第九节 电化学分析技术和传感器

传感器（transducer/sensor）是接收信号或刺激并产生反应的器件，能将待测物理量或化学量转换成另一对应输出的装置，可以用于物质成分的分析、自动化控制等多种领域。常见的有光敏传感器（视觉）、声敏传感器（听觉）、气敏传感器（嗅觉）、化学传感器（味觉）、压敏、温敏、流体传感器（触觉）。与临床检测相关的是化学传感器，电化学分析是一类重要的化学传感技术，而生物传感器是一类特殊的化学传感器。

一、电化学分析

溶液的电化学性质是指电解质溶液通电时，其电位、电流、电导和电量等电化学特性随化学组分和浓度而变化的性质。电化学分析法（electrochemical analysis）是建立在溶液电化学性质基础上并利用这些性质，通过电极这个变换器，将被测物质的浓度转变成电学参数而进行检测的方法。根据所测量的电参数的不同，电化学分析法分为电导法、电位法、电解法、库仑法、伏安与极谱法等。与临床生化检验相关的主要是电位分析法、溶出伏安法、安培分析法、电导分析法、库仑分析法等。

（一）电位分析法

电位分析法（potentiometry）是利用电极电位与化学电池电解质溶液中某种组分浓度的对应关系，而实现定量测定的电化学分析法。主要通过电化学电极实现测定，临床生化检验中常用的电极有离子选择性电极、氧化还原电极和PCO₂电极。

1.离子选择性电极

离子选择性电极（ion selective electrode，ISE），又称离子电极，是一类利用膜电位测定溶液中离子活度或浓度的电化学传感器。它采用的是膜电极（membrane electrode），仅对溶液中特定离子有选择性响应，把被测离子的活度表现为电极电位。在一定离子强度时，活度又可转换为浓度，而实现分析测定。离子选择电极的构造主要包括：①电极腔体，由玻璃或高分子聚合物材料做成；②内参比电极，通常为Ag/AgCl电极；③内参比溶液，由氯化物及响应离子的强电解质溶液组成；④敏感膜，是对离子具有高选择性的响应膜（图2-26）。根据膜组成的差异可分为两类：一类是玻璃膜电极（glass membrane electrode），通过改变玻璃膜的成分可以测定H+、Na+、K+、Li+、Rb+、Cs+、Ag+、Tl+等不同离子，但能用于临床测定的仅有H+和Na+；另一类是聚合物膜电极（polymer membrane electrode），它由特殊敏感膜组成，可以测定临床样本中的H+、Na+、K+、Cl-、Ca2+、Mg2+、Li+、CO₃2-等。

其测定原理是离子选择性电极的电极电位E可用能斯特方程表示，其关系式：

公式中，阳离子选择性电极为+，阴离子选择性电极为-；n为离子电荷数；C_x为被测离子浓度；f_x为被测离子活度系数；K在测量条件恒定时为常数。公式表明，在一定条件下，电极的电极电位与被测离子浓度的对数呈线性关系。

离子选择性电极的E值不能直接测定，必须将离子选择性电极与参比电极浸入被测溶液中组成原电池，通过测定原电池的电动势E，便可求得被测离子的活度或浓度。

一般来说，参比电极通常为负极，离子选择性电极为正极。此时，对阳离子响应的电极，取正号；对阴离子响应的电极，取负号。

2.氧化还原电极

PO₂电极是氧化还原电极，对氧的测量是基于电解氧的原理实现的。目前用得最多的氧电极是电解式Clark氧电极，由铂阴极、Ag/AgCl阳极、KCl电解质和透气膜所构成（图2-27）。待测溶液中的O₂可以借助电极外表面的O₂渗透膜（约20μm的聚丙烯或聚乙烯或聚四氟乙烯），依靠PO₂梯度透过膜而进入电极。在测定时，O₂在铂阴极表面发生的反应如下：

O₂+2 H₂O → 2H₂O₂

H₂O₂+2 e-→ 2 OH-

当阴极表面附近的氧被消耗后，阴极表面氧分压（PO₂）为0.00kPa/mmHg，此时样品中的氧将通过渗透膜向阴极发生浓度扩散。当氧浓度扩散梯度相对稳定时，就产生一个稳定的电解电流，称之为极限扩散电流I₀。极限扩散电流I₀与样本中的PO₂成正比。通过测定电流变化即可测定血液标本中的氧气分压。

3.PCO₂电极

PCO₂电极是气敏电极（gas sensing electrode），是由pH玻璃电极和银-氯化银电极组装在一起的复合电极。复合电极装入有机玻璃筒中，塑料套上有气体渗透膜，内装PCO₂电极外缓冲液，它的pH值可因血液的PCO₂而改变。待测溶液中的pH变化与IgPCO₂有线性关系，因此，可由pH电极测得的pH值变化量计算出PCO₂。

（二）溶出伏安法

溶出伏安法（stripping voltammetry）实质上是电解法和极谱法相结合的一种电化学分析法，由Jaroslav Heyrovsky发明，并获得1959年诺贝尔化学奖。它包括两个过程：首先在一定的电压下，将被测物质电解沉积在工作电极上，这个过程称为“电解富集”。然后，改变电极的极性，进行电位扫描，使沉积在工作电极上的被测物质溶出，这个过程称为“溶出过程”。在此过程中，电流随电位变化的关系图称为“溶出伏安图”。溶出伏安图中的峰值电流是定量的依据，而峰值电位是定性的依据。

溶出伏安法分为阳极溶出伏安法和阴极溶出伏安法。阳极溶出伏安法（anodic stripping voltammetry，ASV）预先在恒定的电位（相当于该离子的阴极上产生极限电流的电位）下将被测物富集在电极上，然后使微电极的电位由负向正的方向移动，富集的物质反向溶出（阳极溶出），并通过伏安曲线进行测定的方法。阳极溶出伏安法的工作电极有悬汞电极、汞膜电极和固体电极。常用于金属离子的检测，临床上常用于微量元素的测定。

例如在盐酸介质中测定痕量铜、铅、镉时，首先将悬汞电极的电位固定在-0.8V，电解一定的时间，此时溶液中的一部分Cu2+、Pb2+、Cd2+在电极上还原，并生成汞齐，富集在悬汞滴上。电解完毕后，使悬汞电极的电位均匀地由负向正变化，首先达到可以使镉汞齐氧化的电位，这时，由于镉的氧化，产生氧化电流。当电位继续变正时，由于电极表面层中的镉已被氧化得差不多了，而电极内部的镉又还来不及扩散出来，所以电流就迅速减小，这样就形成了峰状的溶出伏安曲线。同样，当悬汞电极的电位继续变正，达到铅汞齐和铜汞齐的氧化电位时，也得到相应的溶出峰。（图2-28）

阴极溶出伏安法（cathodic stripping votammetry）是利用阴极溶出反应，将被测离子在预电解的阳极过程中形成一层难溶化合物，然后当工作电极向负的方向扫描时，这一难溶化合物被还原而产生还原电流的峰。阴极溶出伏安法可用于卤素、硫、钨酸根等阴离子的测定。

溶出伏安法的全部过程都可以在普通极谱仪上进行，也可与单扫描极谱法和脉冲极谱法结合使用。其方法灵敏度很高，特别是阳极溶出伏安法，其灵敏度可达10-12mol/L。主要原因是由于工作电极的表面积很小，通过电解富集，使得电极表面汞齐中金属的浓度相当大，起了浓缩的作用，所以溶出时产生的电流也就很大。

（三）安培分析法

安培分析法（amperometric analysis）是一种电化学检测技术，是用于测量电活性物质在工作电极表面发生氧化或还原反应时产生电流变化的技术。其主要优点是灵敏度高、选择性好、响应范围宽及结构简单。安培分析法有3种电极，它们分别是工作电极、参比电极和对电极。电化学反应发生在工作电极上，但反应的前提是需要在工作电极与参比电极之间施加一个适当的电位（电压）。根据施加电位方式的不同，安培分析法可分为恒电位安培分析法（constant potential amperometric analysis，CPAA）、脉冲安培分析法（pulsed amperometric analysis，PAA）和积分脉冲安培分析法（integrated pulsed amperometric analysis，IPAA）。

恒电位安培分析法是将一个恒定的直流电位连续地施加于检测池的电极上，当待测物被氧化时，电子从待测物转移至电极，得到电流信号。在此过程中，电极本身为惰性，不参与氧化反应。恒电位安培检测法具有较高的灵敏度，可以测定皮摩尔级的无机和有机离子，如与环境有关的阴离子、硫化物、氰化物、砷、卤素等。

脉冲安培分析法在实验中使用三阶电位E₁、E₂和E₃，每个电位需要相应的持续时间t₁、t₂和t₃，见图2-29。E₁是工作电位，在该电位下测量待测物的氧化电流；E₂为比E₁高的氧化清洗电位，用于完全氧化电极表面，使吸附的反应产物脱离电极；E₃为比E₁负得多的还原清洗电位，使贵金属电极表面还原为金属本身。三电位连续自动循环。工作电位E₁下的时间t₁由延迟时间和积分时间两部分组成。由电位E₃到E₁的脉冲过程中，会引起电极P溶液界面的充电电流，因此，施加脉冲电位产生的电流是由电极表面的充电电流和分析物的氧化电流两部分组成，而前者是必须扣除的。在检测时，延迟一定时间检测，此时，充电电流迅速衰减为零，所测电流仅为分析物氧化电流。延迟时间一般为12s，足以使充电电流衰减为零。

脉冲安培检测法可用于糖、糖醇、醛、醇、脂肪胺和氨基糖等的检测。糖类化合物的pKa值为12~14，在强碱性介质中以阴离子形式存在，可以用阴离子交换色谱分离。由于糖的分离是在碱性条件下完成的，检测方法必须与此相匹配。用金电极的脉冲安培检测法正好满足此条件。金电极的表面可作为糖的电化学氧化反应环境。用脉冲安培检测法可检测pmol~fmol级的糖，而且不需要衍生反应和复杂的样品纯化过程。

积分脉冲安培分析法是另一种新形式的脉冲安培检测法，于1989年由Welch等首先提出，并运用此技术，用金电极实现了对氨基酸的检测。用安培法检测氨基酸时，通常采用金工作电极、Ag/AgCl（或玻璃-Ag/AgCl）参比电极和钛对电极。在pH12~13溶液中，于金工作电极和Ag/AgCl参比电极之间施加一个较高的电位，氨基酸在金电极表面被氧化为亚胺，然后大多数亚胺进一步氧化为腈基化合物，另外少量的亚胺则发生水解生成醛类化合物。由于在金电极上得到使氨基氧化的最大氧化电流所需的电位已超过金表面被氧化的电位，因此，在这么高的电位下，金电极本身形成了表面氧化层和氨基酸氧化产物的附着，使得金电极会很快失效。此外，金电极表面氧化时所产生的电流无疑会增加背景、基线噪声以及基线的不稳定性。为了使得到氨基氧化时所产生的检测信号，抑制金电极氧化所产生的背景信号，Welch等引入了积分脉冲安培分析法。与脉冲安培分析法相似，积分脉冲安培分析法中加到工作电极上的也是一种自动重复的电位对时间的脉冲电位波形（图2-30）。其不同之处是：脉冲安培分析法是对每次脉冲前的单电位下产生的电流积分，而积分脉冲安培分析法是对每次脉冲前循环方波或三角波电位下产生的电流积分，即是对电极被氧化形成氧化物和氧化物还原为其初始状态的一个循环电位扫描过程中产生的电流积分。由积分整个高-低采样电位下的电流所得到的信号仅仅是被分析物产生的信号。在没有待测物（可氧化物）存在时，静电荷为零。积分脉冲安培分析法的优点在于通过施加方波或三角波电位消除氧化物形成和还原过程中产生的电流。正、反脉冲方向的积分有效扣除了电极氧化产生的背景效应，使得那些可受金属氧化物催化氧化的分子产生较强的检测信号和获得稳定的检测基线成为现实。

临床上测定血液中PO₂采用了安培分析技术。此外在液相分析、毛细管电泳分析的检测器中也采用了安培分析技术。图2-31为HPLC的电化学检测器工作原理。

（四）电导分析法

电解质溶液能导电，而且当溶液中离子浓度发生变化时，其电导也随之而改变。通过测定溶液的电导而求得溶液中电解质浓度的方法称为电导分析法（conductometric analysis）。

电导分析法及应用：

（1）直接电导法（direct conductance method）：

直接根据溶液的电导与被测离子浓度的关系来进行分析的方法。主要应用于水质纯度的鉴定、一氧化碳、二氧化碳等的监测。

（2）电导滴定（conductometric titration）：

根据滴定过程中溶液电导的变化来确定滴定终点。在滴定过程中，滴定剂与溶液中的被测离子生成水、沉淀或难解离的化合物，使溶液的电导发生变化，而在计量点时滴定曲线上出现转折点，指示滴定终点。一般用于酸碱滴定和沉淀滴定。

（3）高频分析法：

其独有的优点包括①电极不直接与试液接触，避免电解和电极极化现象。适用于沉淀滴定，也可用于一般金属离子（铜、锌、铝、铁等）的EDTA配合的滴定。②能测定电容变化，非水溶剂中的滴定分析。③对于介电常数相差甚远的两组分混合物的分析，高频滴定法能得到比较理想的结果。

临床测定血液中的各种细胞的分类检测常用电导分析法。

（五）库仑分析法

电解分析（electrolytic analysis）是经典的电化学分析方法。电解分析包括两个方面的内容：一是应用外加直流电源电解试液，电解后直接称量电极上析出物质的质量的分析方法，称为电重量法（electrolytic gravimetry）；二是将电解分析用于物质的分离，则称为电解分离法（electrolytic separation）。库仑分析法（coulometric analysis）是在电解分析法的基础上发展起来的。它是根据电解过程中消耗的电量求得被测物质的含量。电重量法及库仑分析法，均建立在法拉第电解定律基础上。电重量法和库仑分析法的共同特点是：分析时不需要基准物质和标准溶液，它们是一种绝对分析方法，并且准确度极高。电重量法只能用来测定高含量物质，而库仑分析法特别适用于微量、痕量成分的测定。

法拉第电解定律指出，电流通过电解质溶液时，发生电解反应的物质的量与通过的电量成正比。电解过程中析出或溶解1g当量任何物质，需要消耗96 487C的电量，仪器通过测量析出或溶解某物质消耗的电量，显示出待测物质的量。

式中：Q代表通过电解质的总电流

A/Z代表原子量A与原子价Z的比值

m代表在电极上析出（或溶解）的物质的质量

F代表法拉第常数，96 475库仑/摩尔

临床上氯离子的测定，就可以采用库仑分析法。其原理是在稳定的电流下，银离子从银电极释放出，与样品中的氯离子结合生产氯化银沉淀。此时由另一对指示电极感应到过量的银离子，使指示电极的电流突然增高，激活继电器，使计时器自动关闭而停止滴定。这个时间段的长短与样品中氯离子浓度成正比，由此可以计算出氯离子的浓度。

库仑分析法是测定血清/血浆中氯离子的“金标准”。

二、传感器

（一）光化学传感器

光化学传感器（photochemical sensor）是利用敏感层与被测物质相互作用前后物理、化学性质的改变而引起的传播光特性的变化检测物质的一类传感器。光化学传感器与其他原理的传感器相比，具有安全性好、可远距离检测、分辨力高、工作温度低、耗用功率低、可连续实时监控、易转换成电信号等优点。随着光纤技术及光集成技术的迅猛发展，光化学传感器在生物医学检测分析领域应用广泛。

光纤化学传感器（optical fiber chemical sensor）又称光极（optrode），是在一根单臂或双臂光纤上的适当位置，安装一个固定化试剂相的薄膜，作为敏感元件，用于提取与各种化学量和生物量有关的光信息，再通过光的波导作用进行检测。按照光信息的种类，可分为吸收（或反射）、荧光、磷光、化学发光、拉曼和红外等六种传感器。

光极可用于pH、血气分析和电解质的测定。与临床目前常用的离子选择电极法相比，其优点是微型化、低干扰、高稳定性，而且不需参比电极。

下面以基于荧光淬灭的光极氧传感器测定血液中PO₂为例说明其原理。这种氧传感器具有许多独特的优点，包括不耗氧、无须参比电极、没有电磁场的干扰等。光极氧传感器克服了Winkler滴定分析法和Clark电化学探头法的不足，已成为在线监测血液中氧分压的重要方法。血液中的氧与光纤探头接触时，引起化学传感膜荧光强度的减弱，这一现象可由Stern-Volmer方程定量表达：

F₀/F=1+kPO₂

式中：F₀与F分别为体系在无氧和有氧状态下测得的荧光强度，k称为Stern-Volmer常数，PO₂为氧分压。Stern-Volmer方程式表明，F₀/F与PO₂呈线性关系。

基于荧光猝灭的光极氧传感膜，通常由荧光分子探针、固相支持剂和增塑稳定剂组成（图2-32）。增加分子探针的量将有助于提高响应的灵敏度，但过高会导致荧光的自熄灭。适当减少支持剂的用量，降低膜的厚度，可增加膜的通透性，缩短响应时间。

（二）生物传感器

生物传感器（biosensor）是一类特殊的化学传感器，它是由固定化的生物敏感材料作识别元件（包括酶、抗体、抗原、微生物、细胞、组织、核酸等生物活性物质）、适当的理化换能器（如氧电极、光敏管、场效应管、压电晶体等）及信号放大装置构成的分析工具或系统。生物传感器主要由识别元件和换能器组成。

1.分类

主要有下面三种分类命名方式，三种分类方法之间实际互相交叉使用。

（1）根据生物传感器中分子识别元件即敏感元件的不同可分为五类，它们分别是酶传感器（enzymesensor）、微生物传感器（microbialsensor）、细胞传感器（organallsensor）、组织传感器（tissuesensor）和免疫传感器（immunolsensor）。它们所使用的敏感材料依次为酶、微生物、细胞器、动植物组织、抗原或抗体。

（2）根据生物传感器的换能器即信号转换器的不同，可分为生物电极传感器（bioelectrode biosensor）、半导体生物传感器（semiconduct biosensor）、光生物传感器（optical biosensor）、热生物传感器（calorimetric biosensor）、压电晶体生物传感器（piezoelectric biosensor）等，换能器依次为电化学电极、半导体、光电转换器、热敏电阻、压电晶体等。

（3）以被测目标与分子识别元件的相互作用方式进行分类，有亲合型生物传感器（affinity biosensor）和反应型生物传感器（reaction biosensor）。前者如受体与配体、抗原与抗体、DNA探针等，后者主要是酶催化反应。

2.临床生化检验中的应用

酶传感器在临床生化检验中应用最为广泛。它是将酶作为敏感元件，把酶催化反应过程中的物理或化学信号转化为电信号以检测被测物（图2-33）。它是由固定化酶与离子选择电极、气敏电极、氧化还原电极等电化学反应组合而成的生物传感器，因而既具有酶促反应的高效性与专一性，又有电化学反应的响应快、操作简单的特点。酶传感器在临床生化检验中应用广泛，可以检测组织细胞、体液中的糖类、醇类、有机酸、激素、三磷酸腺苷等。

（1）电流型酶传感器：

通过检测酶促反应中发生氧化或还原反应产生的电流信号，来反映被测物质浓度的大小。其基础电极可采用氧电极、过氧化氢电极等，还可采用介体修饰的铂、金、碳等作为基础电极。表2-6为常见的电流型酶传感器。

以葡萄糖酶传感器为例来说明其原理（图2-34）。葡萄糖酶传感器是由葡萄糖氧化酶膜和电化学电极组成。当葡萄糖溶液与酶膜接触时，葡萄糖氧化酶催化下列反应：

葡萄糖+2H₂O+O₂ →葡萄糖酸+2H₂O₂

依据反应中消耗的氧、生成的葡萄糖酸和过氧化氢的量，分别可用氧电极、pH电极和铂电极来测定葡萄糖的含量。Clark氧电极和pH电极测定的最低检测限分别是10-4mol/L和10-3mol/L。而利用酶促反应产物H₂O₂扩散到铂电极上时，加一定的外电压，H₂O₂被氧化，放出电子产生电流：

H₂O₂ → O₂+2H++2e

此时，铂电极为阳极，铂电极的电位相对于Ag/AgCl电极为0.6V。H₂O₂产生的分解电流与葡萄糖的浓度成正比。该法的本底电流小、灵敏度高，其最低检测限为10-8mol/L。其他如胆固醇酶传感器、乳酸酶传感器也是用同样的原理设计的。

（2）电位型酶传感器：

将酶促反应所引起的物质量的变化转变为电位信号输出，电位信号的大小与底物浓度的对数值呈线性关系。采用的基础电极有pH电极、CO₂、NH₃等气敏电极。表2-7为常见的电位型酶传感器。

体液中的尿素的检测可采用电位型酶传感器，其原理如图2-35。

（3）光纤光学型酶传感器：

亦称光极酶传感器。这类传感器利用酶的高选择性，待测物质（相应酶的底物）从样品溶液中扩散到生物催化层，在固定化酶的催化下生成一种待检测的物质。当底物扩散速度与催化产物生成速度达到平衡时，即可得到一个稳定的光信号。信号的大小与底物浓度成正比。

利用固定化酯酶或脂肪酶制成生物催化层进行分子识别，再通过产物的光吸收对底物进行传感。如碱性磷酸酶催化下列反应：

对硝基苯磷酸酯+H₂O →对硝基苯酚+磷酸

测量在404nm波长时光吸收的变化，即可确定对硝基苯磷酸酯的含量，体液中的许多酯类和脂肪类物质均可采用类似的传感器进行检测。

还有一种在临床检测中最有应用价值的检测NADH光纤光学型酶传感器，是基于脱氢酶进行分子识别。例如乳酸脱氢酶催化下列反应：

乳酸+NAD+→丙酮酸+NADH+H+

在生物催化层中生成的NADH可用荧光法直接进行检测。生成NADH也可利用耦合的黄素单核苷酸（FMN）生物发光反应，通过光导纤维进行传感。在此传感器中，用固定化的谷氨酸脱氢酶、NADH、FMN氧化还原酶和荧光素酶制成混合生物催化层。在酶的作用下，被测底物（如青霉素G、胆固醇、苏氨酸、谷氨酸、尿酸等）的浓度是酶层微环境中H+、O₂、NH₃、CO₂或H₂O₂浓度的函数，它们的含量变化可被光导纤维传感层中相应的pH、O₂、NH₃、CO₂或H₂O₂的光极所检测。

（徐克前）