第一节　标本采集技术

骨髓检查标本多由临床医师采集。考虑标本质量的保证，以及直面患者了解病情对诊断的需要，专门的骨髓检查科室或血液学检验部门都应熟练地掌握骨髓标本的采集，骨髓标本的采集应成为形态学检验诊断工作的一个构成部分。标本采集包括骨髓穿刺获取骨髓液涂片，骨髓组织的获取制备骨髓印片和组织固定（切片），包括必要时进行骨髓小粒展片、含骨髓小粒的骨髓凝块固定切片（未做骨髓活检时），同时采集外周血涂片。

一、实验室标本采集前准备

（一）为提供患者检查前信息

住院患者通常由临床医师为患者提供检查前的信息。在骨髓穿刺和/或活检取材前，向患者提供有关的信息和指导，并征得患者的同意。同患者谈话的主要内容见表4-1，如让患者知道为什么做骨髓检查，让患者了解怎样做骨髓检查，我们根据患者个体的具体状况该做些什么。门诊患者骨髓检查可由实验室工作者实施。

（二）检查骨髓送检单检查项目

收到临床医师开具的检验送检单，首先检查检验送检单的检查项目，填写内容是否完整，对不符合要求的及时同临床联系要求补充或检查。若对另外需要检查的相关项目，及时提出建议。

（三）确认患者身份、谈话记录和操作部位

询问患者，临床医师是否对（住院）患者进行了骨髓检查前的谈话和/或记录。确认或询问对拟进行的局部用麻醉药品有无过敏史，尤其是欲使用盐酸普鲁卡因注射液者。

确认患者身份极其必要，询问（不是喊叫）患者姓名、年龄等一般信息，仔细核对病案号。对于不能说话或表述的患者，必须通过包括有患者病案号的病历或腕带等进行确认。

检查骨髓检查单上临床选定的穿刺和/或活检的部位。确认即将进行的骨髓穿刺和/或活检的部位，如髂骨（左侧还是右侧）、胸骨还是特定的病变部位。临床医师也会根据患者病情的需要，选定骨髓检查标本采集部位。如进一步了解造血功能时可能会选定胸骨穿刺，髂前上棘和髂后上棘中的一侧病变或疼痛者，会选定病变的或疼痛的一侧穿刺和活检。

（四）评估重危患者生命体征、了解病情并进行可能的检查

对于一般患者，不需要生命体征评估（骨髓穿刺或活检操作前的术前安全检查）。对于重危患者需要做检查前的生命体征评估，或在负责患者的主治医师指导下进行骨髓穿刺和/或骨髓活检。一般，当血压高于160mmHg（1mmHg=0.133kPa），心率大于120次/min，除了重危患者，在其他患者操作中都需要格外慎重。

了解和分析检验单和病历中的信息是骨髓检验全程中非常重要的一环。除了临床医师在送检单上提供的简要病情外，实验室还应视患者的情况，主动地通过询问、查阅和可能的检查，做出进一步补充和了解，复习以前的病情可以增加对疾病发生或发展过程的了解程度。

（五）准备洁净载玻片、登记与编号与组织固定液

推荐载玻片规格为1～1.2mm厚度，25.4mm×76.2mm长宽，一端有磨砂区。骨髓涂片，一般用片8张，初诊急性白血病用片12张，骨髓印片2张和外周血涂片2～4张。

检验送检单按序登记、编号，每张涂片磨砂区写上病名和编号等标识，或用电子打印粘贴纸打印患者姓名、年龄和条形码与编码后粘贴在检查单和标本上。

推荐用2ml尖头或圆头塑料有盖小试管作为骨髓组织固定管，内含1ml Bouin固定液（塑料包埋推荐用固定液），在试管盖上和侧壁有磨砂的写字区写上患者姓名和编号（图4-1），也可用粘贴纸打印贴于一边。首选固定液为Bouin固定液，其试剂由饱和苦味酸水溶液75ml，40%甲醛20ml，冰醋酸5ml组成。该固定液优点为组织穿透力迅速而均匀，引起组织与细胞的收缩较轻，固定后组织着色较好，一般仅需固定30～60分钟（如果组织块较大，可适当延长固定时间至2小时左右）。

（六）取材室消毒和生物安全与美学

每天采集标本前，取材室用紫外线消毒至少一次30分钟。在操作前还需要检查骨髓穿刺和活检的消毒包或一次性穿刺针、活检针是否在有效使用日期内。

患者的血液和骨髓原则上都被视为具有传染性，且目前所用的穿刺针和活检针还有非一次性的，需要防范交叉感染和实验室人员的生物安全措施。除了操作中戴无菌手套外，在接触患者前后，无菌操作前，推制涂片后，操作结束后还需要重视手卫生（规范洗手）。使用过的医疗物品和医疗废物严格按规定处理。在操作室或实验室的恰当位置有放针头等锐器的专用锐器盒和医疗废物箱。

骨髓检查患者病重者较多，且普遍对骨髓穿刺、活检存有惧怕心理，实验室人员在对患者询问病情、解答疑问及穿刺过程中应重视礼仪、言行规范、态度温和，加强情感沟通，树立良好形象，让患者有一种满意、积极、肯定和配合的状态。

（七）患者头昏或晕厥的防范与处理

取材室需要备有抢救车。穿刺室应保持干燥和适宜的温度，湿热密闭的环境加上患者紧张与恐慌是发生头昏、恶心、心悸、面色苍白、四肢发冷、血压降低、脉搏细弱，甚至晕厥的主要原因。一般都发生在穿刺或活检操作后。

1.防范措施

首先是做好防范。措施包括：①在操作前，慎细服务；②操作中动作保持温和轻快；③遇紧张患者，应做好解释，体现关爱，必须让患者平静后做检查；④对重危患者应有一定的思想准备；⑤穿刺室面积和布置需要符合规范。

2.患者发生头昏的处理

当穿刺或活检术操作中或操作后，患者发生头昏时：①如尚在操作立即终止操作；②将患者移到通风处；③嘱患者安静、平卧；④喂饮适量温开水；⑤休息10～15分钟。一般情况下，患者症状会很快好转、消失，必要时适当延长观察。

3.患者发生晕厥的处理

当穿刺或活检术操作中或操作后，患者发生晕厥时：①如尚在操作立即终止操作；②立即让患者平卧；③神志不清患者，立即按压人中，并用应急专线电话通知病房（住院患者）或急诊室（门诊患者）医师；④立即观察生命体征，脉搏、呼吸、心跳、血压是否平稳；⑤心跳呼吸骤停者，立即实施心肺复苏，并进行药物抢救。

二、骨髓穿刺和涂片标本制备

标本采集分为骨髓穿刺和活组织获取，以及涂片、印片制备和组织固定等。除非特别要求和婴儿患者，首次取材首选髂后上棘。此部位最易获取骨髓液和骨髓组织并可减轻患者的忧虑。髂前上棘用于昏迷和病重而不能或不便翻身的患者，以及需要多部位了解造血功能时；胸骨穿刺常被用于髂后、髂前穿刺获取的标本不能解决诊断问题以及需要更多了解造血功能时。死亡患者需做骨髓检查，应在死亡半小时内进行。

（一）髂后上棘骨髓穿刺和涂片

1.穿刺

（1）慎细服务、温和操作：

让患者在诊察床上轻慢躺下，遇严重贫血和病重患者以及易发生骨折的浆细胞骨髓瘤（plasma cell myeloma，PCM）患者应格外注意。遇紧张患者，应做好解释，体现关爱，必须让患者平静后做检查。在骨髓穿刺和活检整个操作中，动作保持温和轻快。

（2）患者体位：

最佳取侧卧位（也可取俯卧位），双膝前屈（常比单腿前屈可获得更佳的局部部位）。让患者配合体位时（尤其对不便语言交流的患者），多运用手语和肢体语言（图4-2）。

（3）穿刺点定位与标记：

取最佳的患者体位后，按患者胖瘦、皮肤紧松、骨盆大小和体型予以估计，并以触摸式定位和标记（图4-3a）。先用两手指触摸髂后上棘的大体方位，用弯曲的示指和拇指触及如图4-3中的a～d时，常会有凹痕感，犹如触摸肿大脾区时的触感，从而可获得明确的穿刺位点，同时在穿刺点上按上“+”指印，或在位点及其邻近皮肤上的某些特点（如色素或痣等）作记号。

遇肥胖而触不到穿刺点者，可选用其他方法予以大体定位：其一为髂后上棘与髂前上棘多在一个水平线上，且常相当于骶骨之骶1～2与腰椎5位置的上下线内；其二是髂后上棘穿刺点，常在腰骶椎旁开5cm处。根据这两个定位线进行定位联合局部推注麻醉液的针感，多可得到准确的穿刺点。骨髓穿刺失败的较常见原因是穿刺点的明显移位。

（4）无菌操作和局部消毒：

严格执行无菌操作，操作者戴口罩和帽子。穿刺点用标准消毒液消毒皮肤两次，消毒范围半径不得小于5cm（图4-3e）。戴无菌手套或消毒手套虽为简单的操作，但不规范时有所见，尤其是初学者。戴手套时操作者身姿稍向前倾，双手往前斜伸，离开诊察床一定距离，又要注意到助手对操作者位置的影响。戴手套动作要稳、手指套入时要准，如果急于套入易发生手指错位。戴好无菌手套后，双手做任何伸展动作均不能像不戴手套时随意，尚不能进行下一步操作时应保持拱手手势位。

（5）铺消毒洞巾：

助手打开穿刺消毒包，取出消毒洞巾，注意折叠的方向（下方剪开的孔巾）和正反面。当洞巾盖于臀部时，持孔巾手指回缩，避免接触患者衣裤，而后用指背将翘起的上方两角抚平和轻压（防止洞巾下滑）或请助手在边角上用胶布粘贴。若为下方开口的洞巾，将开口下方两边紧靠（图4-3f、g）。局部消毒后原则上不能用手触摸穿刺中心位点。

（6）局部推注盐酸利多卡因注射液：

推荐使用2%～4%盐酸利多卡因注射液，若用盐酸普鲁卡因注射液必须有皮肤过敏试验的阴性结果。在注射液瓶颈的标记处用砂轮划上1/3圈，去掉瓶颈，注意手持位置、使力支点和掰拉方向，可避免初学者瓶颈破碎、划伤手指的危险。

右手持2ml或5ml针筒，抽吸盐酸利多卡因注射液后垂直弃去气泡（图4-4a），示指扶持针头接合处，环指扶持针管，中指向里屈曲，使针头孔面尽可能平贴皮肤，另一拇指按皮肤紧松稍做拉动，便于进针和表皮注射（图4-4b）。表皮和骨膜为推注麻醉药液的主要部位，位于两者之间的组织因缺乏神经纤维，通常不推注盐酸利多卡因注射液。同时作骨髓活检者宜适当扩大骨膜面的局麻范围。推注完毕，用一颗消毒棉球轻按片刻，使局麻液弥散（图4-4e）。

（7）穿刺步骤

1）取针：

穿刺针有国产的非一次性和国外产的一次性穿刺针（图4-5）。国外的穿刺针锋利、易于抽吸，活检针的特点是针的顶端稍为细小其后内径稍大而易于把组织块往针管内移动而获得较长的组织条；另一特点是针管长，用于肥胖者有长处。国外产穿刺针和活检针均比国产的锋利，使用后易于引起局部出血，此外成本约是国产的10～20倍。打开或撕开消毒有效期内的穿刺包，取出穿刺针，检查针芯是否卡在槽内（图4-6a）。

2）握针：

用纱布填于手持一端，于右手掌大鱼际处，示指和拇指握住针柄（图4-6a）。

3）分步穿刺而入：

穿刺分两步。先针刺入皮下（图4-6b）。而后，对准预先定位（注意勿移动或牵拉皮肤，避免定位点移位）并触及骨膜面后，手腕以轻、缓、稳的半钻刺式动作，刺入1～1.5cm（图4-6c）。快速地直刺而入易发生偏位，可导致骨髓稀释或抽吸不成功。

4）抽吸：

抽出针芯，立即接上10ml或5ml针筒（图4-6d），左手手指扶持连接穿刺针接口（若用玻璃针筒，谨防接头处断裂）。如果同时需要留取骨髓液标本做细菌培养、流式免疫表型等检查的，应先抽吸骨髓液涂片，而后抽吸骨髓液作为其他标本。

5）推液：

右手抽拉针管，抽吸髓液0.3ml。不碰及预备的载玻片，并以载玻片的垂直方向快速而稍为用力，将髓液推注到载玻片上。也可将骨髓液注射到预备的含5%EDTA-K₂ 50μl的抗凝试管中，送检查室制片。

（8）敷以消毒沙布：

拔出穿刺针，针眼处敷以消毒棉球后覆盖消毒纱布，用左手两指按住，右手揭去洞巾后持纸胶或布胶，两手配合粘贴3条，先中间，后两边，或用医用敷贴（图4-6e～g）。

（9）交代和记录：

穿刺完成后，嘱患者或其家属局部压迫10分钟（图4-6h），尤其是血小板减少者。局部敷以的消毒纱布保持3天，并嘱患者或其家属在3天内局部不能碰水，最后询问患者有无不良反应等。必要时记录操作过程和患者反应。

记录举例：取患者侧卧位，双膝前屈，暴露左（右）髂后上棘和定位；常规消毒、铺巾和2%盐酸利多卡因注射液局部注射后，行髂后上棘穿刺，抽吸髓液约0.3ml，操作过程顺利；出针后局部敷以消毒纱布，无出血；嘱患者或其家属轻压局部10分钟，3天内不能碰水，并询问患者无不良反应。记录骨髓穿刺涂片（后述）的张数。最后操作者签名和日期（年、月、日、时、分）。

（10）查看骨髓涂片：

对涂片缺乏或无骨髓小粒而疑似骨髓稀释或取材不佳的标本，应立即快速染色镜检予以确认，同时让患者静候，必要时重做骨髓穿刺，并告诉可能原因（如骨髓稀释或造血减低）。

2.骨髓涂片与小粒展片和小粒固定

一般疾病涂片8张，初诊疑似急性白血病涂片12张。涂片应视眼观髓液和首张推片时手感有核细胞多少，适当调整涂片厚薄度，如怀疑再生障碍性贫血（aplastic anemia，AA）等有核细胞少时，涂片宜厚，白血病等细胞多时宜薄。同时采集外周血涂片2张。

涂片制备，刮粘含小粒髓液推片：刮粘少量髓液放于载玻片的一端，一般推片与载玻片成30°～45°，并稍为拉锯使髓液往涂片两侧均匀散去后，稍为使力稳而匀速推片。推片与载玻片的角度应视眼观和首张推片时手感，适当调整涂片厚薄，有利于细胞学定性诊断。若推片刮粘髓液量较多时可推制两张涂片，先轻触载玻片使适量髓液于载玻片上，用推片的另一边推片，一张完成后翻转再推制另一张。竖式推片因手持推片离接触载玻片的支点远，平稳性较差，易造成推制的血膜或髓膜宽面不齐。也可准备一块平整的长方木条，载玻片置于其上，一手固定，一手将刮粘的少量髓液非常平稳地进行推片。若骨髓稀释，可以通过倾斜玻片将多余的外周血淌到一侧。

制备的理想涂片最重要的是有可分的头、体、尾区域，血膜或髓膜长宽范围以（2～2.5）cm×（3～4）cm左右为宜，实际操作多在这一范围内。至于要求推片的涂片两边各留出0.2～0.3mm的空隙区，实际操作多不易控制，即使是专业技术人员推片，面对多为易于凝固和黏稠性大的骨髓液，总体上达不到这一要求。虽可用楔形推片，也可采取自制推片（将推片留出2cm的两边各磨成凹三角）尝试，但不够实用。笔者实践认为，涂片有无边间隙对细胞学诊断无任何影响。

EDTA-K₂抗凝剂对骨髓细胞［急性髓细胞白血病M3型（AML-M3）白血病细胞除外］和染色基本不产生影响，故可提倡用干燥EDTA-K₂抗凝管将骨髓液抗凝后再定量（5µl/张）制片，并进行有核细胞直接定量计数等检查，缩小计数误差。李早荣主任技师推荐的抗凝制片对缺乏制片技术的临床医师所作骨髓穿刺液标本的处理尤其适用。

髓小粒展片，是刮取骨髓小粒或用吸管吸取含小粒骨髓液于载玻片中央，用另一张载玻片相互轻轻展拉骨髓小粒。拉片观察有核细胞或某些异常细胞较为可靠。含小粒的骨髓凝块也可以如同活检标本进）行固定和切片检查，适用于未做骨髓活检或为胸骨穿刺者。

（二）髂前上棘骨髓穿刺

取患者仰卧位，髂前上棘后1.5～2.5cm处为穿刺点（图4-7），按上指痕或标记后，常规消毒和局部推注盐酸利多卡因注射液。穿刺时操作者左手拇指和示指固定髂前上棘左右皮肤，右手持穿刺针与骨面垂直（注意体位倾斜度）缓和转钻进入0.5～1cm左右，感觉穿刺针被卡住时，即可抽吸。余同髂后上棘穿刺。髂前上棘骨质坚硬，髓腔又小，稍有偏位或穿刺偏深均易造成穿刺失败。

（三）髂后和髂前骨髓干抽或估计穿刺不理想时的补救方法

癌瘤骨髓转移和造血细胞异常增殖的骨髓“填塞”以及骨髓纤维化时，可出现穿刺干吸。干吸时采用以下方法以获取少量髓液进行细胞形态学诊断。

1.松动组织法将穿刺针进入髓腔后，以穿刺位点为中心似松土样轻轻松动组织，然后反复用力抽吸。

2.获取骨髓微小组织法不同步做活检者，将穿刺针退至骨膜内面，抽出针芯，再以手腕动作轻、缓、稳地半钻刺式至不能再进入时，作360°转动后缓缓退出，插入针芯多可获得的微小骨髓组织，压碎展片。用此法观察有核细胞可优于骨髓涂片。获取的骨髓组织小块也可作骨髓活检。

（四）胸骨骨髓穿刺

胸骨是造血最活跃的部位，但对其穿刺有一定危险且不能进行骨髓活检。穿刺时取患者仰卧位，不用枕头，必要时用枕头垫于背下以抬高胸部，于第2～3肋骨之间定位，如图4-8所示。定位后作一标记或指痕，按常规消毒和推注局部麻醉液，以45°（针柄斜向上腹部）缓缓进针，穿刺针进入胸骨深度为0.5～1cm，一般穿刺针进入被固定时即示进入髓腔。

（五）胫骨穿刺和婴幼儿骨髓穿刺

胫骨穿刺为3岁以下患儿可选择的一个部位。穿刺点在膝关节下3cm处或胫骨粗隆下1～1.5cm处，消毒和穿刺操作同髂后上棘穿刺。对1～3个月患儿进行骨髓穿刺，也可用一次性注射器（连针头或用8号针头）在常规消毒下不用局部麻醉直接穿入患儿的胸骨或髂后上棘。由于婴幼儿骨质软，直接的一次性穿刺易于把握，也简便安全。对婴幼儿骨髓穿刺，也可尝试用小儿头皮针或小号针头代替穿刺针进行。

三、骨髓活检标本获取和印片制备

常能获取骨髓活组织的部位有两处：髂后上棘和髂前上棘。骨髓活检与常规部位的骨髓穿刺同步进行，按操作中采集组织部位是否移动，分一步法和二步法（图4-8）。一步法可能会引起局部组织出血和一些人工假象，一般采用二步法获取骨髓活组织。

（一）二步法

二步法示意如图4-8和图4-9所示。在完成髂后上棘骨髓穿刺后，在旁开抽吸骨髓液位点约1cm处进行骨髓活检术。

1.右手持骨髓活检针穿刺进入

打开消毒活检包或将活检针放到刚使用的穿刺包中。取出针管，不套套管（接柱）而插入针芯（国产的非一次性活检针）。沿骨髓穿刺位进入，移动皮肤旁开穿刺点约1cm处，稍为刺入骨膜面。

2.套上套管钻刺而入

抽出针芯，套上一节或者两节套管（一节长，一节短，儿童患者宜用短套管）后再插入。以手腕动作缓、稳地半钻刺式而入2～3cm时，作360°转动离断组织，缓缓退出。

3.推出骨髓组织

去掉套管，插入针芯，推出获取的骨髓组织。骨髓组织长度应达到0.8～1cm或以上长度，若 ＜ 0.5cm时将明显影响异常成分的检出，应重新获取。

4.敷以消毒纱布

局部敷以消毒纱布或消毒粘贴，同骨髓穿刺。

（二）一步法

一步法是用活检针完成穿刺、抽吸骨髓液和组织取材。在局部消毒、麻醉、铺巾完成后，用活检针替代穿刺针在穿刺点进行穿刺。穿刺过程同前述骨髓穿刺，抽吸髓液比骨髓穿刺容易，抽吸的量也常大。抽吸髓液完成后不退出活检针，将套管（接柱）套入针芯，插入固定于骨髓腔的针管，以手腕动作缓缓钻刺（约100°来回）而入，通常至不能再入时，作360°转动后缓缓退出。去掉套管，插入针芯，推出获取的骨髓组织。

（三）骨髓印片制备和组织固定

将获取的骨髓组织推至洁净载玻片上制备骨髓印片。印片制作宜快，摆正位置后较为快速地轻轻滚动，或用另一张载玻片放在其上将组织块从玻片一端轻匀地滚向另一端（图4-10）。若印在载玻片上髓液量多，用另一张载玻片轻轻接触制成两张。而后立即将组织放入事先准备的固定液固定。获取符合要求的组织材料是决定印片质量的关键，取材不理想的组织便不能得到良好的印片标本。获取的组织块中带有较多的血液时，也将影响印片的细胞量。此时，宜去除外周附带的血液后再行印片。

（四）交代和记录

骨髓活检完成后，嘱患者或其家属局部压迫10分钟，尤其是血小板减少者。局部敷以消毒纱布保持3天，并嘱患者或其家属在3天内局部不能碰水，最后询问患者有无不良反应等。必要时记录操作过程和患者反应。

记录举例：由于骨髓活检与骨髓穿刺同步进行，其记录程序为：取患者侧卧位，暴露左（右）髂后（前）上棘和定位，常规消毒、铺巾和2%盐酸利多卡因注射液局部注射后，先用骨髓穿刺针行骨髓穿刺，局麻点进针，缓和钻刺至骨膜下1～1.5cm，抽吸髓液约0.3ml涂片，操作顺利。随后，持活检针做骨髓活检，原点进入，在旁开穿刺点约1cm处，缓和钻刺至骨膜下2～3cm，360°转动后缓缓退出，获取的骨髓组织立即印片和固定，操作顺利；出针后敷以消毒棉球和纱布，无渗血；嘱患者或其家属局部轻压10分钟，3天内局部不能碰水，并询问患者有无不良反应。记录获取的骨髓组织长度与颜色（如约1cm长，灰白色，组织条完整）。最后操作者签名和日期（年、月、日、时、分）。

四、血片采集

完成骨髓穿刺和活检，最后采集外周血血片2～4张。然后，将采集的骨髓涂片、骨髓印片和血片标本，以及活检的组织标本，检查归类，放入相应的标本盒。骨髓涂片、印片和血片染色后即可进行同步的细胞学镜检和评估。

（卢兴国）