第十一节 免疫化学技术

免疫化学技术（immunochemical technique）亦称免疫分析（immunoassay），是基于抗原抗体结合的原理对特定的生物化学物质所进行的定性或定量分析技术。

一、抗原抗体反应

抗原抗体反应（antigen-antibody reaction）是抗原和对应抗体在一定条件下特异结合形成可逆性抗原-抗体复合物的过程。

（一）反应机制

抗体都是蛋白质（免疫球蛋白）。多数抗原也是蛋白质，少数为多糖、类脂、核酸等物质。抗原-抗体是免疫球蛋白分子上的抗原结合簇与抗原分子上的抗原决定簇相互吸引以及多种分子间的作用力参与发生的，主要有范德华力、疏水作用、库仑吸引力和氢键。这种反应没有化学键的形成。

一定的酸碱度下，抗原和抗体在以水为分散介质的胶体中，其分子中的极性基（如羧基、氨基、肽基等）发生电离而使胶体粒子带电荷，同种粒子所带电荷相同，彼此互相排斥。这些极性基团与水有很强的亲和力，使胶体粒子外围构成水层成为亲水胶体，因而胶体粒子能均匀地分布在溶液中。如果抗原-抗体发生特异性结合，就不能与周围水分子结合，而构成疏水胶体。疏水胶体在溶液中的稳定性取决于胶体离子的表面电荷。若在溶液中加入一定量的电解质，则可中和胶体离子表面上的电荷，促使粒子相互吸引而出现凝集反应或沉淀反应等。

（二）反应特点

抗原抗体反应具有三个特点：高度的特异性；反应是可逆的，这一反应是分子表面的结合，虽然相当稳定，但因抗原-抗体本身未受到破坏，它们仍可分离；此外，抗原分子与抗体分子的结合有一定的比例。一般来说，抗原是多价的，抗体是双价的，因而一个抗体分子可结合两个抗原分子，而一个抗原分子可结合多个抗体。所以，在比例适合时它们可形成高度交联的抗原-抗体大分子复合物，沉淀下降。抗体过多或抗原过多，都不能形成高度交联的抗原-抗体大分子复合物，不产生沉淀或沉淀很少。

抗原-抗体反应可分为两个阶段。第一阶段为抗原与抗体的特异性结合阶段。这一阶段使亲水系统变为疏水系统，反应很快，几秒钟至几分钟即可完成，但无可见反应。第二阶段为抗原与抗体反应的可见阶段，出现凝集、沉淀、补体结合等反应。这一阶段的反应比较慢，需要几分钟至几十分钟，并受电解质、温度、酸碱度等因素的影响。

（三）沉淀反应

可溶性抗原与抗体结合，形成不溶性的、可以看见的沉淀物的过程。利用沉淀反应，形成各种有关抗原、抗体的定性或定量方法。只有合适的抗原与抗体的比例才会形成沉淀（图2-37）。同相应抗体比较，抗原的分子小，单位体积内含有的抗原量多，做定量试验时，为了不使抗原过剩，应稀释抗原，并以抗原的稀释度作为沉淀反应的效价。

除了抗原抗体的比例外，一些化学因素如离子的种类和离子强度等也影响抗原抗体的结合。例如有些阳离子会抑制抗体与带正电荷的半抗原的结合，其抑制作用由大到小依次是Cs+、Rb+、、K+、Na+、Li+，带负电荷的半抗原与抗体的结合，受有些阴离子的抑制，其抑制作用由大到小依次是CNS-、、I-、Br-、Cl-、F-。另外，右旋糖苷、聚乙二醇等可加快抗原抗体的结合反应。

根据沉淀反应中使用的介质和检测方法的不同，可分为液体内沉淀反应和凝胶内沉淀反应。液体内沉淀反应又分为絮状沉淀试验、免疫浊度测定和环状沉淀试验。凝胶内沉淀反应包括单向免疫扩散试验和双向免疫扩散试验。

二、免疫定性分析方法

免疫化学技术用于定性分析主要有免疫扩散、免疫电泳和免疫印迹。

（一）免疫扩散试验

以适当浓度的凝胶（如琼脂糖）作为介质，利用可溶性抗原和抗体在凝胶中扩散，形成浓度梯度，在抗原与抗体比例适当的位置出现可见的沉淀环或沉淀线，可以用于检测特定抗原或抗体。它是一种被动扩散，抗原或抗体与支持介质没有分子作用。抗原抗体在均匀介质中的扩散符合菲克定律，在单位时间内通过垂直于扩散方向的单位截面积的扩散物质流量（用J表示）与该截面处的浓度梯度（dc/dx）成正比，也就是说，浓度梯度越大，扩散通量越大。其方程式为（式中D代表扩散系数）：

1.单向免疫扩散（single immunodiffusion）

又称单向辐射状免疫扩散（single radial immunodiffusion，SRID）。它是将一定量的抗体混于琼脂凝胶中制成琼脂板，在适当位置打孔后将抗原加入孔中扩散，抗原在扩散过程中与板中抗体相遇，形成以抗原孔为中心的沉淀环。沉淀环的大小与抗原量成正比。

2.双向免疫扩散（double immunodiffusion）

在支持介质上打孔分别加入抗原和抗体，抗原和抗体分子在凝胶板上扩散，二者相遇并达到最适比例时形成沉淀线。此法可用于抗原或抗体的定性分析，也可用于纯度鉴定和免疫血清抗体效价测定。

（二）免疫电泳

免疫电泳（immunoelectrophoresis）是将琼脂电泳和双向琼脂扩散结合起来，用于分析抗原组成的一种定性方法。随着实验技术的发展，在经典免疫电泳的基础上又发展了对流免疫电泳、火箭免疫电泳、交叉电泳、免疫荧光技术等多种技术和方法。

1.经典免疫电泳

先将抗原加到琼脂板的小孔内进行电泳，然后在琼脂板中央挖一横槽，加入已知相应的免疫血清，两者经一定时间相互扩散后，就会在抗原、抗体最适比例处形成沉淀弧。根据沉淀弧的数量、位置和外形，参照已知抗原、抗体形成的电泳图，即可分析样品中所含成分。此方法样品用量少、特异性高、分辨力强。但所分析的物质必须有抗原性，而且抗血清必须含所有的抗体组分。此法可用于抗原、抗体的纯度检测，抗体各组分的研究等。

2.免疫固定电泳（immunofixation electrophoresis,IFE）

一种用于分析样品中特异性抗原的技术。即将蛋白质混合物在固相载体上进行区带电泳，再与特异性抗体反应，从而检出与抗体结合的相应抗原。免疫固定电泳技术包括琼脂凝胶蛋白电泳和免疫沉淀两个过程。

免疫固定电泳最常用于M蛋白的鉴定。方法是：①先将患者血清或血浆在醋酸纤维膜或琼脂上做区带电泳（6孔），根据血清蛋白质的电荷不同将其分开；②将IgG、IgA、IgM、κ轻链和λ轻链的抗血清加于分离的蛋白质泳道上，参考泳道（SP）加抗正常人全血清用于区带对照；③作用一定时间后，洗去游离蛋白质，待干燥后用氨基黑染色；④结果判新，M蛋白被固定，形成窄而致密的沉淀带（图2-38）。

本法可用于鉴定迁移率近似的蛋白和M蛋白、免疫球蛋白轻链、尿液和脑脊液等微量蛋白、游离轻链、补体裂解产物等。免疫固定电泳最大的优势是分辨率强，敏感度高，操作周期短，仅需数小时，结果易于分析，目前已作为常规检测。

3.火箭免疫电泳（rocket immunoelectrophoresis,RIEP）

抗原在含有定量抗体的琼脂糖中泳动，两者比例适宜时，在较短时间内生成锥形的沉淀峰。在一定浓度范围内，沉淀峰的高度与抗原含量成正比（图2-39）。RIEP可半定量检测血清中某一蛋白质的含量（如AFP、IgG、C3等）、粪便中α1-抗胰蛋白酶，诊断蛋白质丢失性肠病。

4.交叉电泳（crossed electrophoresis）

是将区带电泳和火箭免疫电泳相结合的免疫电泳分析技术。首先抗原样品在琼脂糖中进行电泳分离，然后在与原泳动方向呈垂直的方向泳向含抗体的琼脂糖凝胶中，因此相对应的抗原抗体依次形成若干锥形沉淀线。免疫电泳是一种有效的抗原蛋白定量技术，可一次同时对多种抗原定量。分辨率较高，有利于各种蛋白组分的比较，对于蛋白质遗传多态性、微小异质性、蛋白质裂解产物和不正常片段等进行定性分析。

5.对流免疫电泳（counter immunoelectrophoresis,CIE）

多数蛋白质抗原在碱性缓冲液（pH8.6）中带负电荷，在电泳时从负极向正极移动。抗体在碱性缓冲液只带微弱的负电荷，且相对分子质量较大，电泳力较小，在琼脂电渗力作用下由正极向负极移动。抗原和抗体定向对流，在两孔间相遇时发生反应，并在比例合适处形成肉眼可见白色沉淀线。图2-40显示采用对流免疫电泳检测脑脊液中乙型流感嗜血杆菌。

（三）免疫印迹

免疫印迹（immunoblotting，IB）又称蛋白质印迹或Western印迹（Western blotting，WB），是将抗原抗体反应与蛋白质显色反应结合起来，通过级联放大效应检测微量蛋白的方法。蛋白质显色方法有以下几种：①放射性核素标记的放射自显影法；②采用荧光素（FITC）标记的底物荧光ECF法；③采用酶（HRP、AKP）和生物素标记的底物生色法。目前常用的是HRP标记抗体，结合化学发光法。

其操作过程是首先抽提组织、细胞或体液中的蛋白质样品，进行SDS-PAGE，再将其转移到膜固相载体上，选择特异性抗体进行抗原抗体反应，接着用化学发光检测。

斑点印迹法（dot blotting）是一种特殊的免疫印迹法。它是将蛋白质抗原样品直接点样到膜固相载体上，然后加入抗体形成抗原抗体反应，利用酶联发光或显色原理将结果显示到膜或底片上，进行抗原检测的方法。

免疫印迹法可用于鉴定蛋白质抗原，检测样品中特异抗原的分布、表达水平。经典的免疫印迹法用于定性和半定量分析，近年来改进后的方法可进行定量分析。

三、免疫定量分析方法

免疫化学技术用于定量分析的主要有标记免疫分析和免疫浊度测定。浊度测定在“光学分析技术”中已经介绍，下面重点介绍标记免疫分析技术。

（一）标记免疫分析分类和原理

标记免疫分析是采用同位素或非同位素标记物标记抗体（或抗原）进行抗原-抗体反应，通过对免疫复合物中的标记物信号强弱的测定，达到对免疫反应进行监测的目的。标记免疫分析存在不同的分类方法。

1.根据其定量原理分类

标记免疫分析可分为竞争性免疫分析和非竞争性免疫分析。

（1）竞争性免疫分析（competitive immunoassay）：

标记抗原与未标记抗原竞争有限量的抗体，反应达到平衡后，形成标记抗原-抗体复合物和非标记抗原-抗体复合物，分离并测定抗原-抗体复合物的标记物信号和游离抗原标记物信号。生成的标记抗原-抗体复合物与非标记抗原的含量在一定的限度内是成反比的，利用这一原理可以测定未标记抗原（即样品中的抗原）。在竞争性分析设计中，标记抗原与抗体的量都是有限的。而且对抗体均一性的要求一般不是太高，重要的是要有高纯度的标记抗原。

（2）非竞争免疫分析（non competitive immunoassay）：

用过量的标记抗体与待测抗原反应，形成抗原-标记抗体复合物，待充分反应后，除去游离的标记抗体，抗原-标记抗体复合物的放射性强度与待测抗原的量成正比。一般是先将待测抗原与过量的标记抗体进行温育，使二者结合，然后加入固相抗原免疫吸附剂再次温育，吸附游离的标记抗体。离心除去沉淀物，测定上清液中的标记信号强度（图2-41）。最经典的是1968年Miles和Hales建立了利用核素标记的抗体检测抗原的放射分析法，为了与放射免疫测定区别，故称免疫放射分析技术（immunoradiometric assay，IRMA）。

2.根据标记物的性质分类

标记免疫分析可分为同位素标记免疫分析和非同位素标记免疫分析。

（1）同位素标记免疫分析（isotope-labeled immunoassay）：

一种以放射性同位素为标记物的体外免疫分析方法，目前可测定的生物活性物质已达300种以上，已广泛应用于医学生物学和临床诊断。常用的放射性核素有125I、131I、14C等，标记的原理是放射性同位素取代分子中酪氨酸或酪胺残基及组胺残基上的氢原子。

（2）非同位素标记免疫分析（nonisotope-labeled immunoassay）：

用酶、化学发光剂、荧光素、金属等物质进行标记的免疫分析技术，目前在临床应用非常广泛。

3.根据分析过程中是否需要分离过程分类

标记免疫分析可分为非均相免疫分析和均相免疫分析两大类。

（1）非均相免疫分析（heterogeneous immunoassy）：

需对结合和游离的标记物进行分离，才能测定各自的浓度。

（2）均相免疫分析（homogeneous immunoassy）：

在抗原-抗体反应达到平衡时，对结合与游离的标记物无需进行分离，可在自动生化分析仪器上直接测定。

免疫反应本身是一种均相反应，但是标记免疫技术往往是非均相分析技术。因此载体技术的引入可以将发生反应的抗原抗体和未发生反应的抗原抗体进行有效地区分。微孔板是最早采用的载体，此外还有膜、磁珠、胶乳等。载体的作用主要是分离作用以及加速和放大反应作用。

（二）临床常用的标记免疫分析方法

临床采用的标记免疫分析方法很多，不同的方法分析的敏感性存在差异（表2-10）。在临床检验中，可根据检测项目的不同选择合适的方法，达到既能满足临床需要，又能节省检验费用的目的。

1.放射免疫测定（radioimmunoassay, RIA）

根据抗原抗体特异性结合的原理，以放射性同位素标记抗原或抗体，根据射线的多少定性或定量测定待检标本中抗体或抗原的量。

2.酶免疫测定（enzyme immunoassay, EIA）

以酶标记抗体或抗原的免疫检测方法。它将抗原抗体结合的高特异性与酶促反应的高灵敏度有机结合起来，用酶（如辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶和葡萄糖氧化酶等）标记抗体（抗原），检测待测标本中未知抗原（抗体），当相应的抗原抗体特异性结合后，加入相应的酶的底物，酶可以高效专一催化和分解底物，生成有颜色的产物。根据颜色有无和深浅，可以判断待测标本中有无特异性抗原（抗体）以及量的多少。酶免疫测定可以定性、定量，是一种敏感、特异、简便、只需一般光谱分析仪器的微量测定技术。临床常用的有酶联免疫吸附试验、酶增强免疫分析技术、克隆酶供体免疫分析。

（1）酶联免疫吸附试验（enzyme linked immunosorbent assay, ELISA）：

指将可溶性的抗原或抗体吸附到聚苯乙烯等固相载体上，进行免疫反应的定性和定量方法。

（2）酶增强免疫分析技术（enzyme-multiplied imm unoassay technique, EMIT）：

基本原理是半抗原与酶结合成酶标半抗原，保留半抗原和酶的活性。当酶标半抗原与抗体结合后，所标的酶与抗体密切接触，使酶的活性中心受到影响而活性被抑制。反应后酶活力大小与标本中的半抗原量呈一定的比例，从酶活力的测定结果就可推算出标本中半抗原的量（图2-42）。此法不需要分离过程，是典型的均相免疫分析，特别适合药物、代谢物和激素等小分子物质的自动化检测。

（3）克隆酶供体免疫分析（cloned enzyme donor immunoassay, CEDIA）：

DNA重组技术可分别合成某种功能酶（如β-D半乳糖苷酶）分子的两个片段，大片段称为酶受体（enzyme acceptor，EA），小分子称作酶供体（enzyme donor，ED），两者单独均无酶活性，一定条件下结合形成四聚体方具酶活性。利用这两个片段的特性建立的均相酶免疫测定称为克隆酶供体免疫测定（图2-43）。

克隆酶供体免疫测定（CDEIA）的反应模式为竞争法，测定原理为：标本中的抗原和酶供体（ED）标记的抗原与特异性抗体竞争结合，形成两种抗原抗体复合物。ED标记的抗原与抗体结合后由于空间位阻，不再能与酶受体（EA）结合，而游离的ED标记的抗原上的ED可和EA结合，形成具有活性的酶。加入底物测定酶活性，酶活力的大小与标本中抗原含量成正比。CEDIA主要用于药物和小分子物质的测定。

3.免疫荧光分析

以荧光素标记抗体或抗原作为标记物的免疫分析技术，其原理与ELISA相似。一般以镧系元素作为荧光标记物，用荧光仪检测荧光现象或测量荧光强度。该法既可对液体中的抗原和抗体定量，也可对组织切片中的抗原、抗体进行定性和定量。样品、试剂的自身荧光、激发光的散射、本底荧光等会影响测定的灵敏度。

（1）时间分辨免疫荧光分析法：

以稀土元素，常用的是能发射离子荧光的铕（Eu）、铽（Tb）、钐（Sm）和镝（Dy）四种元素，标记蛋白质、多肽、激素、抗体、核酸探针或生物活性细胞，稀土元素在紫外光的激发下，可产生持续一定时间、一定光峰的荧光。当体系反应发生后，用特别的TRF仪测定最后产物中荧光强度，根据荧光强度或相对荧光强度比值来判断反应体系中被分析物质的浓度，达到定量分析的目的。时间分辨荧光分析法具有灵敏度高、稳定性高等优点。

（2）荧光偏振免疫分析（fluorescent polarization immunoassay, FPIA）：

其基本原理是荧光物质经单一平面的蓝偏振光（485nm）照射后，吸收光能跃入激发态，随后回复至基态，并发出单一平面的偏振荧光（525nm）。偏振荧光的强弱程度与荧光分子的大小呈正相关，与其受激发时转动的速度呈反相关。

反应系统内除待测抗原外，同时加入一定量用荧光素标记的小分子抗原，使二者与有限量的特异性大分子抗体竞争结合。当待测抗原浓度高时，经过竞争反应，大部分抗体被其结合，而荧光素标记的抗原多呈游离的小分子状态。由于其分子小，在液相中转动速度较快，测量到的荧光偏振程度也较低。反之，如果待测抗原浓度低时，大部分荧光素标记抗原与抗体结合，形成大分子的抗原抗体复合物，此时检测到的荧光偏振程度也较高。荧光偏振程度与待测抗原浓度成反比（图2-44）。

FPIA最适宜检测小至中等分子物质，常用于药物、激素的测定。

4.化学发光免疫分析（chemiluminescence immunoassay, CLIA）

将具有高灵敏度的化学发光测定与高特异性的免疫反应相结合的分析技术。化学发光免疫分析包含两个部分，即免疫反应系统和化学发光分析系统。免疫分析系统是将化学发光物质或酶作为标记物，直接标记在抗原或抗体上，经过抗原与抗体反应形成抗原-抗体免疫复合物。化学发光分析系统是在免疫反应结束后，利用发光信号测量仪检测发光物质的光强度，根据化学发光物与发光强度的关系，可计算出被测物的含量。

用于各种抗原、半抗原、抗体、激素、酶、脂肪酸、维生素和药物等的检测。

（1）化学发光免疫分析（chemiluminescence immunoassay, CLIA）：

采用直接化学发光剂。它们不需酶的催化作用，只需改变溶液的pH等条件就能发光的物质，如鲁米诺、异鲁米诺、鲁米诺衍生物或吖啶盐类化合物（光泽精）等。目前，临床生化检验中通常用新型发光剂如吖啶盐类化合物直接标记抗原或者抗体进行分析测定，形成化学发光免疫分析。

（2）化学发光酶免疫测定（chemiluminescence enzyme immunoassay, CLEIA）：

采用酶促反应的发光底物。它们是指经酶的降解作用而发出光的一类发光底物。目前化学发光酶免疫测定中常用的酶有辣根过氧化物酶（HRP）和碱性磷酸酶（AP）。HRP的发光底物为鲁米诺或其衍生物和对-羟基苯乙酸。AP的发光底物为3-（2-螺旋金刚烷）-4-甲氧基-4-甲基-4-（3-磷酸氧基）-苯基-1，2-二氧乙烷（AMPPD）和4-甲基伞形酮磷酸盐（4-MUP，荧光底物）。临床检测中，常用HRP或AP标记抗原或抗体，由此构建成化学发光酶免疫测定。

（3）电化学发光分析（electrochemiluminescence immunoassay, ECLIA）：

指由电化学反应引起的化学发光过程。在电极上施加一定的电压或电流时，电极上发生电化学反应。在电极反应产物之间，或电极反应产物与溶液中某种组分之间发生化学反应而产生激发态，当激发态返回到基态时产生发光现象。

目前，在实际应用中的电化学发光体系主要是钌联吡啶［Ru（bpy）₃］2+体系。它可以通过活化“手臂”实现与蛋白的连接。这种标记物非常稳定，且由于分子量小（~1 000Da），可实现一分子蛋白标记多个［Ru（bpy）₃］。［Ru（bpy）₃］2+电化学发光过程如图2-45所示：

［Ru（bpy）₃］2+和三丙胺（TPrA）分别在阳极表面氧化成［Ru（bpy）₃］3+和TPrA 阳离子自由基（TPrA*+），（TPrA*+）迅速脱去一质子形成三丙胺自由基TPrA*，TPrA*具有还原性，从而把［Ru（bpy）₃］3+还原为激发态的［Ru（bpy）₃］2+*；后者发射一个620nm的光子回到基态，再参与下一次电化学发光。只需0.01ms就可发出稳定的光，300ms达到最高峰，每秒几十万次的循环电化学发光大大提高了测定分析的灵敏度。

临床上常用的电化学发光免疫分析法是用三联吡啶钌标记抗原或抗体，通过抗原抗体反应和磁颗粒分离技术，根据三联吡啶钌在电极上发出的光强度的大小对抗体或抗原进行定量分析的方法。

（徐克前）