第十节 酶分析技术

酶分析技术是一种常用的临床生物化学检验技术，其应用主要有两个方面：第一，以酶为分析对象，根据需要对体液中的酶和同工酶的含量或酶活性进行测定，称为酶分析法；第二，利用酶的特点，以酶作为分析工具或分析试剂，用于测定体液样品中用一般化学方法难以检测的物质，如底物、辅酶、抑制剂和激动剂（活化剂）或辅助因子等的含量。

一、酶活性浓度测定

酶活性（enzyme activity）是指酶催化特定化学反应的能力，可用在一定条件下其所催化某一化学反应的速度表示。酶活性单位可用来表示酶活性的大小。

（一）酶活性单位

酶活性单位，或称酶单位（enzyme unit）是指在最适条件下，使酶反应达到某一速度所需要的酶量。酶单位常有三种表示方法。

1.惯用单位

20世纪60年代以前，各种酶活性的表示法的定义没有统一标准，不同的酶、甚至同一种酶采用不同的测定方法都有不同的定义。如丙氨酸氨基转移酶测定时的金氏法、赖氏法，磷酸酶的布氏法、金-阿二式法、皮-劳二氏法的定义均不相同，因此参考区间也不一致，容易造成混乱，目前基本上已经淘汰。

2.国际单位

1963年国际生化协会通过广泛讨论，提出一个国际单位定义来表示酶量的多少，即1min能转化1μmol底物的酶量为一个国际单位（international unit，IU），在临床检验中常以U表示。

3.Katal单位

在国际单位制中，规定酶活性单位为开特（Katal，Kat），即1s中转化1mol底物的酶量。Kat对体液中酶量而言显然过大，常用单位为nkat。

在我国不论实验室还是临床医师都习惯使用U/L，如报告使用kat/L，最好同时注明相应的U/L。上述国际单位和kat单位间关系如下：

1U=1μmol·min-1=16.67nmol·s-1=16.67nkat

（二）酶活性浓度单位及计算

1.酶活性浓度单位表示法

临床上测定的一般不是酶的绝对量而是活性浓度，酶活性浓度以每单位体积所含的酶活性单位数表示。在临床化学中，各国学者几乎都习惯用U/L来表示体液中酶催化浓度。

2.正常上限升高倍数表示酶活性浓度

酶催化活性或活性浓度是一个相对的概念，与测定方法及测定条件有关，表2-8所示是临床常用血清酶的测定方法与参考区间。不同的测定方法，酶活性的结果可以相差数倍，以至各实验室之间的测定结果难以比较，参考值也难以统一，给临床医生带来不少麻烦。

为了更直观地反映酶含量的变化，很多实验室不局限传统的报告方式（U/L），而开始使用正常上限升高倍数（upper limits of normal，ULN）这一表示方法作为酶活性浓度的表示法。所谓ULN是指把酶测定值转换为正常上限值的倍数。简单地说，就是用测得的酶活性结果除以参考范围的上限值。由于酶学测定中，一般以酶增加的异常较多，故不取正常下限值作为倍数指数。如将ULN进一步适当分级，还可制定出轻度、中度及极度增加的范围。在目前尚缺乏统一的校正品或标准、测定方法也不能完全统一的前提下，使用ULN有一定的好处，但对其临床意义应重新进行评价。

3.酶活性浓度单位的计算

可根据所测定的酶所用方法的不同，利用标准管法、标准曲线法或摩尔吸光系数法进行计算求取酶活性浓度单位。前两种方法目前已较少使用。

用连续监测法进行酶活性测定时，不需作标准管或标准曲线，根据摩尔吸光系数很容易进行酶活性浓度的计算。摩尔吸光系数（ε）的定义为：在特定条件下，一定波长的光通过光径为1.00cm、所含吸光物质的浓度为1.00mol/L时的吸光度。如用连续监测法测定在线性范围内每分钟吸光度的变化ΔA/min），以U/L表示酶活性浓度时，则可按下式进行计算：

式中：V.反应体系体积（mL）；ε.摩尔吸光系数（cm2/mol）；v.样品量（mL）；L.比色杯光径（cm）；ΔA.吸光度变化；106.将mol换算成μmol

（三）酶活性测定

1.酶促反应的时间进程

酶活性的大小是通过测定酶促反应过程中单位时间内底物的减少量或产物的生成量，即测定酶促反应的速率来获得的。如将酶促反应过程中的底物或产物变化量对时间作图，可以得到酶促反应时间进程曲线（图2-36）。图中底物S或产物P浓度变化的曲线的斜率就代表酶反应速度。

在大多数酶反应的初期，底物常处于过量，［S］或［P］的变化量一般随反应时间而线性增加，即单位时间内［S］或［P］的变化量或反应速度是恒定的，这段时间称为0级反应期；随着反应时间的延长，底物不断消耗，使酶不能被其饱和，［S］或［P］的变化曲线会趋于平坦，即反应速度下降，这段时间被称为Ⅰ级反应期。反应速度与底物浓度成正比。因此，在Ⅰ级反应期所得到的反应速度并不能代表酶的真正活性，真正代表酶催化活性的是反应初阶段（0级反应期）的速度，即反应的初速度。此时，反应速度与酶浓度［E］之间有线性关系，这也是检验酶反应和酶检测系统是否适宜、正确的标准。

2.酶活性测定方法

根据酶促反应时间进程曲线可知，酶活性的测定应该符合两个原则，一是在0级反应期进行测定；二是反应速度与酶量成线性关系。

（1）定时法（fixed time assay）：

又称两点法，是通过测定酶反应开始后某一时间内（t₁到t₂）产物或底物浓度的总变化量来求取酶反应初速度的方法。

此法的优点是简单，因最后检测时反应已被终止，故检测仪器无需保温装置，显色剂的选择也可不考虑其对酶活性的影响。缺点是如果不用预试验确定，无法了解酶作用的这段时间是否都是0级反应。

（2）连续监测法（continuous monitoring assay）：

是连续测定酶反应过程中某一反应产物或底物的浓度随时间变化的多点数据，求出酶反应初速度，间接计算酶活性浓度的方法。又称动力学法或速率法。其优点是能确保反应在0级反应进行测定，因此测定结果准确，是目前最常用的方法。缺点是仪器必须有保温装置，如果利用显色反应，加入的显色剂或酶试剂对酶活性应该没影响。连续监测法分直接法和间接法两类。

直接法：这类方法是在不终止酶促反应条件下，直接通过测定反应体系中底物或产物理化特性的变化如吸光度、荧光、旋光性、pH、电导率、黏度等，计算出酶活性浓度。直接法虽然简单，但只有底物与产物在理化性质等方面有显著差异时，才能使用直接法。故至今也只有很少一部分酶能用直接法进行测定。

间接法：在酶活性测定时，如果底物或产物不能直接测定或难于准确测定，可采用酶偶联法测定，即在反应体系中加入一个或几个工具酶，将待测酶生成的某一产物转化为新的可直接测定的产物，当加入酶的反应速度与待测酶反应速度达到平衡时，可以用指示酶的反应速度来代表待测酶的活性。

工具酶根据其作用不同可分为辅助酶和指示酶。辅助酶在酶偶联反应中可以一个或多个，也可以不需要；指示酶是指能监测反应速度的酶。临床酶学分析中，以NAD（P）H/NAD（P）+为辅酶的脱氢酶和以H₂O₂为底物的过氧化物酶（POD）是最常用的指示酶。

最简单的酶偶联反应（单底物反应且只有一个工具酶）模式为：

被测定酶（Ex）催化的反应称为始发反应；产生被检测物质产物C（如NADH）的反应称为指示反应，相应的偶联酶（第二个酶）称指示酶（Ei）。

如果一些酶促反应找不到合适的指示酶与其直接偶联，此时往往还可在始发反应和指示反应之间加入另一种酶，将二者连接起来，此反应称为辅助反应。模式为：

用酶偶联法测定酶活性浓度时，并不是一开始反应就全部反映了测定酶活性。这是因为偶联反应存在三个时相：一是延滞期（lag phase），加入底物启动反应，在启动后的一段短时间内，产物B开始出现并逐渐增加，但仍处于较低水平，指示酶反应速度也较低，不能代表待测酶的反应速率（V_x）；二是线性期（linear phase），随着产物B增加到一定程度时，E_x和E_i催化的反应速率相同，此阶段在特定波长处（如340nm）吸光度会有明显的线性变化，一般在此时相测定酶活性；最后是非线性期（non linear phase），由于底物消耗，反应速度又复减慢。

在酶偶联测定法中，指示酶的用量是一个重要的问题。最简单的方法是根据V_x/（K_m）x=V_i/（K_m）i的比值来选择指示酶的用量V_i，式中V_x为测定酶的测定上限，（K_m）x和（K_m）i分别是测定酶和指示酶的米氏常数。

另一种方法是根据米-曼氏方程进行计算。在酶偶联反应中，指示酶催化反应速率V_i的计算公式为：

式中V_x为测定酶的测定上限，（K_m）i为指示酶的米氏常数，P为中间产物浓度。

（3）平衡法：

通过测定酶反应开始至反应达到平衡时产物或底物浓度变化量来求出酶活性的方法。此法无需终止反应，但是反应平衡时往往不在0级反应期，因此平衡法只在0级反应期很短的酶促反应，用定时法或连续监测法很难测出其初速度时采用。

（四）酶活性测定的标准化

临床酶活性测定的样品几乎都是体液，如血液、尿液等。酶活性受诸多因素的影响，如样品的处理（如溶血、抗凝剂、样品的存储与稀释等）、测定条件（如温度、pH、底物浓度、激活剂、抑制剂等）、所用仪器与试剂的差异等。为了提高酶测定实验的准确性和精密度，使酶测定结果有可比性，消除参考区间的混乱，以利于临床应用，开展酶测定的标准化工作势在必行。

1.标准化途径

通过使用推荐方法和参考方法，以及使用公认的酶校准物或酶参考物等，使酶学测定标准化。

（1）使用推荐方法和参考方法：

IFCC于1979年首先发表测定人血清（血浆）中酶催化浓度方法总则。以后相继提出了一些酶的推荐方法。这些推荐方法的使用，使各实验室间对同一种酶的测定结果具有可比性、可互换性。但这些推荐方法原以手工测定为基础，不适应自动化分析仪器的要求。我国也于1994年发表了《测定人血清（血浆）中酶催化浓度方法总则》，并于1995年、1996年相继通过了ALT、γ-GT、CK、LD、ALP、AST等6项推荐方法草案。卫生行业标准《临床酶活性浓度测定方法总则》（编号WS/T222-2002）也已批准实施。

（2）使用公认的酶校准物或酶参考物：

酶测定中最理想的校准方法是用稳定的、定值准确的酶校准物或酶参考物对测定全过程进行校准。虽然早在1989年IFCC已提出了一个关于酶测定参考物的文件（草案），但由于酶不易制成纯品，又不稳定，且提纯酶与血清酶反应性不一定相似，所以此校准方法长期未解决。近年来这方面进展很大，各种动物源性（如猪）、人源性酶制品，特别是源于基因工程的酶制品相继研制成功。

2.酶活性浓度测定的参考系统

IFCC于1998年决定建立包括下列要素的测定酶催化浓度的参考系统：①参考测定方法，以现有的IFCC 30℃的参考方法作为基础，制定了一套37℃的标准操作方法（SOPs）；②参考实验室网络，选择一组参考实验室（包括厂家实验室），为之提供必要的技术和仪器，使之在计量学高水平上按参考测定方法（SOPs）进行测定；③参考物，参考实验室网络对现有的BCR参考物进行重新认证。

（1）建立原级参考方法：

在酶活性浓度测定中所使用的不同层次的方法（原级和次级参考方法、实验室常规方法、厂家选用方法）应具有相似的分析特性，测定系统的微小变化都有可能引起测定结果的持久性改变。

（2）制备原级参考物：

原级参考物最重要的特性是基质效应（matrix effect）无或者很小（可忽略不计），或者说是否有可交换性。应该用参考方法或常规测定方法对一系列相关的人类（常规）标本进行比较和评估。

（3）建立参考实验室网络：

参加网络的实验室最好是已根据ISO 17025的标准通过校准或检测实验室认可，或者至少已准备进行实验室认可；应定期接受网络组织者的检查；定期参加网络组织者的室间比对活动。参加网络的实验室应是动态的，如多次通不过室间比对，或不接受定期检查，以及由于各种原因，都可随时退出。

二、酶质量浓度的测定

酶是有催化活性的蛋白质，通常用活性浓度来表示其催化能力。但实际上它是一个蛋白质，因此可以用酶质量浓度（enzyme mass concentration）表示其量的多少，质量单位多以ng/mL、μg/L来表示。临床上大多数情况下是用活性浓度来表示酶的浓度，但是在有些情况下，用质量浓度表示酶浓度更有临床意义。另外，采用高灵敏度的检测方法，还可检测到一些以前不易测定的酶，为临床提供了更多新的信息和资料。

（一）测定方法

本质上说，凡是能定量测定蛋白质的方法都可用于酶的定量测定。但是在临床检测中，目前常用免疫化学方法来测定酶质量浓度。利用酶蛋白的抗原性，制备特异性抗体，然后以免疫学方法测定酶蛋白质量。

1.放射免疫测定（RIA）

分为直接法与间接法。直接法是将放射性核素标记的酶分子与相应抗体作用产生沉淀，然后将沉淀分离并进行定量测定。

2.其他免疫方法

主要有免疫抑制法、化学发光免疫测定（CLIA）、酶免疫测定（EIA）、荧光酶免疫测定（FEIA）等。

与传统的酶活性测定法相比，免疫化学测定法的优点主要有：①灵敏度高，能测定样品中用原有其他方法不易测出的少量或痕量酶；②特异性高，几乎不受体液中其他物质，如酶抑制剂、激活剂等的影响；③能用于一些不表现酶活性的酶蛋白，如各种酶原或去辅基酶蛋白，或因遗传变异而导致合成无活性的酶蛋白的酶测定；④特别适用于同工酶的测定。

酶的免疫化学测定也有其局限性，主要表现在：①要制备足够量的提纯酶作为抗原和具有免疫化学性质的抗血清常常是很困难的，且工作量较大；②测定步骤多，操作烦琐；③测定成本高。

（二）临床应用

1.酶质量浓度比酶活性浓度更能反映疾病状况

如CK-MB酶活性是以（U/L）为检测单位，反映心肌细胞损伤的一个检测指标，但由于目前该项目测定方法本身的局限，偶尔会产生测定结果的假性升高。在脑部疾病、脑手术等产生脑组织损伤或肿瘤患者等常出现CK-MB酶活性测定结果失真。CK-MB质量浓度（CK-MBmass）以ng/mL为检测单位，其特异性和敏感性都高于CK-MB酶活性测定，目前是国际和国内心血管学会所推荐的方法。临床上可采用自动发光免疫分析法测定CK-MB质量浓度。

2.胰蛋白酶等消化酶

在血液中常存在其抑制剂，影响其活性浓度测定，因此常用免疫化学方法测定其酶质量浓度。

三、同工酶和亚型的测定

同工酶是指催化相同化学反应，但酶蛋白的分子结构、理化性质乃至免疫学性质不同的一组酶。根据国际生化学会的建议，同工酶是由不同基因编码的多肽链，或由同一基因转录生成的不同mRNA所翻译的不同多肽链组成的蛋白质。同工酶存在于同一种属或同一个体的不同组织或同一细胞的不同亚细胞结构中，它使不同的组织、器官和不同的亚细胞结构具有不同的代谢特征，这为同工酶用来诊断不同器官的疾病提供了理论依据。

由于同工酶（或亚型）一级结构不同，其在理化性质、催化性质、生物学特性等方面有明显的差异，这些差异为同工酶（或亚型）的分析和鉴定提供了理论基础（表2-9）。临床同工酶（或亚型）的分析大致可分为两步，即首先精确地分离出某酶的各同工酶（或亚型）组分，然后测定酶的总活性和各同工酶（或亚型）组分的活性。

（一）电泳法

同工酶氨基酸组成不同，等电点不同，电泳迁移率也就不同，据此可用电泳法分离鉴定。常用于分离同工酶的电泳法有醋酸纤维素薄膜电泳、琼脂糖凝胶电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳等。以LD同工酶为例，它是由H亚基和M亚基组成四聚体。H亚基含酸性氨基酸比M亚基多，在pH8.6的碱性缓冲溶液中带负电荷较多，电泳速度比M亚基快，电泳结束时由正极向负极依次有LD₁、LD₂、LD₃、LD₄、LD₅五条同工酶条带。电泳结束后，可用含乳酸、NAD+、酚嗪二甲酯硫酸盐（PMS）和氯化硝基四氮唑蓝（NBT）的染色液将区带染色，染色原理为：LD催化乳酸脱氢，脱下的氢由NAD+传递给PMS，再由PMS传递给NBT，NBT还原为紫红色的化合物而使区带染色。染色后洗脱支持介质背景染料，用光密度扫描仪扫描区带，或将区带切下洗脱比色测定。

电泳法简便、快速、分离效果良好，并且一般不会破坏酶的天然状态，是研究同工酶最为广泛的方法。电泳分离后区带显色是电泳法的关键步骤之一。

用电泳法进行同工酶分析时，当显示的区带数与同工酶数不一致时，要特别注意巨分子酶的存在。巨分子酶形成的原因主要有：①酶与免疫球蛋白形成复合物，如CK-BB-IgG、CK-MM-IgA、LD-IgA等；②酶与其他蛋白质形成复合物，如LD-β-脂蛋白等；③酶亚基或酶分子之间形成聚合物，如CK-Mt聚合物、LD亚基自身聚合等。现已有关于CK、LD、AST、AMY、γ-GT和ALP等巨分子酶的报道。如，将可疑血清进行琼脂糖凝胶电泳结合荧光染色扫描分析，发现巨CK₁位于CK-MM与CK-MB之间，巨CK₂位于CK-MM的阴极侧。

（二）层析法

离子交换层析和亲和层析等常用于同工酶的提纯与制备，也可用于临床同工酶常规检测。同工酶分子带电量不同是离子交换层析法分离的基础，常用的离子交换剂有二乙氨基乙基纤维素（DEAE-C）、二乙氨基乙基葡聚糖A-50（DEAE-sephadex A-50）、二乙二羟丙氨乙基葡聚糖A-50（QAE-sephadex A-50）等。亲和层析也常用于同工酶的分析，如根据同工酶免疫学特性不同，可以将其抗体结合于葡聚糖凝胶或琼脂糖凝胶上作为固定相，用亲和层析法加以分离；根据同工酶底物专一性不同，亦可以将底物结合于葡聚糖凝胶或琼脂糖凝胶上作为固定相，用亲和层析法加以分离。如应用阴离子交换层析结合免疫化学法进行CK亚型分析，应用麦胚凝集素（WGA）亲和层析法测定骨ALP等。

（三）免疫分析法

由于同工酶的一级结构不同，因而免疫化学性质也不同。利用纯化的同工酶免疫动物制备特异性的抗血清，此抗体只与该同工酶产生特异性免疫反应。因此，抗原决定簇不同的同工酶可用特异的免疫反应来识别。应用较多的免疫分析法有免疫抑制法、免疫沉淀法和免疫化学分析等。

（四）同工酶的其他分析方法

1.底物专一性分析法

不同的同工酶底物专一性不同，K_m值也不同，如果同工酶之间K_m差别足够大，可通过测定其K_m值加以鉴定。如胞质AST（s-AST）K_m为5.07mmol/L，而线粒体AST（m-AST）K_m仅为0.7mmol/L。

2.选择性抑制法

利用同工酶各亚型对抑制剂敏感程度不同，或同一抑制剂对不同同工酶有不同的抑制作用。如前列腺释放的酸性磷酸酶（ACP）受L-酒石酸的抑制，而由破骨细胞、红细胞等释放的ACP则不受L-酒石酸抑制。待测标本在不含L-酒石酸反应体系中测定，可得总ACP活性；在含L-酒石酸基质中测定，得到破骨细胞、红细胞型ACP，而总活性与后者之差则为前列腺ACP活性。

3.pH分析法

不同同工酶可有不同的最适pH，如同工酶之间最适pH差别足够大，可通过调节缓冲液pH，使待测同工酶维持完整活性的同时，其他同工酶活性受到抑制。

4.热失活分析法

利用不同同工酶的耐热性不同进行分析与鉴定。如将可疑血清在45℃置20min，测定CK活性，发现CK-BB和CK-MB几乎完全失活，而CK-MM不受影响。

四、酶法分析技术

（一）代谢物浓度的酶法测定技术

由于酶作用的特异性，成分复杂的血清等体液样品往往不需进行预处理，通过温和的酶促反应条件、简单的实验程序，即可对各种代谢物浓度进行定量分析。这类代谢物浓度的酶法测定通常分为平衡法（equilibrium method）和动力学法（kinetic method）两大类，已有许多工具酶被应用到各种代谢物检测试剂盒的制备及临床标本的自动化分析之中。

1.平衡法

在代谢物酶促反应中，随着时间的延续，待测物浓度逐渐减少而产物逐渐增多，一定时间后反应趋于平衡，测定反应达到平衡后待测物（底物）或产物变化的总量，即平衡法（又称终点法）。代谢物酶促终点法测定的基本条件是：①待测物浓度［S］应远小于其米氏常数K_m，此时任何时刻的反应速率V=V_max［S］/K_m，呈一级反应；②反应配方中所用酶量（V）应足够大，而K_m应小，以保证有较快的反应速度完成测定。

（1）直接法：

如果待测物与产物在理化性质上有可直接进行检测的差异，如吸收光谱不同，则可直接测定待测物或产物本身信号的改变来进行定量分析，这是最简单的代谢物浓度测定方法。

（2）酶偶联法：

如果酶促反应的底物或产物无可直接检测的成分，则可将反应某一产物偶联到另一个酶促反应中，而达到检测的目的，即为酶偶联法。一般把第一步反应称为辅助反应，所用工具酶叫辅助酶，偶联的反应称为指示反应，指示反应所用的工具酶叫指示酶。如血浆葡萄糖测定的氧化酶法（GOD法）和己糖激酶法（HK法）等。偶联反应应设计为非限速反应，即偶联反应中所用酶、辅酶等底物用量应过量，在指示酶用量固定后，指示反应的速度是恒定的，不影响“表观”速度，为“零级反应”；辅助反应设定为一级反应，如果辅助反应为双底物，在实验设计时也应将试剂中加的另一种底物浓度设计得相当大。此时，整个反应只受待测物浓度的影响。

酶循环法（enzymatic cycling methods）采用两类工具酶进行循环催化反应，使被测物放大扩增，从而使检测灵敏度提高。目前临床上已应用于总胆汁酸的测定。胆汁酸在3α-羟基类固醇脱氢酶作用下生成3α-酮类固醇，同时将硫代-NAD变为其还原形式（硫代-NADH）；生成的3α-酮类固醇与NADH又在3α-羟基类固醇脱氢酶作用下，生成胆汁酸和NAD+，如此循环从而放大微量胆汁酸的量，在一定的反应时间内，生成的硫代-NADH（405nm）的量与样品中胆汁酸的量成正比，测定405nm吸光度的改变即可计算胆汁酸的含量。

终点法测定的实验设计中，主要应考虑以下问题：①工具酶的特异性：因为酶作用具有特异性，所以复杂的生物样品不经分离就可以对其中特定成分进行定量检测，而不受其他物质的干扰。在酶促反应中，要求指示酶要有更高特异性，这样测定所受的干扰会更小。②K_m大小要合适：在保证测定线性的前提下，K_m要尽量小。③酶的用量：终点法测定代谢物的酶用量要足够大，以保证反应能在临床化学检验可接受的较短的时间内（一般为1~3min）达到终点。④工具酶中的杂酶应低于允许限。⑤反应平衡点：反应应朝正反应方向进行，反应体系中所用底物对酶应构成“零级反应”。如果反应的平衡常数太低，为使反应朝正反应方向进行，主要有增加底物浓度、偶联反应移去生成物、改变反应pH等方法（如乳酸测定）。⑥附加剂：试剂中的附加剂（如稳定剂、防腐剂、赋形剂）加入后，应不抑制酶的活性，不影响试剂的稳定性，不与底物和体液中的物质作用。和其他测定方法学一样，酶法测定还要考虑到试剂的稳定性、均一性，测定的准确性、精密度。

2.动力学法

根据米氏方程，当［S］<< K_m，一般［S］/K_m < 0.2，最好< 0.05，［S］+K_m≈ K_m，此时呈一级反应，反应初速度V=k［S］。如果能准确测定反应的初速度（V），采用标准浓度对照法即可求得待测物的浓度。实际上，准确测定反应的初速度是很困难的。由于反应呈一级或伪一级，故在t₂-t₁时间内吸光度的变化与所测物质浓度成正比。实际操作中，测定两个固定时间的吸光度差值，只要此期间待测物消耗< 5%，就可以采用标准浓度对照法计算样本浓度，所以动力学法有时又称为定时法。应用自动生化分析仪能很容易完成这项工作。

（二）酶免疫测定

酶免疫测定（enzyme immunoassay，EIA）是以酶标记抗原或抗体作为示踪物，由高活性的酶催化底物显色或发光，达到定量分析的目的。用于EIA的标记酶有过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、尿素酶、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、葡萄糖氧化酶、苹果酸脱氢酶等，至今有二十多种酶被应用于EIA，但应用最多的是辣根过氧化物酶和碱性磷酸酶。此部分内容详见“免疫化学分析”。

（三）固定化酶

为了简化操作过程，并使酶试剂得以方便或反复使用，已有许多研究将水溶性的酶通过吸附、包埋、载体共价结合或通过酶分子间共价交联等方法固定在支持物上，并保持其原有的活性，这样制备的酶称为固定化酶（immobilized enzymes）。近些年来，固定化酶技术发展迅速，特别是固定化酶膜的应用使临床生化检验进入了干化学的时代，一些测定变得更加方便、快速。酶电极、酶探针等也在不断研制开发中，相信此类技术将成为临床生化发展的一个新方向。

（徐克前）