第六节 层析技术

层析技术（chromatographic technique）又称色谱法，是一种基于被分离物质的物理、化学及生物学特性的不同，使它们在某种基质中移动速度不同而进行分离和分析的方法。例如：物质在溶解度、吸附能力、立体化学特性及分子的大小、带电情况及离子交换、亲和力的大小及特异的生物学反应等方面的差异，可以利用其在流动相与固定相之间的分配系数不同，达到彼此分离的目的。

一、层析的基本概念

（一）固定相

固定相是层析的一个基质。它可以是固体物质（如吸附剂、凝胶、离子交换剂等），也可以是液体物质（如固定在硅胶或纤维素上的溶液），这些基质能与待分离的化合物进行可逆的吸附、溶解、交换等作用。它对层析的效果起着关键的作用。

（二）流动相

在层析过程中，推动固定相上待分离的物质朝着一个方向移动的液体、气体或超临界体等，都称为流动相。柱层析中一般称为洗脱剂，薄层层析中称为展层剂。它也是层析分离中的重要影响因素之一。

（三）分配系数

分配系数是指在一定的条件下，某种组分在固定相和流动相中含量（浓度）的比值，常用K来表示。分配系数是层析中分离纯化物质的主要依据。

K=Cs/Cm

其中Cs：固定相中的浓度，Cm：流动相中的浓度。

（四）迁移率

在一定条件下，在相同的时间内某一组分在固定相移动的距离与流动相本身移动的距离之比值。常用Rf来表示，Rf大于或等于1。可以看出，K增加，Rf减少；反之，K减少，Rf增加。

实验中还常用相对迁移率的概念。相对迁移率是指：在一定条件下，在相同时间内，某一组分在固定相中移动的距离与某一标准物质在固定相中移动的距离之比值。它可以小于等于1，也可以大于1。用Rx来表示。

不同物质的分配系数或迁移率是不同的。分配系数或迁移率的差异程度是决定几种物质采用层析方法能否分离的先决条件。很显然，差异越大，分离效果越理想。

分配系数主要与下列因素有关：①被分离物质本身的性质；②固定相和流动相的性质；③层析柱的温度。

（五）分辨率

分辨率一般定义为相邻两个峰的分开程度，用Rs来表示，作为衡量层析柱分离总效能的综合指标。层析峰之间距离远，层析峰峰窄，代表分辨率高。如图2-13代表HPLC分离体液中的氨基酸组分的层析图谱。

二、层析技术分类

层析根据不同的标准可以分为多种类型。

（一）根据固定相基质的形式分类

层析可以分为纸层析、薄层层析和柱层析。

（1）纸层析：指以滤纸作为基质的层析。

（2）薄层层析：将基质在玻璃或塑料等光滑表面铺成一薄层，在薄层上进行层析。

（3）柱层析则是指将基质填装在管中形成柱形，在柱中进行层析。

纸层析和薄层层析主要适用于小分子物质的快速检测分析和少量分离制备，通常为一次性使用，而柱层析是常用的层析形式，适用于样品分析、分离。生物化学中常用的凝胶层析、离子交换层析、亲和层析、高效液相色谱等通常采用柱层析形式。

（二）根据流动相的形式分类

层析可以分为液相层析和气相层析。

（1）气相层析是指流动相为气体的层析。气相层析测定样品时需要气化，大大限制了其在生化领域的应用。

（2）液相层析指流动相为液体的层析。根据其流动相的压力大小分为普通液相层析、高效液相层析和超高效液相层析。液相层析是生物领域最常用的层析形式，适用于许多生物样品的分析、分离。

（三）根据流动相和固定性的极性分类

根据流动相和固定性的极性可分为正相色谱与反相色谱。

（1）正相色谱是指固定相的极性高于流动相的极性，因此，在这种层析过程中非极性分子或极性小的分子比极性大的分子移动的速度快，先从柱中流出来。

（2）反相色谱是指固定相的极性低于流动相的极性，在这种层析过程中，极性大的分子比极性小的分子移动的速度快而先从柱中流出。

一般来说，分离纯化极性大的分子（带电离子等）采用正相色谱（或正相柱），而分离纯化极性小的有机分子（有机酸、醇、酚等）多采用反相色谱（或反相柱）。

（四）根据分离的原理分类

根据分离的原理不同层析主要可以分为吸附层析、分配层析、凝胶过滤层析、离子交换层析、亲和层析等。（图2-14、图2-15）

（1）离子交换层析（ion exchange chromatography）：

以离子交换剂为固定相，根据物质的带电性质不同而进行分离的一种层析技术。

（2）分配层析（partition chromatography）：

根据在一个有两相同时存在的溶剂系统中，不同物质的分配系数不同而达到分离目的的一种层析技术。

（3）吸附层析（adsorption chromatography）：

以吸附剂为固定相，根据待分离物与吸附剂之间吸附力不同而达到分离目的的一种层析技术。

（4）凝胶过滤层析（gel filtration chromatography）：

以具有网状结构的凝胶颗粒作为固定相，根据物质的分子大小进行分离的一种层析技术。

（5）亲和层析（affinity chromatography）：

根据生物大分子和配体之间的特异性亲和力（如酶和底物、抗体和抗原、激素和受体等），将某种配体连接在载体上作为固定相，而对能与配体特异性结合的生物大分子进行分离的一种层析技术（图2-15）。亲和层析是分离生物大分子最为有效的层析技术，具有很高分辨率。

三、主要的层析技术

（一）薄层层析

薄层层析（thin-layer chromatography，TLC）是将固定相与支持物制作成薄板或薄片，流动相流经该薄层固定相而将样品分离的层析系统（图2-16）。按所用固定相材料不同，有吸附、分配、离子交换、凝胶过滤等薄层层析。其特点是样品用量少、分析快速、设备简单。

（二）柱层析

柱层析（column chromatography）是最常用的层析类型。普通柱层析装置简单，一般包括固定相、流动相、层析柱和检测器等。其过程包括：首先根据分离物质的特性，选择合适的固定相（离子交换剂、凝胶、亲和吸附剂等）和流动相；对固定相进行预处理；装柱；平衡；样品上柱及洗脱；洗脱液的检测分析等。

柱层析在临床生化检验中常用。例如用Bio-Rex 70阳离子交换树脂作为固定相，不同pH的磷酸盐缓冲液作为流动相检测糖化血红蛋白。如采用硼酸缓冲液作为流动相还可用于儿茶酚胺激素的测定。

（三）气相层析

气相层析（gas chromatography，GC）是一种特殊的柱层析，是用气体作流动相的色谱。根据所用的固定相不同，气相层析可以分为两种，用固体吸附剂作固定相的叫气固层析，用涂有固定液的单体作固定相的叫气液层析。按层析分离原理气相层析可分为吸附层析和分配层析两类，在气固层析中，固定相为吸附剂，气固层析属于吸附层析，气液层析属于分配层析。

气相层析一般用气相色谱仪完成。其基本构造有两部分，即分析单元和显示单元。前者主要包括气源及控制计量装置﹑进样装置﹑恒温器和色谱柱；后者主要包括检测器和自动记录仪。色谱柱（包括固定相）和检测器是气相色谱仪的核心部件，应根据被分离物质的性质来选择合适的色谱柱和检测器。通常采用的检测器有热导检测器、火焰离子化检测器、氦离子化检测器、超声波检测器、光离子化检测器、电子捕获检测器、火焰光度检测器、电化学检测器、质谱检测器等。

气相色谱法主要用于①临床毒物的检测：包括药物、毒物、成瘾性物质、兴奋剂等；②激素类物质：如雌三醇、孕二醇、孕三醇、睾丸激素等；③其他生化物质，如血液、尿液等体液中的脂肪酸、氨基酸、甘油三酯、糖类、维生素多肽、寡核苷酸等小分子的分析鉴定。

（四）高效液相层析

高效液相层析（high-performance liquid chromatography，HPLC）是在经典液相层析法基础上，引进了气相层析的理论，通过高压输液系统，形成的分离能力强、测定灵敏度高的分析检测技术。

典型的高效液相层析仪包括输液系统、层析柱与检测系统三部分。流动相用高压泵输入。HPLC中所用的检测器最多应用的是紫外吸收检测，灵敏度可达纳克水平。此外，还有荧光检测器、示差折光检测器、电化学检测器、质谱仪等。

HPLC应用范围极广，无论是极性还是非极性，小分子还是大分子，热稳定还是不稳定的化合物均可用此法测定。对蛋白质、核酸、氨基酸、生物碱、类固醇和类脂等尤为有利。

（五）超高效液相层析

超高效液相层析（ultra-high performance liquid chromatography，UHPLC）是为了提高HPLC层析柱的柱效，运用粒径低于2μm的小颗粒形成的新型液相层析柱。小颗粒层析柱要求有更高的工作压力，需要更小的系统体积（死体积），并且需要能适应可能只有几秒峰宽的高速检测器，由此构成超高效液相色谱。它具有高速度、高分离度和高灵敏度等特点。

（徐克前）