第四节 电泳技术

一、电泳技术的基本原理和分类

（一）基本原理

带电颗粒在电场作用下向着与其电性相反的电极移动的现象称为电泳（electrophoresis）。不同的带电颗粒在同一电场中的运动速度不同，其泳动速度用迁移率（或称泳动度）来表示。

迁移率μ指带电颗粒在单位电场强度下的泳动速度。它与球形分子的半径（r）、介质黏度（η）、颗粒所带电荷（Q）有关。

（二）分类

根据电泳是在溶液还是在固体支持物中进行，可将电泳分为自由电泳和支持物电泳。自由电泳包括显微电泳（也称细胞电泳）、移界电泳、柱电泳、等速电泳等。区带电泳则包括滤纸电泳（常压及高压）、薄层电泳（薄膜及薄板）、凝胶电泳（琼脂、琼脂糖、淀粉胶、聚丙烯酰胺凝胶）等。临床检验中常用的是区带电泳。

二、影响电泳迁移率的外界因素

（一）电场强度

电场强度是指单位长度（cm）的电位降。电场强度越高，则带电颗粒泳动越快。当电压在500V以下，电场强度在2~10V/cm时为常压电泳。电压在500V以上，电场强度在20~200V/cm时为高压电泳。

（二）溶液的pH

溶液的pH决定被分离物质的解离程度和质点的带电性质及所带净电荷量。例如蛋白质分子，它是既有酸性基团（—COOH），又有碱性基团（—NH₂）的两性电解质。在某一溶液中所带正负电荷相等，即分子的净电荷等于零，此时，蛋白质在电场中不再移动，溶液的这个pH值为该蛋白质的等电点（isoelctric point，pI）；若溶液pH处于等电点酸侧，即pH < pI，则蛋白质带正电荷，在电场中向负极移动；若溶液pH处于等电点碱侧，即pH > pI，则蛋白质带负电荷，向正极移动。溶液的pH离pI越远，质点所带净电荷越多，电泳迁移率越大。因此在电泳时，应根据样品性质，选择合适的pH值缓冲液。

（三）溶液的离子强度

电泳液中的离子浓度增加时会引起电泳颗粒迁移率的降低。其原因是离子强度影响电泳颗粒的电动势。另外，离子强度过低会导致缓冲能力减弱，也会影响泳动速度。一般最适合的离子强度在0.02~0.2之间。

（四）电渗现象

电场作用下液体对于固体支持物的相对移动称为电渗（electroosmosis）。其产生的原因是固体支持物多孔，且带有可解离的化学基团，因此常吸附溶液中的正离子或负离子，使溶液相对带负电或正电。因此，在电泳时，带电颗粒泳动的表观速度是颗粒本身的泳动速度和电渗携带颗粒的移动速度的矢量和。

（五）支持物的选择

一般要求支持物均匀，吸附力小，否则电场强度不均匀，影响区带的分离。

（六）焦耳热的影响

电泳过程中产生焦耳热，其大小与电流强度的平方成正比。热对电泳影响很大，温度升高时，迁移率增加，分辨率下降。可通过控制电压或电流，也可配备冷却装置以维持恒温。

三、电泳分析常用方法

（一）醋酸纤维素薄膜电泳

以醋酸纤维素薄膜为支持介质的电泳称为醋酸纤维素薄膜电泳（cellulose acetate membrane electrophoresis）。醋酸纤维素是将纤维素的羟基经过乙酰化而形成，是纤维素醋酸酯。由该物质制成的薄膜称为醋酸纤维素薄膜。醋酸纤维素膜经过冰醋酸乙醇溶液或其他透明液处理后可使膜透明化有利于对电泳图谱的光吸收扫描测定和膜的长期保存。

醋酸纤维素薄膜电泳具有操作简单、快速、价廉等特点，目前广泛用于分析检测血液、脑脊液、尿液中蛋白、酶等的分析检测中。

（二）琼脂糖凝胶电泳

以琼脂糖为支持物的电泳称为琼脂糖凝胶电泳（agarose gel electrophoresis）。琼脂糖的结构单元是D-半乳糖和3，6-脱水-L-半乳糖。许多琼脂糖链依氢键及其他力的作用使其互相盘绕形成绳状琼脂糖束，构成大网孔型凝胶。目前，临床上常用琼脂糖作为电压支持物，用于分析血清蛋白、血红蛋白、脂蛋白、糖蛋白；乳酸脱氢酶、碱性磷酸酶等同工酶的分离和鉴定。

临床上常用的免疫电泳也是以琼脂糖为支持物。免疫电泳（immunoelectrophoresis）是将琼脂糖凝胶电泳和双向琼脂扩散结合起来，用于分析抗原组成的一种定性方法。此项技术既有抗原抗体反应的高度特异性，又有电泳分离技术的快速、灵敏和高分辨力。近年来本法主要用于：血清蛋白组分的分析，如多发性骨髓瘤、肝病、全身性红斑狼疮等；抗原、抗体的纯度检测；抗体各组分的研究等。也常用于检测血清中乙型肝炎表面抗原（HBsAg）、甲胎蛋白、各类免疫球蛋白的定性和半定量。

此外，以琼脂糖为支持物的电泳还可用于核酸的分离与鉴定。普通的琼脂糖凝胶电泳可以分离小于20kb的DNA。更大的DNA分子可用脉冲场凝胶电泳（pulsed field gel electrophoresis，PFGE）。

（三）聚丙烯酰胺凝胶电泳

聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺单体和甲叉双丙烯酰胺交联剂在催化剂（如过硫酸铵）和加速剂作用下形成的凝胶，以此为支持物的电泳称为聚丙烯酰胺凝胶电泳（polyacrylamide gel electrophoresis，PAGE）。目前聚丙烯酰胺凝胶电泳的种类有：

1.连续和不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳

根据其有无浓缩效应，将其分为连续系统和不连续系统。前者电泳体系中缓冲液pH及凝胶浓度相同，带电颗粒在电场作用下主要靠电荷效应和分子筛效应进行分离；后一电泳体系中，缓冲液的离子成分、pH、凝胶浓度及电位梯度均不连续，带电颗粒在电场中不仅有电荷效应、分子筛效应，还有浓缩效应，因此其分离条带的清晰度和分辨率都比前者好。

2.变性和非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳

在电泳的过程中，非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳中的蛋白质能够保持完整状态，并依据蛋白质的分子量大小、蛋白质的形状及其所附带的电荷量而逐渐呈梯度分开。而变性聚丙烯酰胺凝胶电泳是在电泳体系中加入了十二烷基硫酸钠（SDS），SDS是阴离子去污剂，它能断裂分子内和分子间的氢键，使分子去折叠，破坏蛋白分子的二、三级结构。因此，SDS-PAGE仅根据蛋白质亚基分子量的不同分离蛋白质，而与所带电荷和形状无关。SDS-PAGE也可分为连续和不连续两种。

3.聚丙烯酰胺梯度凝胶电泳

利用梯度装置形成聚丙烯酰胺凝胶由高到低的浓度梯度，即孔径梯度（pore gradient，PG），由此形成聚丙烯酰胺梯度凝胶电泳（PG-PAGE）。浓度越大，形成的孔径越小。蛋白质的最终迁移位置仅取决于其本身分子大小。

4.聚丙烯酰胺凝胶等电聚焦电泳

等电聚焦（isoelectricfocusing，IEF）是一种利用有pH梯度的介质分离等电点不同的蛋白质的电泳技术。利用各种蛋白质等电点（pI）不同，以聚丙烯酰胺凝胶为电泳支持物，并在其中加入两性电解质载体（carrier ampholyte），在电场的作用下，蛋白质在pH梯度凝胶中泳动，当迁移至其pI=pH处，则不再泳动，而浓缩成狭窄的区带，这种分类蛋白质的方法称为聚丙烯酰胺凝胶等电聚焦电泳（IEF-PAGE）。在IEF的电泳中，具有pH梯度的介质分布是从阳极到阴极，pH值逐渐增大。由于其分辨率可达0.01pH单位，因此特别适合于分离分子量相近而等电点不同的蛋白质组分。

IEF-PAGE操作简单，一般的电泳设备就可进行，电泳时间短，分辨率高。应用范围广，可用于分离蛋白质和pI测定，也可用于临床检验。

5.聚丙烯酰胺凝胶双向电泳

即二维电泳（two-dimensional electrophoresis，2DE），由两种类型的PAGE组合而成。样品经第一向电泳分离后，再以垂直它的方向进行第二向电泳。双向电泳目前已经发展出多种组合。例如IEF/SDS-PAGE，就是根据生物分子间等电点及相对分子质量不同的特点，建立了以第一向为IEF-PAGE，第二向为SDS-PAGE的双向电泳技术。再如IEF/PG-PAGE，第一向为IEF-PAGE，第二向为PG-PAGE。

由于双向电泳具有高分辨率，在蛋白质分离鉴定，特别是蛋白质组学研究中广泛应用。

6.毛细管电泳

毛细管电泳（capillary electrophoresis，CE）又称高效毛细管电泳（high performance capillary electrophoresis，HPCE），是一类以高压直流电场为驱动力，以极细管道为分离通道，依据样品中各组分的分子质量、电荷、淌度等差异而实现分离的液相分离技术。

毛细管电泳系统的基本结构包括高压电源、毛细管柱、进样系统、两个缓冲液槽、检测器、冷却系统和数据处理系统（图2-12）。根据其分离介质不同，毛细管电泳可分为不同类型，如毛细管区带电泳（capillary zone electrophoresis，CZE）、毛细管凝胶电泳（capillary gel electrophoresis，CGE）、胶束电动毛细管色谱（micellar electrokinetic capillary chromatography，MECC）、毛细管等速电泳（capillary isotachophoresis，CITP）、毛细管等电聚焦（capillary isoelectric focusing electrophoresis，CIFE）、毛细管电色谱（capillary electrokinetic chromatography，CEC）和亲和毛细管电泳（affinity capillary electrophoresis，ACE）等。

毛细管电泳在生物医学领域得到广泛应用，可用于多种有机、无机离子分析，药物测定，蛋白质、多肽、核酸分析，具有分析速度快、灵敏度高、分辨率高和重复性高等优点。

四、电泳染色方法

经醋酸纤维素薄膜、琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶等支持物电泳分离的各种生物分子需要通过染色使其在支持物相应位置上显示出谱带，从而检测其纯度、含量及生物活性。不同的分离物质选择不同的染色方法。

（一）蛋白质染色

蛋白质染色常采用染料，各种染料染色蛋白质的原理不同，灵敏度各异，使用时根据需要加以选择（表2-3）。

（二）同工酶染色

同工酶经电泳分离后可用不同染色法加以鉴定，常用的染色方法有以下几种：

1.底物显色法

利用酶促反应的底物本身无色，而反应后的产物显色，证实酶的存在。此法常用于水解酶的鉴定。例如酸性磷酸酶可将磷酸酚酞分解为磷酸盐和酚酞，酚酞在碱性条件下呈红色。

2.化学反应染色法

用各种化学试剂使酶促反应的产物或未分解的底物显色。例如酸性磷酸酶可催化α-萘酚磷酸盐生成磷酸盐和α-萘酚，生成的α-萘酚可用偶氮染料染色。

3.荧光染色法

无荧光的底物在酶促反应后产物呈荧光，或者使有荧光的底物转变成无荧光的产物。例如磷酸酶或糖苷酶可催化4-甲基伞形基磷酸酯（或糖苷）生成4-甲基伞形酮而呈现荧光。

4.电子转移染色法

以NAD+或NADP+为辅酶的脱氢酶，在顺向反应产生的NADH或NADPH可将氢原子转移至甲硫吩嗪（PMS），后者再将电子不可逆的转移给氯化硝基四氮唑蓝（NBT）类化合物，生成有色化合物，从而显示酶带。这种方法可显示各种脱氢酶的存在。

5.酶偶联染色法

这种方法主要用于酶促反应直接底物或产物均不显色，加入另一种指示酶则可使产物通过电子转移而显色。如用葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（G6PD）为指示酶可用于己糖激酶、葡萄糖磷酸异构酶同工酶的显色，而乳酸脱氢酶为指示酶，可用于丙氨酸氨基转移酶、磷酸激酶、肌酸激酶等同工酶的显色。

（徐克前）