中篇　结核病基础

第一章　结核病分子流行病学

【摘要】国内对结核病分子流行病学的研究以局部地区流行的结核分枝杆菌传播情况进行研究为主，采用MIRU-VNTR基因分型技术、单核苷酸多态性（SNP）、熔解曲线间隔区寡核苷酸分型法（McSpoligotyping）、间隔区寡核苷酸分型方法（Spoligotyping）等几种常见的分型方法对结核分枝杆菌进行基因分型及传播链的分析。另外MIRU-VNTR同源性鉴定技术可应用于聚集性群体结核病分子流行病学调查的常规监测和应急检测；全基因组测序进行基因组聚类分析和现场流行病学调查，结合现场流行病学调查可确定耐多药结核病患者的传播模式和耐药谱。而全基因组数据分析平台结核分枝杆菌全基因组序列分析平台（sequence analysis of mycobacterium tuberculosis，SAM-TB）的建立使得构建基于结核分枝杆菌WGS的全国结核病耐药和传播监测数据库成为可能。

【关键词】结核分枝杆菌；分子流行病；耐药；传播；监测

分子流行病学是阐明疾病和健康状态相关的生物标志或分子事件在人群和生物群体中分布及其影响因素，并研究仿制疾病、促进健康的策略与措施的科学。在结核病领域，分子流行病学主要用于结核病传播范围的确定、传播途径的判断与传染源追溯、区别内源性复发、外源性再感染、近期传播及耐药菌的传播流行等。本文对2021年国内结核病分子流行病学主要的研究进展进行总结。

一、结核分枝杆菌的分子流行病学

谢丽等［1］应用可变数目串联重复序列（variable-number tandem repeat，VNTR）基因分型技术对学校结核病的流行情况进行监测，了解2018年深圳市学校结核病临床分离株的基因多态性及近期传播情况。研究采用聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）对12个MIRU-VNTR位点进行检测。检测结果采用MIRU-VNTR在线分析软件和MEGA7.6软件进行基因分型、聚类分析和进化树图绘制。结果显示，2018年深圳市慢性病防治中心共收集63例学校MTB培养阳性菌株，其中有来自学生患者的菌株52例（82.5%），教职工患者菌株11例（17.5%）。学生结核病主要发生在高中/职高（44.23%）和大学（40.38%），而教职工结核病主要发生在幼儿园（54.5%）。63株MTB分为59个基因型，包括56个独特基因型，3个基因簇。其中北京基因型菌株43株（68.3%），非北京基因型17株（27.0%），另有3株（4.8%）未能扩增出条带无法确定是否属于北京基因型。在3所学校内均发现2例患者感染MTB的案例，流行病学调查结果分别判断为独立感染、校内传播和家庭聚集性疫情。2018年深圳市学校结核病临床分离株基因型多样性高，未出现2例以上的聚集性疫情，学校结核疫情的防控状态良好，MIRU-VNTR同源性鉴定技术可应用于聚集性群体结核病分子流行病学调查的常规监测和应急检测。

中国香港是亚太地区的一个中度结核病负担城市，在过去十年中病例报告呈缓慢下降趋势。通过24位点的MIRU-VNTR基因分型，Lee等［2］检测了从1个月内培养阳性住院结核病患者中收集的534株MTB分离株。该市地理区域有700万人口。结果显示，286（75%）株属于北京基因型，其中216（76%）株和59（21%）株分别属于现代和古代亚系。只有2例为遗传聚类，而没有空间聚类。男性、永久居留权和出生在中国香港或中国大陆与北京基因型相关，北京现代谱系的高流行率与东亚相似，这反映了人口迁移造成的模式。聚集性的缺乏表明，结核病病例中的大多数是由重新激活引起的，有一半患者 ≥ 60岁，并且存在共同疾病的医疗条件，这与观察结果一致。在中等负担地区，重新激活结核病病例占优势，这意味着检测和控制潜在结核病感染将是实现消灭结核病的主要挑战。此研究结果提示，非聚集性结核分枝杆菌分离株可作为评估所有活动性结核病例中再活化疾病患病率的替代物。有必要制定针对老年人、免疫功能低下患者和共病患者包括LTBI筛查在内的干预措施，中等负担地区结核病病例重新激活的优势意味着控制LTBI干预措施的战略发展对于提倡消灭结核病至关重要。

Cui等［3］研究MTB基因组变异在寒冷和炎热地区均匀分布的地区之间的遗传和人口统计学差异以及相互作用。研究对291株MTB进行了全基因组测序，在老年人、低BMI人群和有结核病患者接触史的人群中，炎热地区的北京基因型比例显著高于寒冷地区（炎热地区比例64.63%，寒冷地区比例50.69%，P=0.022）。来自寒冷地区的个体外出旅游的频率较高（P ＜ 0.05）。Rv1186c、Rv3900c、Rv1508c、Rv0210 和一个基因间区域（SNP 位点：3847237）的突变显示在寒冷和炎热之间存在显著差异（P ＜ 0.001）。MDR模型显示年龄组与BMI（交互熵：-3.55%）和Rv0210突变（交互熵：-2.39%）之间存在明显的负交互效应。我们的数据表明，年龄、BMI和Rv0210基因多态性在MTB的传播和发展中具有统计学意义。这些结果为研究MTB的易感基因提供了线索，这些特征的菌株显示了当地的流行情况，对不同地区菌株的基因型监测可作为疫情外溢的预警信号。

Qiu等［4］描述中国东部地区流行的MTB菌株的聚集特征，并确定复发患者的复发率和再感染率。研究在中国江苏省五个城市招募2013年8月至2015年12月痰涂片阳性肺结核患者。根据队列设计，随访患者的治疗结果和复发情况，应用12位点MIRU-VNTR对MTB进行基因分型。对共2 098株MTB进行了聚类分析，结果分为545种基因型和五个分类（Ⅰ类，0.19%；Ⅱ类，0.43%；Ⅲ类，3.34%；Ⅳ类，77.46%；Ⅴ类，18.59%）。调整潜在混杂因素后，北京家系基因型（OR=118.63，95% CI：79.61～176.79，P=0.001）与优势菌株感染显著相关。感染非显性菌株的患者有较高的肺空洞风险（OR=1.39，95% CI：1.01～1.91，P=0.046）。在37例成对复发病例中，22例（59.46%）为内源性再感染，15例（40.54%）为外源性再感染。在江苏省流行的MTB相对单一。北京谱系感染在本地结核病病例中占主导地位，内源性活化似乎是中国东部结核病复发的主要原因。这一发现强调了抗结核治疗结束后病例随访和监测的重要性。

二、耐药结核分枝杆菌的分子流行病学

耐多药结核病（MDR-TB）已成为中国的一个主要公共卫生问题，越来越多的证据表明最近的传播占了MDR-TB的大部分。在此，Han等［5］旨在揭示2010—2015年间上海静安区耐多药结核病暴发的传播模式。研究采用全基因组测序（WGS）进行基因组聚类分析和现场流行病学调查，结合现场流行病学调查确定10例耐多药结核病患者的传播模式和耐药谱。结果表明，10例北京基因型菌株聚集的耐多药结核病患者居住在一个人口稠密的老胡同，有直接或间接接触史。基因组数据分析表明，这10个菌株（不包括耐药突变）的遗传距离为0～20个单核苷酸多态性（SNPs），平均距离为9个SNPs，这表明这10名耐多药结核病患者通过最近的MTB传播感染并发病。遗传分析证实了聚集病例之间的明确流行病学联系。此研究提示，在常规结核病监测中整合基因分型工具可在检测耐多药结核病传播事件中发挥重要作用。基因组分析与流行病学调查相结合可以进一步阐明传播模式。全基因组测序可以整合到密集的病例发现策略中，以确定耐多药结核病的漏诊病例，并帮助阻断传播。

结核病耐药和传播监测能够为公共卫生决策提供重要信息。结核分枝杆菌全基因组测序分析在耐药检测和传播鉴定上比传统表型药物敏感性试验方法和基因分型方法具有更大优势，在发达国家已经应用。全基因组数据分析平台SAM_TB的建立使得构建基于结核分枝杆菌WGS的全国结核病耐药和传播监测数据库成为可能。该平台基于Illumina测序获得的paired-end序列，对结核分枝杆菌样本进行全基因组变异（包括SNP和indel）分析和耐药突变鉴定，可以准确预测菌株对17种抗结核药品（异烟肼、利福平、乙胺丁醇、吡嗪酰胺、乙硫异烟胺、氧氟沙星、莫西沙星、链霉素、卡那霉素、阿米卡星、卷曲霉素、对氨基水杨酸、环丝氨酸、利奈唑胺、氯法齐明、贝达喹啉和德拉马尼等）的耐药性以及对4种一线抗结核药品的敏感性。通过重建系统发育树和计算菌株间SNP距离分析菌株之间的遗传关系，鉴定代表近期传播的簇菌株；还可以鉴定非结核分枝杆菌（nontuberculous mycobacteria，NTM）不同菌种，检测结核分枝杆菌和NTM混合样本。同时，该平台支持样本数据的批量上传、批量分析和分析结果的批量导出，方便国内外同道的使用。随着我国结核病患者的痰培养的比例提高、WGS的成本快速下降，以及SAM-TB测序数据分析平台的建立，在我国建立基于WGS的结核病耐药和传播监测网络已经成为可能。以各省为单位逐步推进结核病耐药和传播监测网络的建设，实现实时监测耐药结核病的变化趋势、追踪结核病的传播与暴发，以提高我国结核病控制水平，刻不容缓。笔者建议目前以省为单位，逐步推进这项工作，最终形成覆盖全国的结核病耐药和传播监测网络［6］。

为了初步了解新疆阿克苏地区耐药结核分枝杆菌基因分型状况及影响耐多药产生的危险因素，为耐多药结核病防治提供有价值的信息，刘丙雨等［7］收集阿克苏地区结核病专科医院（阿克苏第二人民医院）痰涂片阳性的维吾尔族肺结核病患者，从患者痰中分离并培养结核分枝杆菌并进行药物敏感试验，从186例临床分离株中筛选出65株耐药结核分枝杆菌，采用12个多位点数目可变串联重复序列（MIRU-VNTR）进行基因分型，同时应用logistic回归方法分析影响耐多药结核分枝杆菌产生的危险因素。结果显示，65株耐药结核分枝杆菌共产生52种基因型。其中独特基因型40种，余成12簇，每簇2～3株，共25株，成簇百分比38.5%（25/65），成簇率20%，耐多药成簇菌株12株，成簇百分比18.5%，成簇率11.5%。北京型耐多药菌株32株（61.5%），非北京型耐多药菌株20株（38.5%）。经单因素和多因素logistic分析显示，慢性阻塞性肺疾病、复治、治疗中断或失败、肺空洞是MDR-TB产生的独立危险因素。研究发现阿克苏地区耐药结核分枝杆菌存在一定比例的近期传播，影响MDR-TB产生的危险因素有多种，需加强措施减少MDR-TB的产生和传播。

为了研究武汉市MDR-TB分枝杆菌基因型分布及成簇特征，段琼红等［8］采用目标缺失多重 PCR（deletion-targeted multiplex PCR，DTM-PCR）、24 位点 MIRU-VNTR（mycobacterial interspersed repetitive unit-variable number tandem repeat typing）以及耐药基因测序方法，对武汉市149株耐多药结核分枝杆菌进行分子分型，计算Hunter-Gaston分辨指数（Hunter-Gaston discriminatory index，HGDI）、成簇率以及近期感染率最小估计值。结果显示，全部MIRU位点的累积HGDI为0.9944。QUB11b位点的HGDI最高（0.6738）。联合采用DTMPCR以及MIRU-VNTR，共鉴定出111个独立基因型和11个成簇基因型（38株），成簇率为25.5%，近期感染率最小估计为18.12%。经过耐药基因测序进一步分型，各簇内共有17（44.74%）个菌株有相同的突变位点，其余21个菌株突变位点不相同。此研究表明联合采用DTM-PCR、24位点MIRU-VNTR分型和耐药基因测序，其基因分型分辨率较高，适合于武汉地区耐多药结核分枝杆菌的基因分型。武汉市MDR-TB的发生大多由于内源性复燃引起，但仍有一定的近期传播率。

广西是华南地区结核病的高发区之一。确定影响结核病发病率的细菌因素是结束结核病流行的一个步骤。Lin等［9］对广西相对高发区和低发区培养的分枝杆菌进行测序。358例中有347例（96.9%）为结核分枝杆菌感染，所有菌株均属于谱系2和谱系4，只有一株属于谱系1。我们发现MTB的遗传结构在每个县的人口中差异很大。低发病率地区的北京基因型患病率低于其他地区。四个携带mutT4-48的菌株也有mutT2-58突变。这表明，来自现代北京基因型祖先的菌株在广西流行。现代北京系的菌株（OR=2.04）比谱系4更有可能获得耐药性。大多数谱系分化SNPs与细胞壁生物合成途径有关。这些结果为更好地了解华南地区的MTB传播史提供了更高的分辨率。结核病的发病率可能受人口历史形成的细菌种群结构的影响。此研究结果的发现也支持了现代北京基因型MTB起源于华南的假设。

Liu等［10］调查了贵州罗甸地区结核病（TB）的分子流行病学和耐药性特征。罗甸是中国贵州省结核病发病率最高、医疗资源有限的地区。被动病例发现策略用于识别有症状的疑似肺结核，并于2018年5月22日至2019年4月21日登记结核分枝杆菌（MTB）培养阳性的个体。除了3例病例外，所有107例病例均来自9个城镇，其中55.1%来自隆平和边阳。系统发育树显示53.3%的菌株为Lineage2（北京基因型），46.7%为Lineage4。在Lineage2中，66.7%为“现代”北京基因型。共鉴定出7个基因组距离在12个SNPs以内的聚类。聚类包括14个菌株，聚类率为13.1%。聚集病例之间的距离为2.1km和71.0km，平均配对距离为21.8km（四分位间距，2.8～38.0km）。根据与耐药性相关的基因突变，研究预测4.8%的菌株对异烟肼耐药，耐利福平菌株占3.7%，耐链霉素菌株为3.7%；只有一株（0.9%）为MDR。此项研究发现罗甸的耐药率较低，“现代”北京基因型MTB的分支最近在罗甸有所扩张，此研究也可以作为评估贵州省结核分枝杆菌进化和传播的基因组基线。

三、基因分型方法检测

利用基于PCR熔解曲线技术的结核分枝杆菌spoligotyping基因分型方法（McSpoligotyping）对结核分枝杆菌分离株进行基因分型，以评价其在结核病流行病学调查中的应用价值。蓝如束等［11］对广西2017年结核耐药监测点收集的949株结核分枝杆菌，采用McSpoligotyping分型方法对其进行基因分型。通过对其中的361株菌株的McSpoligotyping分型结果与全基因组测序（WGS）结果的一致性比较来评价McSpoligotyping分型方法。其次，对949株菌株分型数据与SITVITWEB数据库进行比对，获取间隔区寡核苷酸国际型别编号，将分型结果提交到https：//www.Miru-vntrplus.org/MIRU/index.faces网站进行聚类分析。结果显示，McSpoligotyping分型与WGS结果一致率为94.18%（340/361），在结果不一致标本中，出现不一致较多间隔序列在第5间隔。在949株菌株中新发现基因型为12l株，已定义基因型为828株；其中已定义基因型共分为84种基因型，主要归属于5种基因家族（BEIJING、T、H、EAI、LAM）和 3 个家系（Lineage1、Lineage2、Lineage4）；5 种基因家族主要流行为BEIJING和T基因家族，家系中主要流行为Lineage2。949株菌株中的822株聚为49个簇（2～528株），最大一簇为BEIJING家族SITl基因型。其余的127株菌表现为独特的基因型。此研究表明利用PCR熔解曲线技术可快速对MTB进行基因分型，此技术较传统方法操作简便、耗时短，对结核病疫情处置及结核病分子流行病学研究具有重要意义。Pan等［12］利用McSpoligotyping分析技术，检测2016—2018年中国沿海城市MTB的流行情况。2016—2018年，福州市结核病定点医院共鉴定出306株结核分枝杆菌。分型结果表明，结核分枝杆菌分为北京家系和非北京家系，分别占45.42%（139/306）和54.58%（167/306）。在非北京家系中，H和T家系是最常见的基因型。306株菌种有47株新的spoligotyping分型值得关注。

有研究表明，间隔区寡核苷酸DNA微阵列杂交方法较传统spoligotyping法操作更简单快速，可以用于结核病溯源和分子流行病学调查研究。杨建伟等［13］将结核分枝杆菌标准株（H37Rv）、卡介苗（BCG）菌株和97株临床结核分枝杆菌的聚合酶链式反应产物分别进行传统spoligotyping和间隔区寡核苷酸DNA微阵列分型，比较2种方法的一致性，并用H37Rv菌株检测间隔区寡核苷酸DNA微阵列法的灵敏度。结果显示结核分枝杆菌标准菌株、BCG菌株和97株临床结核分枝杆菌菌株的间隔区寡核苷酸DNA微阵列分型结果与传统spoligotyping完全一致，符合率为100%；且间隔区寡核苷酸DNA微阵列法有较好的检测效能。此研究指出，间隔区寡核苷酸DNA微阵列法用于结核分枝杆菌分型具有操作简便、快速等特点，适于结核病的溯源和分子流行病学调查。

（梁晨　唐神结）

参考文献

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