第七节 质谱技术

一、质谱分析法

质谱分析（mass spectrometry，MS）是一种测量离子电荷质量比（简称荷质比，m/z）的分析方法。它是通过将试样转化为运动的气态离子，然后利用不同离子在电场或磁场运动行为的差异，将其按质量电荷比（m/z）的大小进行检测的技术。

不同质荷比的离子经质量分析器分开后，到检测器被检测并记录下来，经计算机处理后以质谱图（mass spectrum）的形式表示出来。在质谱图中，横坐标表示离子的质荷比（m/z）值，从左到右质荷比的值增大，对于带有单电荷的离子，横坐标表示的数值即为离子的质量；纵坐标表示离子流的强度，通常用相对强度来表示，即把最强的离子流强度定为100%，其他离子流的强度以其百分数表示，有时也以所有被记录离子的总离子流强度作为100%，各种离子以其所占的百分数来表示。

从有机化合物的质谱图中可以看到许多离子峰。这些峰的m/z和相对强度取决于分子结构，并与仪器类型、实验条件有关。有机化合物分子在离子化过程中可产生各种电离和断裂，即同一分子形成各种各样的离子。因此，在质谱分析中出现不同的离子峰，包括分子离子峰、碎片离子峰、同位素离子峰、重排离子峰、亚稳离子峰等。正是这些离子峰给出了丰富的质谱信息，为质谱分析法提供依据。根据质谱图中峰的位置，可以进行定性和结构分析；根据峰的强度可以进行定量分析。

二、质谱仪

质谱仪是使被分析的试样离子化并按质荷比的大小进行分离、检测和记录的仪器。其基本原理是使试样中的成分在离子化器中发生电离，生成不同荷质比的带正电荷离子，经加速电场的作用，形成离子束，进入质量分析器。在质量分析器中，再利用电场或磁场使不同质荷比的离子在空间上或时间上分离，或是通过过滤的方式，将它们分别聚焦到检测器而得到质谱图，从而获得质量与浓度相关的图谱。

质谱仪由真空系统、进样系统、离子化器、质量分析器、检测器、计算机系统（质谱工作站）等组成。其中最核心的是离子化器、质量分析器（图2-17）。

（一）真空系统

一般真空系统由机械真空泵和扩散泵或涡轮分子泵组成。质谱仪的离子源、质量分析器、检测器都必须在高真空条件下工作，一般要求10-6~10-4Pa。其中质量分析器对真空的要求最为严格。因为无论哪种类型的质量分析器都是利用离子运动状态的差异将其按m/z分开，所有离子在从离子源到达检测器整个运动过程中应避免与其他粒子（气体分子）相互作用。

（二）进样系统

目前用于有机分析的有机质谱仪的进样装置包括直接进样器、气相色谱仪和液相色谱仪。直接进样器是一个专门设计的进样装置，它是将试样置于离子源的高真空下加热气化。此进样方式一般用于固体或难挥发的液体纯试样，缺点是不能分析混合物。

将气相色谱仪（GC）和液相色谱仪（HPLC）当作进样装置与质谱仪（MS）连接，成为GC-MS和HPLC-MS，可起到进样的作用，同时也将色谱强的分离能力和质谱的高鉴别能力结合起来。

（三）离子化器

离子化器（ionization detector）是使中性原子或分子电离，并从中引出离子束流的装置。针对不同类型的样品采用不同的离子源：采用气态样品的有电子电离源（electron ionization，EI）、化学电离源（chemical ionization，CI）；采用液态样品的有电喷雾电离源（electrospray ionization，ESI）、声波喷雾电离（sonic spray ionization，SSI）、大气压力化学电离源（atmospheric pressure chemical ionization，APCI）、大气压光离子源（atmospheric pressure photoionization，APPI）；其他离子化源包括基质辅助激光解吸电离源（matrix-assisted laser desorption/ionization，MALDI）、表面增强激光解吸电离源（surface-enhanced laser desorption/ionization，SELDI）、电感耦合等离子体（inductively coupled plasma，ICP）、快离子轰击离子源（fast atom bombardment，FAB）（表2-4）。

在MS技术发展过程中，由于电离技术的制约，在相当长的一段时间内，MS只能对小分子的分子质量进行准确、灵敏的测定，但随着电喷雾电离、基质辅助激光解吸电离以及大气压化学电离等电离技术的出现，MS的测定范围大大提高。它们在高极性、难挥发性和热不稳定性生物大分子（如蛋白质和核酸）的分析研究中极具应用潜力，其能在10-15mol甚至10-18mol的水平上准确地分析分子质量高达几十万的生物大分子，从而开拓了质谱学中一个崭新的领域——生物MS，促使MS技术在生命科学领域获得广泛应用。

1.电子电离源（electron ionization, EI）

EI是应用最为广泛的离子源，它主要用于挥发性样品的电离。图2-18是电子电离源的原理图，由GC或直接进样杆进入的样品，以气体形式进入离子源，由灯丝（阴极）发出的电子与样品分子发生碰撞使样品分子电离。一般情况下，阴极与接收极（阳极）之间的电压为70V，所有的标准质谱图都是在70eV下做出的。在70eV电子碰撞作用下，有机物分子可能被打掉一个电子形成分子离子，也可能会发生化学键的断裂形成碎片离子。由分子离子可以确定化合物分子量，由碎片离子可以得到化合物的结构。

电子电离源主要适用于易挥发有机样品的电离，GC-MS联用仪中都有这种离子源。其优点是工作稳定可靠，结构信息丰富，有标准质谱图可以检索。缺点是只适用于易汽化的有机物样品分析。

2.化学电离源（chemical ionization, CI）

有些化合物稳定性差，用EI方式不易得到分子离子，因而也就得不到分子量。为了得到分子量可以采用CI电离方式。CI和EI在结构上没有多大差别，或者说主体部件是共用的。其主要差别是CI源工作过程中要引进一种反应气体，反应气体可以是甲烷、异丁烷、氨等。反应气体的量比样品气体要大得多。灯丝发出的电子首先将反应气电离，然后反应气离子与样品分子进行离子-分子反应，并使样品气电离。

CI的主要用途是通过准分子离子峰确定有机化合物的相对分子质量。CI的重复性差，由CI得到的质谱不是标准质谱。

3.电喷雾电离源（electrospray ionization, ESI）

电喷雾过程实质上是电泳过程。样品溶液流出质谱仪进样端毛细管喷口后，在强电场（3~6kV）作用下迅速雾化，在雾化气中形成带电雾滴（taylor锥体）。通过高压电场可以分离溶液中的正离子和负离子，例如在正离子模式下，电喷雾电离针相对真空取样小孔保持很高的正电位，负电荷离子被吸引到针的另一端，在半月形的液体表面聚集着大量的正电荷离子。带电粒子前进的路径设计成真空度不断增加的差动抽气形式，带电离子中的溶解不断蒸发，随着溶剂的蒸发，液滴的变小，电场强度逐渐加强，通过离子蒸发（离子向液滴表面移动并从表面挥发）等机制，大部分分析物形成带单电荷或多电荷的气态离子，进入质量分析器。ESI的特点是产生多电荷离子而不是碎片离子，所形成的多电荷离子可直接用来灵敏准确地确定多肽与蛋白质的分子质量（图2-19）。

ESI-MS的最新技术之一是极低流速下的电喷雾技术，称为毫微电喷雾（nano-ESI）。与常规ESI不同，nano-ESI的喷雾毛细管末端由镀金的硼硅玻璃制成，孔径仅1~3μm。样品溶液依靠毛细管作用，在高电场作用下以10~100nL/min的流速流出，在毛细管末端形成电喷雾，产生极细的带电液滴，其体积仅为常规ESI所产生的液滴的1/1 000~1/100。nano-ESI产生的液滴体积小，其去溶剂化效率、离子化效率及离子转移至分析器的效率都比常规ESI高，且喷雾稳定性好。在分析痕量样品时，能在很长时间内采集MS信号，通过累加获得较高的检测灵敏度。nano-ESI固有的低流速（30nL/min）和高离子信号强度恰好与离子阱MS相匹配，连续断裂可达七级MS裂解，用于分析复杂低聚糖可得到有价值的结构信息。

目前商品化ESI-MS仪的接口方式已采用nano-ESI，分为静态和动态两种：静态mano-ESI装置常用于鉴定蛋白质，其工作原理为：将细孔nano-ESI尖端装满蛋白液置于探针上，将探针放在离子源中，蛋白液以10~100nL/min的流速喷射，进入质量分析器进行检测。而动态nano-ESI装置常与毛细管电泳、毫微毛细管液相色谱或毛细管电层析联用，将LC的高分离效能与MS准确鉴定化合物结构的特点相结合，可用于复杂样品的分析。

ESI技术的优势是容易与最常见的肽分离技术，如HPLC和CE在线联用。电喷雾电离源是一种软电离方式，即使分子量大、稳定性差的物质，也不会在电离过程中发生分解，它适合于分析极性强的大分子有机物，如蛋白质、糖等。

4.大气压化学电离源（atmospheric pressure chemical ionization, APCI）

它的结构与电喷雾电离源基本相同。不同之处在于APCI喷嘴的下游放置一个针状放电电极，通过放电电极的高压放电，使得空气中某些中性分子电离，产生H₃O+、N₂+、O₂+等离子，溶剂分子也会被电离，这些离子与被分析物分子进行离子-分子反应，使分析物分子离子化（图2-20）。

大气压化学电离源的用途与ESI类似，但是它特别适合于分析中等极性的有机化合物。也常采用与LC联用的方式。

5.基质辅助激光解吸电离（matrix-assisted laser desorption/ionization, MALDI）

基质辅助激光解吸电离是在激光解吸电离质谱（LDI-MS）的基础上发展起来的。LDI-MS是分析难挥发性有机物的手段之一，曾用于分析合成聚合物和热不稳定性生物小分子。直至1988年，由K Tanaka和F Hillenkamp领导的两个研究小组分别提出基质辅助激光解吸电离质谱技术，使LDI-MS可以用于生物大分子的分析。

MALDI的原理是：首先将分析样品和基质形成共结晶，即将试样溶液（μmol/L级浓度）与适当的基质溶液（mmol/L级浓度），例如芥子酸、2、5二羟基苯甲酸等，混合涂敷到不锈钢的靶面上，溶液挥发后即有固体混合物形成。然后用高功率（其频率与基质分子的最大吸收频率相一致）的紫外激光照射到样靶上，激光光束的能量优先被基质的发色团吸收，从而保护了样品。基质分子吸收激光的能量，并以最快的速度传递给试样分子，使微量的试样产生瞬间相变，即刻被解吸和电离，避免了热不稳定物质的分解。分析物所产生的离子被引入质量分析器（如飞行时间质谱仪）进行分析处理（图2-21）。

MALDI特别适合于难挥发、热不稳定的生物大分子的分析。与ESI相比，它的最大优点是允许样品中含有较高浓度的缓冲液、盐、非挥发性成分及去垢剂，只要这些物质不影响共结品的性质，便可直接用冷水冲去样品靶上过量的这些物质。此外，MALDI还具有以下优点：灵敏度比其他离子化方法高，可对混合样品进行直接分析；易产生分子离子峰，便于光谱解析；可直接与双向凝胶电泳（2-DE）技术联用，加快了蛋白质快速鉴别及大规模筛选进程。但MALDI-MS存在重复性差的缺点，因此不适用于定量分析。尽管MALDI-MS在分析蛋白质和较小或中等片段的寡聚核苷酸方面已取得了很大进展，但由于受到基质选择的限制，它还不能成为多糖、糖蛋白、核苷酸等的有效分析手段。

6.表面增强激光解吸电离（surface-enhanced laser desorption/ionization, SELDI）

它是激光解吸电离的另一种形式，与MALDI分析原理基本相同，只是在样品处理上存在差异。它是将样品经过简单的预处理后直接滴加到表面经过特殊修饰的芯片上，样品中待分析的分子通过特异的作用被捕获。之后再经紫外激光照射离子化，最后进入质量分析器（如飞行时间质谱仪）进行分析处理。

SELDI可比较两个样品之间的差异蛋白，也可获得样品的蛋白质谱，因此，在应用方面具有显著优势。SELDI技术分析的样品不需用液相色谱或气相色谱预先纯化，因此可用于分析复杂的生物样品。SELDI技术可以分析疏水性蛋白质、PI过高或过低的蛋白质以及低分子质量的蛋白质（< 25kD），还可以发现在未经处理的样品中许多被掩盖的低浓度蛋白质，增加发现生物标志物的机会。SELDI技术只需少量样品，在较短时间内就可以得到结果，且试验重复性好，适合临床诊断及大规模筛选与疾病相关的生物标志物，特别是它可直接检测不经处理的尿液、血液、脑脊液、关节腔滑液、支气管洗出液、细胞裂解液和各种分泌物等，从而可检测到样品中目标蛋白质的分子量、PI、糖基化位点、磷酸化位点等参数。

7.电感耦合等离子体（inductively coupled plasma, ICP）

等离子体（plasma）是一种由自由电子、离子、中性原子与分子组成的具有一定电离度，但在整体上呈电中性气体。简单地说，它就是“电离气体”。

ICP的原理是：当有高频电流通过线圈时，产生轴向磁场，用高频点火装置产生火花，以触发少量气体电离，形成的离子与电子在电磁场作用下，与其他原子碰撞并使之电离，形成更多的离子和电子。当离子和电子累积到使气体的电导率足够大时，在垂直于磁场方向的截面上就会感应出涡流，强大的涡流产生高热将气体加热，瞬间使气体形成最高温度可达9 726.85℃（10 000K）左右的等离子焰炬。当载气携带试样气溶胶通过等离子体时，可被加热至5 726.85~7 726.85℃（6 000~8 000K），从而进行离子化。

ICP常与四极杆质量分析器联用，用于痕量、超痕量元素分析和同位素比值分析。

（四）质量分析器

质量分析器（mass spectrometer）是质谱仪的重要组成部件，位于离子源和检测器之间，依据不同方式将离子源中生成的样品离子按质荷比m/z的大小分开。用于有机质谱仪的质量分析器有四极杆质量分析器、飞行时间质量分析器、磁质量分析器、离子阱质量分析器、傅里叶变换离子回旋共振质量分析器。用于无机质谱的质量分析器有四极杆质量分析器（滤质器）、飞行时间质量分析器等。

1.四极杆质量分析器（quadrupole mass spectrometer）

又称四极杆滤质器（quadrupole mass filter）。四极杆是其核心，它是由四根精密加工的电极杆以及分别施加于x、y方向两组高压高频射频组成的电场分析器。由四根平行的截面为双曲面或圆形的不锈钢杆组成，对角电极相连构成两组，在两组电极上施加直流电压U和射频交流电压V₀cosΩt，在极间形成一个射频场，正电极的电压为+（U-V₀ cosΩt），负电极为-（U-V₀ cosΩt），如图2-22。

离子被高达20V的加速电压从离子源引入四极电场。进入四极场空间的正离子被瞬间带正电的极杆排斥，而被带负电的极杆吸引。因为极杆组的正负电位不断交变，所以离子沿着不规则的振荡路径在极间运动。在一定条件下，只有一种特定质荷比的离子才会通过稳定的振荡进入检测器，发出信号。其他离子则因振荡轨迹不稳定，在运动过程中撞击到电极上而被“过滤”掉，最后被真空泵抽走。

四极杆质量分析器是目前最成熟、应用最广泛的质量分析器之一。对于单一的分析任务，可用常规的GC/MS和LC/MS完成。在研究级应用中，常涉及质谱仪器多级串联MS系统，而四极杆质量分析器则是串联MS中最常用的类型。最常见的系统为三级串联四极杆质谱中，将3个四极杆质量分析器串联起来，组成QqQ序列，如图2-23所示。其中，Q（包括Q1和Q3）是正常的质量分析器，q上没有直流电压而只有射频成分，该射频场使所有离子聚焦并允许所有离子通过。因此，q相当于磁质谱中的无场区，离子在其中可发生亚稳碎裂或碰撞诱导解离（CID）。Q1能够从离子源中选择感兴趣的离子，使其在q2中发生解离反应，最后将解离产物送至Q3进行常规质谱分析，从而可推断分子的组成结构。更复杂的串联系统可将5个四极杆组成QqQqQ序列，形成3个分析器和2个反应室，从而可进行MS/MS/MS实验。理论上最多可实现十级串联四极杆，但在实际应用中，最常用的是三级串联四极杆质量分析系统，是目前串联质谱中最主流的形式。

四极杆质量分析器应用广泛，与四极杆质量分析器联用的离子源，用于气体分析常用EI和CI。其他有机物分析常用API和激光解吸电离（LDI）。对于无机物的分析，可与ICP组成电感耦合等离子体四极杆质谱仪。四极杆质量分析器还可与飞行时间质量分析器组成四极杆飞行时间串联质谱（QTOF），它可以看作是将三重四极杆质谱的第三重四极杆换为TOF质量分析器。它采用四极杆作为质量过滤器，以TOF作为质量分析器，分辨率和质量精度明显优于三重四极杆质谱，是一类能够同时定性定量的质谱。

2.飞行时间质量分析器（time-of-flight, TOF）

用一个脉冲将离子源中的离子瞬间引出，经加速电压加速，它们具有相同的动能而进入漂移管，荷质比最小的离子具有最快的速度因而首先到达检测器，而重的离子由于速度较慢会最后到达检测器。由此形成的TOF的线性模式（图2-24）。

此外，还有TOF反射模式，即在原来单个飞行管的反射角度上再增加一个飞行管、检测器、反射电场，这样进一步增加了飞行距离，提高了分辨率。其原理是：初始化能量不同的相同离子，到达反射电场后，动能大的“刺”得深，动能小的“刺”得浅，反射到检测器即可实现时间聚焦。反射飞行器（reflectron）技术的运用进一步提高了仪器的质量精度、分辨率和灵敏度。为了进一步提高分辨率，近年在TOF仪上引进了一项新技术，称为“延迟引出（DE）”技术或称“脉冲离子引出（PIE）”技术。

与TOF联用的离子源最常见的是MALDI，由于MALDI分析时激光是以脉冲方式使分子电离，恰好与TOF检测器相匹配，并组成了基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF-MS）。此外EI、ESI和APCI也可作为离子源。

3.离子阱质量分析器（ion trap, IT）

离子阱质量分析器属于动态质谱，与四极杆质量分析器有很多相似之处。在环电极上接入变化的射频电压，此时处于阱中具有合适的m/z离子将在环中指定的轨道上稳定旋转，若增加该电压，则较重离子转至指定稳定轨道，而轻些的离子将偏出轨道并与环电极发生碰撞。当一组由电离源（化学电离源或电子轰击源）产生的离子由上端小孔进入阱中后，射频电压开始扫描，陷入阱中离子的轨道则会依次发生变化而从底端离开环电极腔，从而被检测器检测。

与四极杆质谱类似，离子阱质量分析器也可实现多级串联质谱。它还可以与四极杆联用，形成四极杆离子阱质谱仪（quadrupole ion trap，QIT），例如用胰蛋白酶酶解蛋白质，HPLC分离酶解肽段，电喷雾四极杆离子阱质谱（ESI-QIT-MS）在线测定完整肽段的分子量，同时结合碰撞诱导解离（CID）技术获得肽段的MS/MS谱。

离子阱具有很多优点，如结构简单，性价比高；灵敏度高，较四极质量分析器高10~1 000倍；质量范围大，早期只能用于无机分析，目前采用新的离子源可用于有机物分析。这些优点使得离子阱质谱计在物理学、分析化学、医学、环境科学、生命科学等领域中获得了广泛的应用。

4.傅里叶变换离子回旋共振质量分析器（Fourier transform ion cyclotron resonance, FTICR）

简称傅里叶变换质谱仪（FT-MS）。这是一种根据给定磁场中的离子回旋频率来测量离子质荷比（m/z）的质谱分析方法。它具有几个优点：①分辨率极高，远远超过其他质量分析器；②分析灵敏度高；③可与任何离子源联用，应用范围广。缺点是仪器售价和运行费用昂贵，目前在常规分析中很少用。

（五）检测器

其作用是接收被分离的离子，放大和测量离子流的强度。最常用的是电子倍增器。为了提高分析效率，可采用隧道电子倍增器。此外，还有法拉第筒、照相版等。

三、质谱仪类型

质谱仪种类非常多，工作原理和应用范围也有很大的不同。从应用角度进行分类，可分为有机质谱仪和无机质谱仪。

（一）有机质谱仪

主要用于有机化合物的结构鉴定，它能提供化合物的分子量、元素组成以及官能团等结构信息。由于应用特点不同，又可分为：

1.气相色谱-质谱联用仪（GC-MS）

在这类仪器中，由于质谱仪工作原理不同，又有气相色谱-四极质谱仪、气相色谱-飞行时间质谱仪、气相色谱-离子阱质谱仪等。

2.液相色谱-质谱联用仪（LC-MS）

液相色谱-四极质谱仪、液相色谱-离子阱质谱仪、液相色谱-飞行时间质谱仪，以及各种各样的液相色谱-质谱-质谱联用仪。

3.其他有机质谱仪

主要有基质辅助激光解吸飞行时间质谱仪（MALDI-TOF-MS）、傅里叶变换质谱仪（FT-MS）等。

（二）无机质谱仪

无机质谱仪主要用于无机元素微量分析和同位素分析等方面。无机质谱仪与有机质谱仪工作原理不同的是物质离子化的方式不一样，无机质谱仪是以电感耦合高频放电（ICP）或其他的方式使被测物质离子化。包括辉光放电质谱仪（GD-MS）、二次离子质谱仪（SI-MS）、火花源质谱仪（SS-MS）、加速器质谱仪（A-MS）、激光电离质谱仪（LI-MS）、热电离质谱仪（TIMS）、电感耦合等离子体质谱仪（ICP-MS）等。

四、串联质谱

串联质谱（tandem mass spectrometry，TMS或MS/MS）是在单极MS基础上引入第二级质谱形成的（图2-25）。串联质谱可分为空间串联和时间串联两种。空间串联是由几个质量分析器串联而成，不同的分析器和离子源间可进行多种组合，构成不同性能的MS仪，如ESI-IT-MS、MALDI-TOF-MS等。两种不同类型的MS串接在一起可以形成二维MS，如四极杆MS与TOF-MS的串联（Q-TOF-MS）。另外，为降低复杂样品的分析难度，可将具有很好分离能力的毛细管HPLC、CE或CEC与MS联用，从而充分利用二者的优点，既能提高分离效率，简化分析体系，又能保证分析的准确性，大大扩展了MS的应用范围。

目前，串联MS以三重四极杆串联MS（TQMS）为主，它可进行二级MS裂解。TQ-MS的一个显著优点是可对未知化合物进行定量和定性分析，尤其是ESI与TQ-MS联用后，可扩大TQ-MS的质量检测范围，但其缺点是分辨率较低。

MALDI-Q-TOF-MS将MALDI离子源与四极杆和TOF两个质量分析器串联，既可测定肽质量指纹谱，又可通过MS-MS测定肽序列标签。MALDITOF-TOF-MS则是将2个TOF质量分析器串联在一起，不但具有MALDI-Q-TOF-MS的优点，同时还具有高能碰撞诱导解离（CID）能力，使MS真正成为高通量的蛋白质测序工具。

傅里叶变换离子回旋共振质谱（FT-ICR-MS）是时间串联MS，分辨率和准确度很高，并有多级MS功能，且可直接与2-DE联用。离子阱MS可通过改变阱里射频场达到10级MS裂解。

五、质谱在临床检验中的应用

（一）新生儿筛查

遗传代谢病就是有代谢功能缺陷的一类遗传病，多为单基因遗传病，包括代谢大分子类疾病：包括溶酶体贮积症（三十几种病）、线粒体病等；代谢小分子类疾病：氨基酸、有机酸、脂肪酸等。传统检测方法需要对每一种筛查项目进行一次单独实验，LCMS/MS则可对一份标本同时检测多种项目。目前已报道的遗传代谢病有600余种，MS/MS的遗传代谢病筛查可以对其中约50种进行筛查，具体病种依不同地区而异，做到用一滴血样，在几分钟内一次分析近百种代谢物，检测多种遗传代谢病。

一般采用软电离，如电喷雾电离，结合三级串联四极杆质量分析系统，组成ESI-QqQ串联质谱进行检测。使用一次性采血针刺新生儿足跟，时间为出生后72h~7d，将血滴在特殊的滤纸样本卡上，打孔后置于96孔板中，加入同位素内标，经甲醇抽提，氮气吹干，盐酸加热酸化，再次氮气吹干完全干燥，在有机相中溶解，进行上样测定。

（二）固醇类物质的测定

固醇类物质的特征是有一个四环的母核，其结构是环戊烷多氢菲，都是从乙酰辅酶A生物合成路径所衍生的。种类繁多，包括固醇类、维生素D、胆汁酸、肾上腺皮质素、性激素以及致癌烃类等。

传统上采用免疫学方法测定，GC-MS可用于未结合型类固醇的检测，快原子轰击离子源质谱（FAB-MS）可检测结合型类固醇，而HPLC-MS可同时检测结合型和未结合型类固醇。但是HPLC结合串联质谱具有敏感性高、重复性好、特异性强等特点，目前在临床常规生化检验中应用越来越广泛。离子化源一般采用电喷雾离子源（ESI）或大气压化学电离（APCI），结合三级串联四极杆质量分析系统组成HPLC-MS/MS。

激素水平检测和先天性肾上腺增生等疾病的诊断。固醇类激素一般可用GC-MS或免疫分析方法检测，运用LC-MS/MS可提高特异性，并且不需要复杂的样品处理；LC-MS/MS在药物滥用及兴奋剂检测方面也具有重要意义，它可以检测合成代谢类激素，如雄烯二酮、睾酮和双氢睾酮等，相对其他方法灵敏度更高；诊断先天性肾上腺增生通常采用免疫学方法测定17-羟孕酮、氢化可的松、雄烯二酮，假阳性率非常高，用LC-MS/MS，可将假阳性率降低约85%；LC-MS/MS的检测结果对良性前列腺增生与其他有临床表现的雄激素依赖性疾病的鉴别诊断也有重要价值，还可用于甲状腺疾病的诊断。

血液中维生素D的检测：维生素D在血液中主要以25（OH）D的形式运输，其浓度最高，最稳定，半衰期最长（2周左右），因此血清25（OH）D浓度是评价体内维生素D营养状况最为有效的指标。通常将25（OH）D > 30ng/mL、20~30ng/mL、< 20ng/mL分别定义为维生素D充足、不足或缺乏。目前认为LC-MS/MS同时测定25（OH）D₂和25（OH）D₃是最理想的临床检测方法。

（三）治疗药物监测

目前治疗药物监测（TDM）主要通过免疫化学方法，简单易行但所测药物种类较少。LC-MS/MS技术准确性更高而且可用于绝大部分药物的监测。研究证明大多数抗癌药都可以通过LC-MS/MS进行准确检测，比如环磷酰胺、顺铂、5-氟尿嘧啶等，而且还可以同时检测多种抗癌药物，不仅减轻了患者负担，而且提高了临床工作效率。移植后患者需要应用大量免疫抑制剂以减少免疫排斥反应发生，免疫抑制剂只有在特定浓度范围内才能发挥理想作用。免疫抑制剂在不同个体以及人群之间的药物动力学特征差别很大，LC-MS/MS可更加准确地进行测定。LC-MS/MS还可以测定唾液样本中的环孢素浓度，这也是其他方法无法实现的。LC-MS/MS还可用于抗HIV感染的逆转录酶抑制剂拉米夫定和齐多夫定浓度监测、抗生素临床用量以及心血管药物浓度监测等方面。

（四）无机离子的检测

1.电感耦合等离子体质谱仪（inductively coupled plasma mass spectrometry, ICP-MS）

以独特的接口技术将电感耦合等离子体（ICP）的高温电离特性与四极杆质谱仪的灵敏快速扫描的优点相结合而形成的一种新型的元素和同位素分析技术。该技术具有检出限极低、动态线性范围极宽、谱线简单、干扰少、分析精密度高、分析速度快以及可提供同位素信息等分析特性，是目前公认的多元素同时分析的最好技术，应用非常广泛。

构造包括进样系统、电感耦合等离子体离子源（ICP）、接口（采样锥和截取锥）、离子光学系统、四极杆质谱仪（MS）、检测器和内置于质谱仪中的真空泵系统，外部连接有循环冷却水装置、气路。整个仪器由计算机软件进行控制。

2.同位素稀释质谱法（isotopie dilution mass spectrometry, ID-MS）

ID-MS是一种准确的化学成分定量分析方法，该方法借助于同位素质谱的精密测量与化学计量的准确称重，来求得某一机体中的同位素、元素或分子个数。国际化学计量委员会的物质量咨询委员会（ICPM-CCQM）在1995年的会议上确认了同位素稀释-质谱法、精密库仑法、重量法、电位滴定法、凝固点下降法是具有“可提供权威性的化学测量方法。其中，同位素稀释质谱法，是唯一能直接提供微量、痕量和超痕量的权威方法”。

同位素稀释质谱法原理：在未知样品中加入已知量的浓缩同位素（即稀释剂），在稀释剂与样品中的天然丰度同位素达到混合平衡后，用质谱测量混合样品中同位素丰度比，待测元素含量可直接由测量比值计算出来。由于被测量的同位素比值精密度很高，重复性很好。因此，可获得高精度和准确度的浓度测量结果。在临床生化检验中一般作为决定性方法。

（五）蛋白质标志物的筛查和鉴定

1.基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry, MALDI-TOF-MS）

是用基质辅助激光解吸电离（MALDI）作为离子化源，飞行时间（TOF）作为质量分析器组成的质谱仪。MALDITOF-MS具有灵敏度高、准确度高及分辨率高等特点，为生命科学等领域提供了一种强有力的分析测试手段，并正扮演着越来越重要的作用。它可用于肽质量指纹谱分析（peptide mass fingerprinting，PMF）、肽序列标签分析（peptide sequence tag，PST）、蛋白质分子量的测定和寡核苷酸分析等。

2.表面增强激光解吸电离飞行时间质谱（surface-enhanced laser desorption/ionization-time of flight-mass spectrometry, SELDI-TOF-MS）

主要由三部分组成，即蛋白质芯片（protein chip）、芯片阅读器（protein chip reader）和分析软件。

（1）蛋白质芯片：

根据芯片表面修饰的不同可分为化学表面芯片和生物表面芯片。化学表面芯片又可分为疏水（hydrophobic surface，H4）、亲水（normal phase，NP）、弱阳离子交换（weak cation exchange，WCX）、强阴离子交换（strong anion exchange，SAX）、金属离子螯合（immobilized metal affinity capture，IMAC）等。这些芯片可以根据蛋白质的化学特性如疏水或亲水性及所带电荷而选择性的捕获特异蛋白质。其优点是：①直接用体液样本进行分析，如血清、尿、脑脊液等；②样品量少，只需0.5~5μL，或2 000个细胞即可检测；③高通量，操作自动化；④可发现低丰度、小分子量蛋白质，并能测定疏水蛋白质特别是膜蛋白质。生物表面芯片是利用特异的生物学反应从而分离某一特异蛋白质。可分为抗原-抗体、受体-配体、DNA-蛋白质、酶-底物等芯片。其特点是①特异性高；②可以定量，如利用单克隆抗体芯片，由于结合至芯片上的抗体是定量的，故可以测定抗原量，但一般飞行质谱不能用于定量分析；③功能广，如利用单克隆抗体芯片，可鉴定未知抗原/蛋白质，以减少测定蛋白质序列的工作量，还可替代蛋白质印迹法（Western blot）等。

蛋白质芯片上有8~24个上样点，根据检测目的不同选用不同种类的芯片。将样本加到芯片上以后，经过一段时间的结合反应，芯片能和复杂样本中的特定蛋白质结合，然后用缓冲液或水洗去不结合的非特异分子，就可获得保留的高分辨率的蛋白质谱，再加上能量吸收分子溶液，当溶液干燥后，就可以把芯片放到芯片阅读器中进行质谱分析。

（2）芯片阅读器：

实际上就是激光解吸电离飞行时间质谱仪（MALDI-TOF-MS）。在一定强度的激光打击下，结合在芯片上的蛋白质发生电离和解吸附，不同质量的带电离子在通过电场时被加速。由于这些离子的质量电荷比不同，它们在真空场中飞行的时间长短不一致，记录仪通过检测飞行时间的长短，得出质量电荷比。被测定的蛋白质以一系列峰的形式出现，绘制成质谱图，直接显示样本中各种蛋白质的分子量、含量等信息。整个测定过程可在几十分钟内完成，方法敏感、特异性高，不会破坏所测定蛋白质的结构。该技术可检测微量蛋白质，检测极限为1fmol。

（3）分析软件：

SELDI软件能快速处理、分析大量的质谱图信息。将正常人与某种疾病患者的图谱比较，就能发现和捕获疾病的特异性相关蛋白质。

（六）微生物鉴定

LC-MS/MS可对细菌的多种成分进行分析，包括蛋白质、脂类、脂多糖（LPS）和脂寡糖（LOS）、DNA、多肽及其他可被离子化的分子。菌体内某些成分，能给出唯一的m/z作为生物标志特异地鉴定细菌。例如，通过对种间和株间特异保守峰如3羧基脂肪酸（内毒素的标志物）、麦角固醇（真菌数量的标志物）、胞壁酸（肽聚糖的标志物）等进行分析，可以进行细菌识别。蛋白质在细菌体内的含量较高，常用于细菌属、种和株的鉴定。LPS和LOS是革兰氏阴性菌的外部细胞膜成分，是细菌毒性的主要组成部分，其混合物易于提取，去除脂肪酸残基后肼解，对产物进行质谱分析，可用于血清型分类。

（徐克前）