收集标记的荧光抗体进行鉴定。

（2）间接标记法

1）抗体的准备：

4℃条件下，用0.01mol/L、pH 8.0磷酸盐缓冲液将待标记的抗体蛋白调整浓度至30mg/ml，置于三角烧瓶内放入冰浴中；

2）荧光素的准备：

按每毫克蛋白质加入0.01mg的荧光素称取，溶解于等量的3%重碳酸钠水溶液中；将抗体溶液与FITC溶液等量混合，置于4℃冰箱搅拌过夜；

3）透析：

反应完成后，先将结合物以3 000rpm离心20分钟，除去少量沉淀物后装入透析袋中，再置于pH 8.0磷酸缓冲盐的烧杯中透析过夜，至少3次换液；

4）收集保存：

取透析过夜的标记物，4℃、12 000rpm离心15分钟，取上清，收集标记的荧光抗体进行鉴定。

四、基于酶标记抗体的应用

（一）酶联免疫吸附试验

酶联免疫吸附试验（ELISA）是所有生物学和临床医学中最常见的一种用于测定抗体抗原相互作用的方法，是基于酶标记的抗体或抗原检测抗原或抗体的免疫检测技术。ELISA方法是1971年Engvall等建立的，此后根据其基本原理建立了直接法、间接法、双抗体夹心法和竞争法等方法。ELISA方法基本原理是，通过上述方法将酶标记抗体形成酶标记复合物，这里的抗体可以是单克隆抗体，也可以是多克隆抗体，标记复合物可以直接与包被在固相基质中的抗原相互结合，在相应酶的底物存在下，标记复合物催化底物产生有色物质，对有色信号进行定性或定量的检测，从而分析得到抗原和抗体相互作用的情况。ELISA具有快速、敏感、简便、易于标准化等优点，得到迅速发展和广泛应用，许多ELISA试剂盒已成功应用到临床检验中，例如多种肝炎病毒等都有商业的ELISA试剂盒。此外，目前已有ELISA全自动处理工作系统，可以在临床应用中快速大量分析临床样本。

ELISA方法实验流程　ELISA方法中需要的实验材料包括酶标板、抗原、酶标记抗体、显色液、终止液及酶标仪。ELISA方法包含直接法、间接法、竞争法及双抗体夹心法（图1-2-4）。以检测杂交瘤细胞上清抗体为例，间接ELISA法的实验流程如下：

1.包被

将抗原固定在固相载体上，最常用的是聚苯乙烯制成的96孔板，也称为酶标板，不同厂家的酶标板吸附能力可能不一样，但一般不会相差太多，可根据实验需要进行选择。将抗原溶于碳酸盐缓冲液，加入酶标板孔中，放置一段时间，4℃过夜或37℃放置2小时，蛋白会吸附在固相载体表面从而起到固定的作用。

2.封闭

由于包被过程中固相载体表面不能被抗原完全覆盖，在后续加入检测样品时，样品中的蛋白也可能部分吸附在固相表面，最后显色时造成假阳性等非特异性干扰，因此在封闭过程中可以用不与检测抗体相互作用的物质，例如牛血清白蛋白或酪蛋白来封闭固相表面，这样就能得到比较干净的本底。

3.洗涤

该过程是将没有结合在酶标板上的抗原和封闭液中的蛋白去掉，避免对样品和检测抗体的干扰。最常用的洗涤液是含去污剂的磷酸盐，如含有0.5% Tween-20的PBS。

4.加样

将杂交瘤细胞上清液加入酶标孔中，一般50～100µl的上清液。然后将样品孵育30分钟至1小时，然后再洗涤去掉没有与抗原结合的样品。

5.加酶标抗体

常用HRP标记的抗鼠抗体的二抗，目前基本是羊或兔的多克隆抗体。酶标抗体一般孵育时间较短，如10～60分钟。孵育完成后也要充分洗涤，尽可能彻底去除没有特异性结合的酶标二抗，否则对整个实验结果影响较大，因为只需要非常少的酶就可以催化底物产生足够多的有颜色物质。

6.显色及终止

使用不同的酶标二抗，显色时有一定的差别，HRP标记的抗体显色较快，3～15分钟内。尽可能避光显色，因为底物对光非常敏感。显色完成后加入终止液，10分钟内测定结果。

7.数据分析

酶标仪读取450nm波长的OD值，待测样本与阴性对照的比值大于2.1判定为阳性。在一定范围内，OD值越高，说明样品中抗体浓度越高。

（二）蛋白质印迹法

蛋白质印迹法（western blotting，WB）也是利用标记的抗体检测抗原的一种方法。该方法是将包含目标蛋白的样品，根据蛋白特有的理化性质，通过电泳分开，然后转移到尼龙膜或硝酸纤维素膜上，然后与抗原特异性的抗体孵育，该过程中标记抗体会特异性结合靶标蛋白，然后洗去游离的抗体，再与酶标记的二抗孵育，最后用底物显色，检测抗原或抗体。如果已知抗原信息，就可以检测抗体的特异性和灵敏度等；如果已知抗体信息，就可以检测样品中是否存在或含有多少靶标抗原。该方法是蛋白质研究中常用的分析技术，目前已经广泛应用于蛋白工程、临床医学等领域中。

（三）免疫组织化学

免疫组织化学是将含有目的蛋白的组织样品固定在载玻片上，然后加入特异性的抗目的蛋白的抗体进行反应，该抗体可以是标记后的抗体也可以是未标记的抗体，未标记的抗体需要后面再加上标记的二抗。标记的抗体不限于HRP和AP等酶，还包括荧光素、胶体金等。经过显色后，在光镜下观测结果。免疫组织化学方法在病理学中占非常重要的位置，尤其在肿瘤诊断和鉴别中得到普遍应用。

（四）流式细胞技术

流式细胞技术（flow cytometry，FCM）是基于抗体进行的一种可以对细胞或亚细胞结构进行快速分析和分选技术。目前市面上有不少流式细胞仪，是结合单克隆抗体及免疫细胞化学技术、光学和计算机科学等多学科的结合产物。基本原理是采用一些复杂的结构设计，使粒子流可以依次通过激光聚焦装置和信号检测传感器，然后将实时监测到的信号传递显示出来，将不同信号的粒子进行分类。这些信号是由荧光标记的物质产生，例如被荧光标记抗体特异性结合的细胞或粒子，一个样本通常会有多种不同荧光标记的不同抗体，使得一个样本可以进行多维度分析。例如在淋巴细胞亚群分析、白血病免疫表型分析等方面的应用，可以使诊断更为精确。

（五）基于标记抗体开发的其他应用

上述多种方法是基于标记抗体而开发出来的，此外还包括一些方法如侧向免疫层析（lateral flow immunoassays，LFIAs）、化学发光酶联免疫分析法（chemiluminescence enzyme-linked immunoassay，CLIA）和免疫比浊法（immunonephelometry）等，在临床诊断中有广泛的应用。