第一节　血液分析仪检验技术原理

一、电阻抗法血液分析仪检测原理

二十世纪五十年代初，美国库尔特（Coulter）发明并申请了粒子计数技术设计专利，其原理是根据血细胞非传导性性质，以对电解质溶液中悬浮颗粒在通过计数小孔时引起电阻变化进行检测为基础。目前，血液分析仪仍以电阻抗（electrical impedance）法作为细胞计数和体积测量的基础，来进行血细胞计数和体积测定，这种方法也被称为库尔特原理（Coulter principle）。具体原理：把用等渗电解质溶液（被称为稀释液diluent）稀释的细胞悬液倒入一个不导电的容器中，将小孔管（板），也称为传感器（transducer）插到细胞悬液中，小孔是电阻抗法细胞计数的一个重要成分，其内侧充满了稀释液，并有一个内电极，其外侧细胞悬液中有一个外电极。检测期间，当电流接通后，位于小孔两侧的电极产生稳定的电流，细胞悬液通过有固定直径和厚度的小孔向小孔内部流动，计数孔直径一般 ＜ 100μm，厚度为75μm左右。因为小孔周围充满了具有传导性的液体，其电子脉冲是稳定的。如供给的电流I和阻抗Z是稳定的，根据欧姆定律通过小孔的电压E也是不变的（这时E=IZ）。当悬液中一个细胞通过小孔时，因血细胞有极小的传导性，细胞导电性质比等渗的稀释液要低，在电路中小孔感应区内电阻增加，于瞬间引起了电压变化而出现一个脉冲信号，这被称为通过脉冲，电压增加的程度取决于细胞体积，细胞体积越大，引起的电压变化越大，产生的脉冲振幅越高（图3-1）。通过对脉冲大小的测量可测定出细胞体积，记录脉冲的数目可得到细胞计数的结果；经过对各种细胞所产生脉冲大小的电子选择，可区分不同种类的细胞，并进行分析。

（一）白细胞检测原理

在进行血细胞测定前，全血标本须用稀释液在仪器外部或内部进行一定比例稀释，一般用1：251稀释倍数来测量白细胞，为了使红细胞全部破坏，需加入一定量的溶血剂（lyse）使红细胞膜破裂，释放出血红蛋白，仅留下红细胞膜微小的残余部分。仪器将从白细胞计数池中测量到体积 ＞ 35fl颗粒产生的电子脉冲的数量作为白细胞计数，根据细胞稀释倍数进行计算，得到正确的白细胞计数结果。

从电阻抗原理可见，不同体积白细胞通过小孔时产生的脉冲大小不同，不同类型的白细胞（如淋巴细胞、单核细胞、中性粒细胞）经溶血剂作用后有明显差异，因此根据脉冲大小，即可人为地将白细胞分成几群（二分群或三分群），在临床应用中，称为“二分类”“三分类”血液分析仪，这种表述是不确切的。因为白细胞分类是指在显微镜下，观察经染色的血涂片，根据细胞形态（包括细胞胞体大小；细胞质的颜色及量的多少；细胞质中颗粒的颜色、大小及数量；核的形状及染色质的特点）综合分析，得出准确均一的细胞群。也就是说，如分类结果淋巴细胞是25%，意味着分类100个白细胞中准确地有25个淋巴细胞。而电阻法白细胞“分类”实际上是根据溶血剂作用后的白细胞体积大小的分群，其测量的标准只是根据白细胞体积的大小，而体积大小并不是细胞形态唯一的指标。比如，经溶血剂作用后有些嗜碱细胞可落入小细胞群，而大淋巴细胞可落到“中间”或“大细胞群”。显微镜下，单核细胞较粒细胞体积大，而经溶血剂作用后，粒细胞体积大于单核细胞。因此，在解释血液分析仪白细胞“分类”的结果时，“淋巴”细胞在仪器分类时只认定为体积与淋巴细胞体积相似的小细胞群，在这群体中，可能90%的白细胞是淋巴细胞，而绝不是均一细胞群体。这种差异在病理情况下更大，这也就是专家们反复强调电阻抗法白细胞“分类”不能代替显微镜涂片检查的原因所在。

仪器是如何进行细胞分群？目前，很多仪器除给出细胞计数外，同时提供出细胞体积分布图形，表示细胞群体分布情况图形称为直方图（histogram）。可显示出某一特定细胞群平均细胞体积、细胞分布情况和是否存在明显的异常细胞群。直方图是由测量通过感应区的每个细胞脉冲累积得到，根据库尔特原理可在计数的同时进行分析测量。如图3-1所示，左图为示波器显示的所分析细胞的脉冲大小，右图为相应的体积分布直方图，横坐标为体积，纵坐标为相对数量。血液分析仪在进行血细胞分析时，将每个细胞的脉冲数根据其体积大小分类，并储存在相应的体积通道中。从每个通道收集的数据统计出细胞的相对数量（REL No.），表示在“y”轴上；细胞体积数据以fl为单位，表示在“x”轴上。在进行白细胞体积分析时，仪器计算机部分可将白细胞体积从35～450fl分为256个通道（channel），每个通道约为1.64fl，细胞根据其体积大小被分别放在不同通道中，从而得到白细胞体积分布直方图（图3-2）。

电阻抗法得到的白细胞分类数据是根据白细胞体积直方图计算得来的（图3-3）。

经过溶血剂处理后的白细胞，根据体积大小可初步确认其相应的种类：第一亚群（小细胞群）是淋巴细胞（lymphocyte，LYM）；第二亚群是单个核细胞区（mononuclear cell，MONO），也被称为中间细胞（middle cell，MID）；粒细胞（granulocyte，GRAN）群，位于第三亚群（大细胞群）。例如，图3-3中位于35～90fl的颗粒被计数为淋巴细胞，90～160fl的颗粒计数为单个核细胞，160fl以上的颗粒计数为粒细胞。仪器根据各细胞群占总体的比例计算出各细胞群的百分比，再与该标本的白细胞总数相乘，即得到各项的绝对值。需要注意的是，因各厂家血液分析仪使用的稀释液和溶血剂成分不完全相同，对白细胞膜的作用程度不同，所以仪器对各种类白细胞区分界限的规定有所不同，在使用时不应随意更换生产厂家试剂，防止造成错误的报告。

因白细胞计数池中除加入一定量的稀释液外还加入了溶血剂，此溶血剂一方面使红细胞迅速溶解；另一方面使白细胞浆经细胞膜渗出，胞膜紧裹在细胞核或存在的颗粒物质周围。经此处理后的白细胞体积与其自然体积无关，含有颗粒的经溶血剂处理后的粒细胞比无颗粒的单核细胞和淋巴细胞体积要大些，但其真实体积与单核细胞相等或更小。白血病细胞、异型淋巴细胞、嗜酸性粒细胞、浆细胞、嗜碱性粒细胞等多出现在单个核细胞区域，少数也可见于淋巴细胞或粒细胞区。所以白细胞直方图并不能代表其自然状况，但可用于判断白细胞各体积群分布情况。如标本中有未成熟细胞、异常细胞或非典型细胞，有些三分群的血液分析仪在报告单上可打出报警信号（flag）“R”，并能指出哪一个区域有异常细胞及异常细胞的种类（表3-1）。

（二）红细胞和血小板检测原理

1.红细胞计数与红细胞比容测定原理

迄今，大多数血液分析仪使用电阻抗法进行红细胞计数和红细胞比容测定，其原理同白细胞检测一样。红细胞通过小孔时，形成相应大小的脉冲，脉冲的多少即红细胞的数目，脉冲的高度代表单个脉冲细胞的体积。脉冲高度叠加，经换算即可得红细胞比容（又称血细胞比容）。有的仪器先以单个细胞高度计算红细胞平均体积，再乘以红细胞数，得出血细胞比容（hematocrit，HCT）。仪器根据所测单个细胞体积及相同体积细胞占总体的比例，可打印出红细胞体积分布直方图。稀释的血液进入红细胞检测通道时，其中含有白细胞，红细胞检测的各项参数均含有白细胞因素。因正常血液有形成分中白细胞比例很少（红细胞：白细胞约为750：1），故白细胞因素可忽略不计。但在某些病理情况下，如白血病，白细胞明显增加而又伴严重贫血时，均可使所得红细胞各项参数产生明显误差。

2.各项红细胞平均指数检测原理

同手工法一样，红细胞平均体积（mean corpuscular volume，MCV）、红细胞平均血红蛋白量（mean corpuscular hemoglobin，MCH）、红细胞平均血红蛋白浓度（mean corpuscular hemoglobin concentration，MCHC）、红细胞体积分布宽度（red cell volume distribution width，RDW），均是根据仪器检测的红细胞数、红细胞比容和血红蛋白含量检验数据，经仪器程序换算出来的。

RDW是反映周围血红细胞体积异质性的参数。当红细胞通过小孔的一瞬间，计数电路得到一个相应大小的脉冲，不同大小的脉冲信号分别贮存在仪器内装计算机的不同通道，计算出相应的体积及细胞数，统计处理而得RDW。因RDW来自十几秒内近万个红细胞的检测数据，不但可克服手工测量红细胞直径时人为制片条件和主观因素的影响，还比P-J曲线（Price-Johns曲线）更直接、客观，及时反映红细胞大小不等的程度，对贫血的诊断有重要意义。多数仪器用所测红细胞体积大小的变异系数表示，即红细胞分布宽度-CV值（red cell volume distribution width-CV，RDW-CV），也有的仪器采用红细胞分布宽度-s值（red cell volume distribution width-s，RDW-s）报告。有研究报道指出，在计算RDW-CV时，受红细胞体积大小的影响（CV=s/X），在某些病例中不能真实反映红细胞大小、离散的情况，而RDW-s可弥补这一不足。

3.血小板检测原理

血小板随红细胞一起在一个系统中进行检测，因血小板体积与红细胞体积有明显差异，仪器设定了特定阈值，将高于阈值者定为红细胞，反之为血小板，检测数据经仪器内部计算机处理后分别给出血小板与红细胞数。血小板分别贮存于64个通道内，直方图范围为2～30fl之间。不同仪器血小板直方图范围不一。血小板平均体积（mean platelet volume，MPV）是此平整曲线所含群体算术平均体积，所以，MPV也就是PLT体积分布直方图产物。为了使血小板计数更准确，有些仪器专门设置了增加血小板准确性的技术，如鞘流技术、浮动界标、拟合曲线等。

二、光散射法血液分析仪检测原理

光散射法血液分析仪有各种类型，使用的分析技术各异而且各有自己的专利技术，使血细胞分析结果更加准确。

（一）白细胞检测原理

1.VCS分析技术血液分析仪原理

VCS分别是体积（volume）、传导性（conductivity）和光散射（scatter）的缩写，这一专利技术为当今细胞分析提供了较高的敏感度、特异性和准确性。这一分类过程使用专一试剂，对标本进行正确处理。两种试剂，红细胞溶解剂（erythrolyse）和白细胞稳定剂（stabilizer）先后加入混匀池内，与血液标本混匀，从而溶解红细胞而使白细胞保持在未改变或“近原态”状态。其中，红细胞溶解剂的作用是溶解红细胞，后加入的白细胞稳定剂作用是中止溶血反应并使留下的白细胞恢复到原态用以进行分析。

VCS技术采用一种特殊结构的流式细胞仪，这一系统包括一个由石英晶体制成的流动池，采用液力聚焦术使白细胞通过流动池，并呈单个排列呈现在检测系统前。VCS是仅用单一通道进行白细胞分析的技术，它采用三个独立的能量来源在流动池内检测8 192个白细胞。将体积、传导性和光散射的参数结合起来，从而直接测量5种白细胞分群。

（1）体积：

VCS利用库尔特的电阻抗原理来测量处于等渗稀释液中的完整原态细胞的体积。无论细胞在光路中的方向如何，这种方法都能准确地测量出所有大小的细胞。这一信息可用来纠正传导性和光散射信号，给出强有力的库尔特独特的双重测量数据。

（2）传导性：

电磁波范围内的交流电可通过细胞膜穿透细胞。利用具有强大潜能的探针，用以收集有关细胞大小和内部构成的信息，包括细胞的化学组成和核体积。通过纠正传导信号使它不受细胞大小影响，我们可获得只与细胞内部构成相关的测量信息。这种新的测量探针，实际上测量的是阻光性，使得VCS技术可利用细胞内部构成的不同，将大小相近的细胞区分开来。同时，仪器通过计算出细胞核/细胞质比值，用来区分异型淋巴细胞和正常淋巴细胞。

（3）光散射：

VCS系统内氦-氖激光发出一束椭圆形光束，可用来收集细胞颗粒信息、核分叶情况及细胞表面特性。库尔特血液分析仪消除了光散射信号中有关体积部分，给出了旋转光散射（rotated light scatter，RLS）新测量参数。这样，就可选择每种细胞最佳的光散射角度并设计出能覆盖这一范围（10°～70°）的散射光检测器。VCS技术利用这种方法无需经数学处理便可准确地把混合的细胞（如中性粒细胞和嗜酸性粒细胞）区分成不同的细胞亚群，这种方法还能提高非粒细胞群之间的分离。

在使用VCS技术进行白细胞分类时，每个样本都将有8 192个细胞颗粒（网织红细胞分析时检测32 000个红细胞）接受三维分析，每个细胞通过检测区域时，根据它的体积（Y轴）、传导性（Z轴）和光散射（X轴）特点，被定义到三维散点图中的相应位置。在散点图上，所有单个细胞的位置就形成了相应细胞的群落。白细胞真正的分类是在每一个细胞亚群与其在全部被测白细胞所占百分比的基础上计算得到。例如：如被检测的8 192个颗粒中，有8 000个是落在了白细胞的五个亚群落中，而这8 000个白细胞中，有4 565个落在了淋巴细胞的群落中，那么，淋巴细胞的百分比就是57%。VCS技术使得贝克曼库尔特五分类血液分析仪可在同一通道内，相同的试剂环境中，对白细胞及幼稚细胞进行精确分析，从而保证结果的稳定性和准确性。同时，因VCS技术同时使用的3种检测能量的探针均为物理方法，因此贝克曼库尔特的五分类仪器仅用4种试剂即可完成细胞计数、白细胞分类、幼稚细胞检测和有核红细胞检测等功能。目前，应用VCS原理的最新型号有LH 780和DXH 800。

2.流式细胞检测结合核酸荧光染色技术血液分析仪原理

采用此检测原理的血液分析仪包括：XE-5000、XE-2100、XT-1800i、XT-2000i、XE-2100L 和 XE-2100D。

在过去，全自动血液分析仪的性能只是强调计数的准确性，包括白细胞五分类的准确性，而新一代的五分类血液分析仪不仅强调分类的准确性，而且更加突出对异常标本的筛选能力，这必然会促进五分类方法学的改进。尽管使用流式激光检测技术就可得到白细胞五分类结果，但该方法只能对细胞的大小、细胞核和细胞质内容物等物理信息进行检测，现代五分类检测原理则更多地利用生物化学法结合物理方法进行多参量检测。单纯采用物理方法进行五分类检测，不能有效地对形态各异的原始细胞或异常细胞进行分析，可借助生物化学的方法，根据不同细胞在不同成熟时期对各种溶血试剂、组化染料和荧光染料的反应性不同，将其细胞生物特性转化为差异较大的物理学特征之后，再进行物理学方法检测。

然而，采用两种技术相结合的此类最新型的血液分析仪使用了核酸荧光染料以增强细胞检测的敏感性。仪器以半导体激光器为光源，波长633nm。为了配合红色波长的半导体激光器，首次采用了近蓝色的荧光染料聚次甲基（polymethinepolymethine），它可对细胞质中的核酸物质（RNA/DNA）进行染色。在检测侧向散射光时，检测侧向90°散射光，以提高对细胞核形态的分辨能力，同时也可满足侧向90°荧光的检测。

该仪器使用了两个通道检测五类白细胞。在DIFF通道中，根据不同白细胞类型和不同成熟度的细胞对荧光染料的着色能力不同，检测散射光信号和荧光信号就可区分出淋巴细胞、单核细胞、嗜酸性粒细胞、中性粒细胞/嗜碱性粒细胞。为了区分中性粒细胞和嗜碱性粒细胞，设立了单独的BASO通道，其中加入表面活性剂，使除嗜碱性粒细胞以外的白细胞溶解破碎，只剩下裸核，而嗜碱性粒细胞可抵抗表面活性剂的溶解保持细胞的完整。因完整的嗜碱性粒细胞和裸核之间的体积差异可表现为散射光信号的差异，因此检测散射光信号可准确区分中性粒细胞和嗜碱性粒细胞。

此外，在自动血液分析中低值血小板的检测一直是个难点。采用传统的阻抗法检测技术，单纯靠细胞体积一个检测参数，无法有效区分其他干扰物质，特别是无法区分病理标本中的大血小板、小红细胞、红细胞碎片和大的网织红细胞，而上述新型血液分析仪除采用常规的阻抗法外，还采用核酸荧光染色技术检测血小板，得到光学法血小板参数（PLT-O），仪器可根据光学血小板的检测结果，对病理标本阻抗法检测的血小板数自动加以校准。

3.多角度偏振光散射分析技术血液分析仪原理

CELLDYN五分类血液分析仪结合流式细胞仪中液流聚焦技术-双鞘液原理，以氦氖激光为光源，利用多角度偏振光散射（multi-angle polarized scatter separation，MAPSS）分析技术对细胞进行检测分析。

全血标本经过鞘液稀释形成细胞悬液，与鞘液分别进入流动室。因两者流速及压力均不一样，从而形成一个直径大约30μm的液体管道，使细胞悬液中的细胞颗粒单个排列，一个接一个地通过激光检测区，这就是流式细胞仪中常采用的液流聚焦原理。仪器通过检测每个细胞对入射的激光在4个独特角度的散射强度并对数据进行综合分析，从而完成白细胞分类。其中：①0°（1°～3°）前向散射光强度检测反映细胞大小，同时检测细胞数量；②10°（7°～11°）小角度散射光强度检测反映细胞结构以及核质复杂性；③90°（70°～110°）垂直角度散射光强度检验反映细胞内部颗粒及分叶状况；④90°D（70°～110°）垂直角度的消偏振光散射强度检测，反映的是基于嗜酸性粒细胞的嗜酸颗粒可将垂直角度的偏振光消偏振的特性，从而将嗜酸性粒细胞从中性粒细胞中分辨出来。

4.双鞘流五分类血液分析仪原理

双鞘流五分类血液分析仪，通过白细胞计数通道（WBC/HGB），双鞘流通道（double hydrodynamic sequential system，DHSS），嗜碱性粒细胞通道（BASO/WBC）等3个通道相互协作完成白细胞五分类和异常白细胞测定。

（1）WBC/HGB检测通道：

应用无氰化物的溶血剂，采用鞘流阻抗法和比色法进行白细胞和血红蛋白的测定，白细胞为256分析通道。Pentra 120中有2个辅助通道（DHSS和BASO/WBC），分别进行白细胞的计数，所得结果与WBC/HGB通道的白细胞结果进行比较，称为平衡检测技术，保证白细胞计数和分类的准确性。Pentra 120 DX在WBC/HGB、DHSS、BASO/WBC、网织红细胞（reticulocyte，Ret）4 个通道中同时进行白细胞的计数和比较，在网织红细胞检测通道中可把有核红细胞从白细胞的计数中扣除，保证了白细胞结果的准确可靠。

白细胞平衡（WBC balance）检测原理：在WBC/HGB通道中的白细胞计数结果与DHSS双鞘流池及WBC/BASO通道结果相联系，当DHSS通道中的结果超过或低于白细胞参考计数通道（WBC/HGB、WBC/BASO）时，按设定的偏差范围（表3-2），仪器会自动提示LMNE报警，从而保证了白细胞分类结果的准确可靠。

（2）DHSS（双鞘流）通道：

是白细胞分类的核心技术，联合流式细胞化学染色技术、吸光比率法、聚焦流阻抗法3种方法对白细胞进行精确分析。细胞化学染色液（eosinfix）对细胞脂质和蛋白组分进行染色，其中对单核细胞初级颗粒、中性粒细胞和嗜酸性粒细胞的特异颗粒进行不同程度的染色。在淋巴细胞、单核细胞、中性粒细胞和嗜酸性粒细胞（lymphocytes，monocytes，neutrophils and eosinophils，LMNE）散点图中同时能得到嗜酸性粒细胞、中性粒细胞、单核细胞、淋巴细胞、异型淋巴细胞和巨大未成熟细胞的结果。

1）DHSS技术：

流式通道中有2个检测装置。①60μm鞘流微孔用于细胞体积的测定；②42μm的光窗测定吸光比率用于分析细胞的内容物。细胞经鞘流稀释液作用，排列在流式通道中央，细胞经第一束鞘流后通过阻抗微孔测定细胞的真实体积，然后经第二束鞘流后，到达光窗进行细胞的光散射及光吸收的测定，分析细胞的内部结构。DHSS通道应用此技术，实现了对大量细胞进行依次、准确、快速的测定。

2）时间检测装置（time fixed device）：

DHSS 检测时间的固定设计，能保证每个细胞依次通过鞘流微孔，检测细胞体积，在200μs内细胞应到达光窗，检测细胞光散射/吸收，进行细胞内容物的分析。此检测装置能有效防止气泡及静电的干扰，保证获得高精度的白细胞的分类结果。

3）细胞化学染色技术：

是经典的细胞分类方法，此染色剂中含有溶血素及氯唑黑活体染料（chlorazol black E）。在仪器的DHSS检测池中，全血标本与染色剂充分混匀，在35℃下进行孵育，此过程为：①溶解红细胞；②对单核细胞的初级颗粒、嗜酸性粒细胞和中性粒细胞的特异颗粒进行不同程度的染色，同时对细胞的膜（细胞膜、核膜、颗粒膜）也进行不同程度的着色；③固定细胞的形态，使其保持自然状态。因淋巴细胞、单核细胞、中性粒细胞和嗜酸性粒细胞对染色剂的着色程度不同，每种细胞特定的细胞核形态和颗粒的结构造成光散射的强度不同，产生了特定的吸光比率。

4）标本自动混匀系统：

血液分析仪测定的为全血标本，所以标本的均一性是保证结果重复性和准确性的关键环节。双鞘流五分类血液分析仪采用了360°旋转混匀技术，能保证全血标本达到最佳的混匀状态。ABX自动采样针，采用了自下而上穿刺通过标本管帽方式抽取标本，最大限度地减少因真空管的真空度不足使采血量减少而导致的仪器吸样的误差。

（3）BASO/WBC通道：

在WBC/BASO检测池中，全血标本与BasolyseⅡ溶血素混合，在35℃恒温下，溶解红细胞，因嗜碱性粒细胞具有抗酸性，能保持形态完整，而其他白细胞细胞质溢出，成为裸核状态。细胞通过鞘流微孔（80μm），每个细胞产生与细胞体积成比例的电子脉冲，绘制WBC/BASO直方图。依据阈值设定，区分白细胞裸核与嗜碱性粒细胞，能准确测定嗜碱性粒细胞和白细胞（监测功能）。

5.光散射+过氧化物酶染色法血液分析仪原理

激光法血液分析仪主要有早期的H系列（包括H*1、H*2和H*3）和现在的ADVIA 120和2120等几种型号。其检测原理：利用激光散射和过氧化物酶染色技术进行白细胞计数及分类，用激光散射法进行红细胞和血小板计数以及网织红细胞计数与分群，利用光电比色法进行血红蛋白测量。此类仪器有4个测量通道：过氧化物酶测量通道（白细胞分类）、嗜碱性粒细胞/分叶核测量通道、红细胞/血小板测量通道和血红蛋白测量通道。

（1）过氧化物酶通道白细胞检测原理：

因嗜酸性粒细胞有很强的过氧化物酶活性，中性粒细胞有较强的过氧化物酶活性，单核细胞次之，而淋巴细胞和嗜碱性粒细胞无此酶。将血液经过过氧化物酶染色，细胞质内部即可出现不同的酶化学反应。当这类细胞通过测量区时，因酶反应强度不同和细胞体积大小差异，激光束射到细胞上的前向角和散射角不同，以透射光检测酶反应强度的结果为x轴，以散射光检测细胞体积为y轴，每个细胞产生两个信号结合定位在细胞图上，仪器每秒钟可测上千个细胞。

（2）嗜碱性粒细胞/分叶核通道测量原理：

用于嗜碱性粒细胞计数，ADVIA系列采用化学反应与激光技术结合原理，提高了自动化仪器进行白细胞分类的准确性。

（二）红细胞和血小板检测原理

采用光散射法检测红细胞和血小板的仪器目前主要是ADVIA系列血液分析仪。该系列血液分析仪采用与电阻抗法检测原理完全不同方法，首次引入双角度激光散射法，结合专利细胞等体积球形化技术，实现对红细胞与血小板的准确区分。红细胞与血小板细胞反应包含两个步骤：①用相应试剂使自然状态下双凹圆盘状的红细胞和血小板发生等体积球形化改变，以消除细胞形态这一可变因素；②红细胞和血小板被固定。红细胞与血小板被固定目的是使红细胞无论以何种角度通过测试区时，被激光束照射后所得的信号是相同的，此种处理并不影响MCV的检测。

检测系统以激光二极管光源，以670nm激光束以双角度（低角度和高角度）光散射测量通过流通池的每一个红细胞。根据米氏光散射理论（Mie theory of light scatter for homogenenounspheres），根据低角度（2°～3°）光散射转换能量大小，测量单个红细胞体积与总数；根据高角度（5°～15°）光散射得出单个细胞内血红蛋白浓度，可准确得出MCV、MCH、单个红细胞内血红蛋白含量（cell hemoglobin content，CH）、单个红细胞内血红蛋白浓度（cell hemoglobin concentration mean，CHCM）测定值，并绘出红细胞散点图、单个红细胞体积及红细胞内血红蛋白含量的直方图及求出RDW、红细胞内血红蛋白分布宽度（hemoglobin distribution width，HDW）等参数。

红细胞散点图是两种光散射测量值图形表示：高角度光散射（5°～15°）沿 x 轴描绘，而低角度光散射（2°～3°）沿 y 轴描绘。根据Mie光散射理论，每个细胞低角度和高角度光散射信号被转换为细胞体积和血红蛋白浓度值，红细胞散点图显示了光散射测量值与逐个细胞的体积和血红蛋白浓度特性之间的关系。图中网格环绕内的红细胞体积在30～180fl之间，血红蛋白浓度在15～45g/dl之间。对于正常样本，红细胞群显示在图的中央。但由于该图是非线性的，目测评估红细胞形态会很困难，使用红细胞体积/血红蛋白浓度（V/HC）转换的红细胞散点图，可提供对细胞体积和血红蛋白浓度的线性表示。

红细胞体积/血红蛋白浓度（V/HC）散点图是红细胞非线性散点图的线性版本。在V/HC 细胞散点图中，沿x轴描绘血红蛋白浓度，沿y轴描绘细胞体积。该细胞散点图中仅显示红细胞。以红细胞（体积和血红蛋白浓度）正常值为标记可将红细胞散点图分割成9 个不同区域。在x轴上，血红蛋白浓度正常值标记被设置在280g/L和410g/L处。血红蛋白浓度低于280g/L为低色素红细胞；而血红蛋白浓度高于410g/L的为高色素红细胞。在y轴上，红细胞体积标记被设置在60fl和120fl处。体积小于60fl的红细胞是小红细胞，而体积大于120fl是大红细胞。

血小板检测信号需经电子信号放大，其中低角度光散射（2°～ 3°）信号被放大 30 倍，高角度光散射（5°～15°）信号被放大12倍，这些“高增益”信号用于分析血小板。根据Mie光散射理论，低角度、高增益光散射测量值被转换为细胞体积，与被测细胞大小有关；而高角度、高增益光散射测量值转换为折光指数（refractive index，RI），与细胞密度有关。正常血小板的体积在1～30fl，RI在1.35～1.40。由于红细胞含有高浓度的血红蛋白，其折光系数高（1.35～1.44），因此，大血小板虽然可能与小红细胞、红细胞碎片、红细胞残骸（ghost）以及其他细胞碎片的体积相似，但因其内容物不同，RI相差较大，在血小板的二维散点图上可以区别并分别进行计数。

血小板散点图显示光散射测量值与逐个细胞的体积和折光指数之间的关系。图中网格环绕中的细胞体积在0～60fl之间，折光指数在1.350 0～1.400 0之间。血小板计数包括：①血小板；②大血小板。红细胞碎片和红细胞残骸不包括在血小板计数内，但会被计数以供报警提示。由于血小板方法中使用高增益系数，红细胞显示在位于血小板散点图右上角的饱和通道中。

（三）网织红细胞检测原理

带有网织红细胞分析功能的血液分析仪，与白细胞五分类方法学的情况类似，不同的厂家仪器网织红细胞的测定原理也不相同。它们使用各种荧光染料和非荧光染料对网织红细胞进行染色，并依据各自仪器的原理进行检测。这些具有网织细胞检测能力的全自动血液分析仪除了可以给出网织红细胞百分比外，还可给出网织红细胞计数绝对值、网织红细胞体积、网织红细胞血红蛋白含量、成熟程度、网织红细胞分群等许多参数，并提供网织红细胞散点图（scattergram），在图中颜色密度大的位置一般表示检测到的数据信号多。为保证网织红细胞计数的准确性和稳定性，这类仪器一般都有配套的网织红细胞质控品，并以高、中、低不同浓度的结果对仪器进行全面质量管理。由于自动化仪器的使用，网织红细胞计数的精密度有了明显提高。统计表明：对低网织红细胞比率的标本，仪器法变异系数（CV）在10%～20%之间；对正常比率范围的标本，CV值在3%～16%之间；高值标本，CV更可降低到2%～10%。血液分析仪检测的这些网织红细胞参数是临床应用和研究的热门领域。目前国内应用的带有网织红细胞分析功能的多参数血液分析仪主要为进口产品，网织红细胞测量原理常见的有下列几种：

1.以新亚甲蓝为染料，运用Coulter VCS三维技术检测网织红细胞

该法厂家在二十世纪九十年代推出采用新亚甲蓝（new methylene blue，NMB）对网织红细胞进行染色的全自动五分类法血液分析仪，是一款较早的含网织红细胞分析功能的仪器，采用新亚甲蓝对网织红细胞进行染色，但是需要首先对标本进行预染色处理，再在仪器上选用网织红细胞检测程序检测标本，因此属于具有半自动网织红细胞分析功能的血液分析仪。

新亚甲蓝是一种经典非荧光超活性染料，可沉淀网织红细胞内残存RNA。血液和新亚甲蓝染料结合后，经一段时间孵育，再加入一种酸性脱蛋白溶液，去除红细胞内血红蛋白，而保留着色RNA。运用Coulter独到VCS三维技术，将网织红细胞与成熟红细胞、白细胞、血小板和有核红细胞区分开来。VCS技术中电阻抗（V）技术可确定细胞体积大小，未成熟网织红细胞体积略大于成熟红细胞，在散点图y轴上可表现出体积大小这一非常重要信息。电导性（C）可反映细胞内部特征信息，三维图中z轴表现为电导性，但只能在旋转三维图中见到。氦氖激光测定可获得光散射（S）信息，提供细胞表面特征和细胞颗粒特征信息。网织红细胞分析高度依赖光散射信息，因为含有被NMB染色后的网织红细胞光散射强度高于成熟红细胞的光散射强度。散点图x轴显示的是光散射强度信息，光散射信息可将网织红细胞与成熟红细胞区分开，因为网织红细胞含较多核糖核酸（RNA），因此会散射较多的激光，在散点图上会出现在成熟红细胞的右侧，而且网织红细胞成熟度越差，在散点图上的分布越靠右侧。将体积、电导性和光散射信息的原始资料绘制成三维数据图中，而我们看到的往往是平面散点图（xy轴所表达的信息）。用软件对曲线中的细胞群进行分割后，血小板群和白细胞群的细胞信号被除去，只保留成熟红细胞和网织红细胞信息。用柔变轮廓分析技术以一种非线性的方式（沿着细胞群的曲线而不是直线）将网织红细胞从成熟红细胞中区分出来，通过区分和计算，即可得到网织红细胞的结果。应用VCS 技术可得到网织红细胞百分比和绝对值、未成熟网织红细胞指数（immature reticulocyte fraction，IRF）、网织红细胞平均体积（mean reticulocyte volume，MRV）、球形红细胞平均体积（mean sphered cell volume，MSCV），高光散射网织红细胞（high light scatter reticulocyte，HLR）百分比和绝对值。该厂家在后来生产的STKS、GenS、HmX、LH700系列仪器，均采用了相同的染色技术和测定原理；而在自动化方面则有很大改进，可自动完成取样和网织红细胞染色全过程，测定速度和测量精度均明显高于早期的Maxm型血液分析仪。

2.以氧氮杂芑750为染料，采用两角度散射光测量吸收光强度检测网织红细胞

该方法的厂家在1993年推出的Technicon H*3型全自动血液分析仪是早期带有半自动网织红细胞分析功能的仪器。它需要首先将3µl血液加入到已经标准化的网织红细胞染色专用试剂瓶内孵育15分钟，使试剂瓶内含有的氧氮杂芑750（oxazine 750）核酸染料与网织红细胞中的 RNA 充分结合染色，然后将仪器转换为网织红细胞测定模式进行检测，因此属于半自动测定方式。网织红细胞被染色时，由于不同成熟阶段的网织红细胞含有的 RNA量不同，结合的染料量也不同，染色后的网织红细胞具有特定的吸收光。当其通过流动细胞池（flow cell）被激光束照射时对光的吸收也不同，仪器可根据吸收光的强弱来进行RNA定量检测，进而区分成熟红细胞和未完全成熟的网织红细胞。同样也可根据网织红细胞吸收光的强弱来对应网织红细胞的成熟程度，据此将网织红细胞分为低吸光度网织红细胞（low absorption reticulocyte，L Retic）、中吸光度网织红细胞（middle absorption reticulocyte，M Retic）和高吸光度网织红细胞（high absorption reticulocyte，H Retic）3部分。仪器同时还以低角度（2°～3°）散射光信号检测网织红细胞体积，以高角度（5°～15°）散射光信号检测网织红细胞内血红蛋白浓度，从而得到单个网织红细胞内的血红蛋白含量（reticulocyte hemoglobin content，CHr）、网织红细胞平均体积（mean reticulocyte volume，MRV）、网织红细胞体积分布宽度（reticulocyte volume distribution width，RDWr）和网织红细胞内血红蛋白分布宽度（reticulocyte hemoglobin distribution width，HDWr）等许多具有研究和临床应用价值的参数。

1999年，在H*3型血液分析仪基础上进行改进，推出了更新的120型全自动血液分析仪。其网织红细胞测定也进行了较大的改进，不需要将血液标本预处理染色，可直接由仪器自动吸入标本并快速进行染色处理和孵育。其染料仍然使用氧氮杂芑750，用氦氖激光为光源，发射波长为 670nm 的激光束。因为试剂可以使得红细胞和血小板球形化，这样可以明显消除细胞形态对体积测定的影响。仪器以低角度光散射和高角度光散射同时测量一个网织红细胞，根据两个角度得到的数据，可准确得到MRV、CHr和RDWr等各种网织红细胞的研究参数。同时根据吸收光的强弱进行RNA定量检测，根据吸收光的强度，可将网织红细胞分成L Retic、M Retic和H Retic三部分。

3.以碱性槐黄或聚次甲基为染料，以两个角度散射光测量荧光强度检测网织红细胞

该方法厂家于20世纪90年代开发了全自动血液分析仪SE-9000，它可在主机上附加一个半自动式的网织红细胞分析组件，形成 SE-9000/RAM-1，具有网织红细胞分析能力的五分类血液细胞分析系统，这个系统与该厂家生产的R系列网织红细胞分析仪一样使用荧光染料碱性槐黄O（auramine O）对网织红细胞进行染色，再使用氩激光和流式细胞技术进行测定。碱性槐黄水溶液的特征是正常情况下，由于吸收的光能被分子内的旋转运动消耗，所以不发出荧光。但当染料结合到膜或核酸时，由于分子内运动受到干涉，所以会发出强烈的荧光。该仪器发射出波长为488nm 的激光束照射于网织红细胞上，其RNA 结合荧光染料后会发射出特定强度的荧光。以前向角光散射强度鉴别细胞大小，侧向荧光强度反应细胞内RNA含量，从而在二维图上显示出网织红细胞、红细胞和血小板的分布情况。由于细胞大小不同和 RNA 含量不同，运用软件技术将血小板从成熟红细胞群中分离出去；还是由于RNA含量不同，网织红细胞也会从成熟红细胞群中分离出来，这样网织红细胞的绝对值和百分比结构可以轻易被计算得到。在散点图的x轴方向，越靠近右侧的是RNA含量较多的幼稚形网织红细胞，越靠近左侧（贴近成熟红细胞群的）是RNA含量较少的较为成熟的网织红细胞，中间是中等成熟度的网织红细胞。这样可将网织红细胞的成熟程度分为低荧光强度网织红细胞（low fluorescence reticulocytes，MFR）、中荧光强度网织红细胞（middle fluorescence reticulocytes，MFR）和高荧光强度网织红细胞（high fluorescence reticulocytes，MFR）3 类。

该方法厂家以后生产的XE系列等五分类血液分析仪器在检测网织红细胞时，从半自动方式转换为全自动方式，采用激光流式原理和细胞化学染色技术，使用的荧光染料改为新的聚次甲基荧光染料；其特征是染料中含有和次甲基相连的杂环核，当染料结合了膜或核酸后，其分子运动受到干涉，所以会吸收更多的光并发出更强的荧光；使用的网织红细胞检测试剂分为稀释液（RET-SEARCH Ⅱ DILUENT）和染色剂（RET-SEARCH Ⅱ DYE）。血液首先经过稀释液处理，使红细胞和白细胞肿胀并且轻微损伤细胞膜以便染料容易进入细胞内，然后染色剂中的聚次甲基染料进入细胞内，使网织红细胞中的RNA和白细胞核内的DNA染色。由于 RNA 含量的不同，所以可以将红细胞和未成熟的网织红区分出来；由于DNA和RNA含量的不同，可以将网织红细胞和白细胞区分出来。这类仪器除了进行全自动的网织红细胞绝对值和百分比计数外，还可以通过对网织红细胞核酸染色得到的荧光信号强度区分出低、中、高荧光强度的网织红细胞（LFR、MFR、HFR）。由于幼稚的网织红荧光信号较强，MFR和 HFR 之和即成为反映未成熟网织红的一个有用参数——未成熟网织红细胞比率（immature reticulocyte fraction，IRF），该参数 1997年被美国食品和药品监督管理局（FDA）批准成为可以作为临床应用的报告参数。

4.以亚甲蓝为染料，以多角度偏振光散射分析技术检测网织红细胞

该检测原理应用了具有独特专利技术的多角度偏振光散射分析技术（MAPSS）和非荧光性的亚甲蓝染料对网织红细胞染色后的各种特征进行分析。MAPSS的原理是：①0°前向散射光强度可反映细胞体积大小；②10°小角度散射光强度可表明细胞结构以及核质的复杂性；③90°垂直角度散射光强度可反映细胞内部颗粒及核分叶情况；④90°垂直角度消偏振光散射强度主要用于对嗜酸细胞特征性检测目的。仪器可同时收集每个细胞来自这四个角度散射光的特征性信息，对它们进行分析和分类。而在进行网织红细胞分析时，主要依据0°、10°和90°这3个不同角度的散射光信号分析数据。进行网织红细胞分析时，Cell-Dyn 3200、3500R和3700仪器采用半自动分析法，首先将20µl血液加入到特殊的新亚甲蓝试剂中进行染色处理，经过15分钟的孵育后再将标本吸入仪器中，应用网织红细胞分析程序进行测定。红细胞和网织红细胞在10°角度具有相同的激光散射特性，但在90°偏振光照射下，网织红细胞因为被新亚甲蓝试剂染色而与成熟红细胞具有不同光散射特征，因而可被分离出来。在0°前向散射光检测上表现出体积略大于红细胞的特点。未成熟的网织红细胞含有较多的RNA，结合染料后可通过MAPSS技术显示出来。90°激光散射中会出现较强的信号，而且越高RNA含量的幼稚网织红细胞，其散射光信号越强，在散点图上也处于偏上的位置。而后期推出的Cell-Dyn 4000、Cell-Dyn Ruby（红宝石）和Sapphire（蓝宝石）型血液分析仪在网织红细胞测定上已经采用了全自动处理和测定方式，其检测精度和速度都有提高。

5.以噻唑橙为染料，以双鞘流分析技术检测网织红细胞

该方法厂家开发的具有白细胞五分类和网织红细胞分析仪功能的全自动血液分析仪器（120 retic），在网织红细胞分析上，它们采用专利的RETIXTM试剂，其含有改良后的噻唑橙（thiazole orange）荧光染料。试剂和血液样本在 35℃恒温样品杯中孵育约 25 秒，即可使试剂中的荧光染料与网织红细胞内的 RNA 特异性结合，这是作为快速全自动网织红细胞分析的前提条件。120 retic测定网织红细胞的原理和流程是：细胞荧光染色（ABX专利试剂RETIX™）——通过鞘流阻抗法测定细胞体积——DHSS（双鞘流）技术激光流式细胞仪（测定RNA含量）。标本进入独特的双鞘流池中（DHSS），首先细胞经第一次鞘流到达计数微孔（60微米孔径）应用传统的电阻抗技术进行细胞计数和体积的精确测定；后经第二次鞘流到达荧光检测区，氩离子激光器发出 488nm的蓝色激光照射到网织红细胞后，细胞内的荧光染料激发出绿色的荧光（530nm）仪器通过测定荧光强度来对网织红细胞进行计数和成熟度分析，仪器的最大检测细胞数量可多达32 000个细胞。仪器对每个细胞在通过分析通道后提供3种信息，把细胞定位在RET散点图中（X轴为细胞体积，Y轴为荧光强度），因此，能够有效区分成熟红细胞和网织红细胞，而且同样可以根据网织红细胞的成熟程度——细胞内 RNA 含量，将其划分成低荧光强度网织红细胞（Ret L）、中荧光强度网织红细胞（Ret M）和高荧光强度网织红细胞（Ret H）。

三、血红蛋白测定原理

血液分析仪血红蛋白测定原理都是相同的。被稀释的血液加入溶血剂后，红细胞溶解，释放血红蛋白，后者与溶血剂中有关成分结合形成血红蛋白衍生物，进入血红蛋白测试系统，在特定波长（一般在530～550nm）下比色，吸光度变化与液体中血红蛋白含量成正比，仪器便可显示其浓度。不同系列血液分析仪配套溶血剂配方不同，形成血红蛋白衍生物不同，吸收光谱各异，但最大吸收均接近540nm。这是因为国际血液学标准委员会（International Council for Standardization in Haematology，ICSH）推荐的氰化高铁血红蛋白（hemiglobincyanide，HiCN）法的最大吸收在540nm。校正仪器必须以HiCN值为标准。大多数系列血液分析仪溶血剂内均含有氰化钾，与血红蛋白作用后形成氰化血红蛋白（注意不是氰化高铁血红蛋白）。其特点是显色稳定，最大吸收接近540nm，但吸收光谱与HiCN有明显不同，此点在仪器校正时应十分注意。为了减少溶血剂的毒性，避免含氰血红蛋白衍生物检测后的污染，近年来，有些血液分析仪使用非氰化溶血剂（如月桂基硫酸钠，sodium lauryl sulfate，SLS法）。SLS法的反应机制是：被稀释的血液加入月桂基硫酸钠溶血剂后，红细胞溶解释放出血红蛋白，血红蛋白上珠蛋白与SLS的疏水基结合，导致其立体构造发生变化；同时亚铁血红素中的2价铁容易被亚铁血红素结合着“氧”和“溶解氧”氧化变成三价铁，3价铁的血红素与SLS的亲水基配位，形成稳定的SLS-血红蛋白，反应在10秒以内就能完成。SLS-血红蛋白在波长为535nm处有最大波峰、560nm处有肩峰的吸收曲线。在仪器内部使用波长为555nm的激光照射，测定它的吸光度，吸光度的变化与液体中血红蛋白含量成正比，测量结束仪器便可显示其浓度。实验证明，其检测结果精确性、准确性达到含有氰化物溶血剂同样水平，既保证了实验质量，又避免了试剂对人员毒性和环境污染。

上述光电比色法在测定血红蛋白浓度，当溶液中存在悬浮物质时，会导致入射光出现散射等影响吸光度的现象，从而干扰检测的准确性。在实际临床应用中，血液样本里会存在有脂质颗粒等悬浮物质，而且血液中的白细胞会在红细胞溶血处理后仍然留存悬浮在溶液中，当血液中的白细胞含量超过100×109/L时也会明显干扰吸光度的检测。此外稀释混匀不当也会造成溶液里悬微米级的微小气泡，这些都会使得吸光度因为杂散光的影响而偏离真实值，造成血红蛋白检测的假性增高。为了解决这些因素血红蛋白检测的干扰，BC6系列血液分析仪生产厂家，首先从改进溶血试剂配方上入手，改善了溶血剂对细胞膜结构的打孔和裂解能力，将有形细胞成分溶解到亚微米级别，大大降低了白细胞以及脂类颗粒对入射光散射角度的影响，减小光能损失；其次在光学结构上，通过准直入射光，增大光电探测器接收面积，进一步减小高值白细胞、悬浮颗粒等带来的干扰，如图3-4；另外通过检测组件结构和管路优化设计、时序控制等手段改善加样和样本混匀的效果，减少产生微小气泡的途径抑制微小气泡的产生，提高血红蛋白光吸收度检测的抗干扰能力；最后通过研究平行光非匀质溶液的颗粒散射模型，开发了基于通道融合的散射补偿算法，进一步提升血红蛋白检测结果的准确性。

（乐家新　丛玉隆）