第五节　化学发光分析法

Halman在1977年基于放射免疫分析的基本原理，将酶的化学发光与免疫反应结合起来，建立了化学发光免疫分析方法。美国Ciba Corning公司应用吖啶酯试剂开发出了全自动化学发光免疫分析系统ACS-180自动化学发光分析系统，配套吖啶酯标记试剂。通过不断改进，实现了商业化生产和大面积推广。

化学发光免疫检测法是将免疫反应和化学发光反应结合起来的一种免疫分析技术，某些化合物可以利用化学反应产生的能量使其产物分子或反应中间态分子上升至电子激发态，当此产物分子或中间态分子衰退至基态时，以发射光子的形式释放能量（即发光）。发光剂分为荧光素、生物发光剂、化学发光剂。

化学发光检测可以分为以下几类（表1-1-1）：

一、直接化学发光免疫分析

用吖啶酯直接标记抗体（抗原），与待测标本中相应的抗原（抗体）发生免疫反应后，形成固相包被抗体-待测抗原-吖啶酯标记抗体复合物，加入氧化剂（H₂O₂）和NaOH使反应相成碱性环境，吖啶酯在不需要催化剂的情况下分解、发光。

由集光器和光电倍增管接收、记录单位时间内所产生的光子能，这部分光的积分与待测抗原的量成正比，可从标准曲线上计算出待测抗原的含量。

二、化学发光酶免疫分析

化学发光酶免疫分析（chemiluminescence enzyme immunoassay，CLEIA）是用参与催化某一化学发光反应的酶如辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）或碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）标记抗原或抗体，在与待测标本中相应的抗原（抗体）发生免疫反应后，形成固相包被抗体-待测抗原-酶标记抗体复合物，经洗涤后，加入底物（发光剂），酶催化和分解底物发光，由光量子阅读系统接收，光电倍增管将光信号转变为电信号并加以放大，再传送至计算机数据处理系统，计算测定物的浓度。

（一）辣根过氧化物酶标记的化学发光免疫分析

该分析系统采用辣根过氧化物酶（HRP）标记抗体（或抗原），在与反应体系中的待测标本和固相载体发生免疫反应后，形成固相包被抗体-待测抗原-酶（HRP）标记抗体复合物，加入鲁米诺发光剂、H₂O₂和化学发光增强剂产生化学发光。

（二）碱性磷酸酶标记的化学发光免疫分析

该分析系统以碱性磷酸酶标记抗体（或抗原），在与反应体系中的待测标本和固相载体发生免疫反应后，形成固相包被抗体-待测抗原-酶标记抗体复合物，加入AMPPD发光剂，碱性磷酸酶使AMPPD脱去磷酸根基团而发光。

三、电化学发光免疫测定技术（ECLI）

1990年，Leland等建立的电化学发光反应系统，以电子得失过程中的电位差为能量激发源，进行电化学发光免疫分析。其是罗氏的专利技术，2017年专利到期。电化学发光免疫分析（electrochemiluminescence immunoassay，ECLI）是指在电极表面发生的，由电化学引发的，特异性的化学发光反应，包括电化学和化学发光两个过程。其中电化学发光（ECL）是电启动发光反应，化学发光（CL）是通过化合物混合启动发光反应。常用三联吡啶钌［Ru（bpy）3］2+作为化学发光剂标记抗体。

电化学发光免疫分析系统中，磁性微粒为固相载体包被抗体（抗原），用三联吡啶钌标记抗体（抗原），反应体系内待测标本与相应的抗原（抗体）发生免疫反应后，形成磁性微粒包被抗体-待测抗原-三联吡啶钌标记抗体复合物，将复合物吸入流动室，同时引入TPA缓冲液。

当磁性微粒流经电极表面时，被安装在电极下面的电磁铁吸引住，而未结合的标记抗体和标本被缓冲液冲走。与此同时电极加压，启动电化学发光反应，使三联吡啶钌和TPA在电极表面进行电子转移，产生电化学发光，光的强度与待测抗原的浓度成正比。

四、光激化学发光免疫分析

光激化学发光免疫分析最初由Ullman等在1994年报道，美国德灵公司研发成功，后由PerkinElmer公司生产相关试剂，西门子公司生产出免疫诊断试剂。

基于非竞争的免疫检测方法类似于ELISA，而基于竞争的免疫检测方法类似于放射免疫分析法。以前者为例，双抗体夹心结构（抗体包被发光珠-抗原-生物素化抗体）与链霉亲和素包被的感光珠，通过链霉亲和素与生物素结合到一起，并拉近发光珠和感光珠的间距。然后，感光珠在680nm激发光的照射下，使周围氧分子激发变成单线态氧，后者扩散至发光珠并传递能量，发光珠发射520～620nm荧光信号并被光子计数器探测。此过程中，单线态氧的半衰期只有4μs，且最大扩散距离大约200nm。一般而言，当体系中不存在抗原抗体复合物时，发光珠和感光珠之间的距离大于200nm。因此，此三级发光系统只有结合态发光珠才能传递单线态氧的能量并发光；非结合态发光珠由于相距较远，无法获得能量而不发光。

光激化学发光技术应用广泛，涵盖蛋白质、多肽激素、核苷酸检测等领域，在受体/配体、蛋白质/蛋白质、蛋白质/DNA相互作用方面的研究成果，对发病机制的研究和新药研发具有重要指导意义。

五、均相酶免疫测定技术

酶扩大免疫测定技术是最早取得实际应用的均相酶免疫测定方法，由美国Syva公司研究成功并定名的。我国已成功运用此项技术研发出甘胆酸测定试剂盒、治疗药物监测系列试剂盒、激素检验系列试剂盒等多种可用于临床检验的产品。

此法主要检测小分子抗原或半抗原，在药物测定中应用较多。均相酶免疫测定是将半抗原或小分子抗原如药物、激素、毒品、兴奋剂等与酶结合制成酶标记物，酶与抗原（半抗原）结合后仍保留酶和抗原（半抗原）的活性。是集合“抗原和抗体”及“酶和底物”两种系统优点于一身的国际领先的临床检验新技术。

测定时将待测样品、酶标记物、特异性抗体和底物溶液加在一起，待抗原-抗体和酶底物反应平衡后，即可直接测定结果，无须分离步骤，整个检测过程都在均匀的液相内进行。依据实验原理可分为竞争结合法和非竞争结合法两种类型。

六、上转换发光技术

上转换发光技术（up-converting phosphor technology，UPT）利用UCP颗粒（稀土离子）荧光材料，吸收较低能量长波红外光，发射高能量短波可见光实现能量转换，称反Stokes效应。上转换发光材料（upconversionphosphor，UCP）是无机基质及镶嵌在其中的稀土掺杂离子构成的晶体合成材料，具有与一般荧光颗粒不同的独特上转发光现象，即“低能光激发、高能光发射”。UCP颗粒标记物具有无背景、无淬灭、可定量等显著优势，可实现高灵敏、特异、稳定的现场定量检测。

军事医学科学院、北京某生物技术有限公司、中国科学院为主体的多学科交叉研究团队，研制出纳米（10～20nm）尺度高发光效率UCP颗粒，已拥有获得国家认可的上转换发光免疫分析仪以及十余种即时检测急需的系列配套试剂。上转换发光技术已应用于床旁快速检测、生物活体成像、荧光标记肿瘤靶向成像、生物反恐现场检测、食品安全检测等领域。