第三节 光学分析技术

一、概述

（一）光学分析方法及分类

光学分析方法（optical method of analysis）是利用物质的光学性质进行化学分析的方法。它是建立在物质发射的电磁辐射或电磁辐射与物质相互作用的基础上的。光学分析方法分为光谱分析和非光谱分析两大类。光谱分析（spectral analysis）是利用各种化学物质（包括原子、基团、分子及高分子化合物）所具有的发射、吸收或散射光谱谱系的特征，来确定其性质、结构或含量的技术。光谱分析是临床生化检验中主要应用技术。非光谱分析（nonspectral analysis）主要是利用电磁辐射与物质相互作用时产生的电磁辐射在方向上或物理性质上的变化来进行分析。不涉及试样光谱的测定，没有物质能级之间的跃迁，与其相对应的方法有比浊法、折射法、旋光法等。

（二）常用光学分析术语

1.光吸收（optical absorption）

当一定波长的光通过某介质时，该介质有选择地吸收某一波长的光，使入射光的强度减弱，这种现象称为光吸收。透过介质产生的光谱称为吸收光谱（absorption spectrum）。

2.吸光度（absorbance, A）

又称光密度（optical density，OD），指光线通过溶液或某一物质前的入射光强度与该光线通过溶液或物质后的透射光强度比值的以10为底的对数。影响它的因素有溶剂、浓度、温度等。表示溶液吸收光的强弱或吸收程度，A值愈大，溶液对光吸收的程度愈大。

3.消光系数（extinction coefficient）

溶液对光吸收大小的比例常数。用K表示，K值取决于溶质性质、入射光波长和温度。被测溶液浓度高，溶液显色后颜色深，对光吸收大，光透射率低，反之就小。

摩尔消光系数（molar extinction coefficient）：指在一定波长下，溶液浓度为1mol/L，光程厚度为lcm时的消光系数，其单位是L/（mol·cm），用ε表示。ε值是物质的一个特征常数，由物质的性质与光的波长而定。同一物质在不同的波长所测得的ε值不同。一般采用ε值最大的波长进行比色测定。

质量消光系数（mass extinction coefficient）：又称百分消光系数，是指被测物质的浓度以质量浓度表示时的消光系数。当溶液浓度为1%（1g/100mL），光程为1cm时的消光系数，其单位是100mL/（g·cm），用E1%表示。E1%值是生物大分子常用的消光系数，由于生物大分子的分子量太大，一般不用摩尔浓度，它是表示生物大分子的一个特征常数。

两种消光系数之间的关系是：ε=0.1M×E1%（M为吸光物质的摩尔质量）

4.光互补色（complementary color）

溶液颜色与相应颜色的单色光生成互补色能形成白光，这种物理现象称之为光互补色。同种溶液对不同波长的光谱有不同的吸收峰，为了提高灵敏度，一般选用光的互补色来作为波长的优选条件，蓝色对黄色光是互为补色，595nm波长正是此范围，可以测出最大吸收值，提高了灵敏度。而465nm是绿色光，蓝色溶液吸收低，灵敏度自然低了。

5.发色基团和助色基团

发色基团（chromophoric group）亦称生色基团，是指有机化合物或生物大分子中的某些基团，在紫外-可见光波区具有特殊的吸收峰，这些基团称为发色基团。一般不饱和的基团都是发色基团，如酮基、醛基、羧基、硝基等。如果一个化合物的分子含有多个发色基团，但它们并不发生共轭作用，则该化合物的吸收光谱将包括这些个别发色基团原有的吸收带，这些吸收带的位置及强度互相影响不大。

有机化合物的某些基团本身并不产生特殊吸收峰，但与发色团同存于同一分子中时，能引起发色集团吸收峰发生位移和光吸收的强度增加，这些基团称为助色基团（auxochromic group），如—OH、—NH₂、—SH及一些卤元素等。

6.红移和蓝移

某些化合物通过取代反应引入了含有未共享电子对的基团之后，如—OH、—NH₂、—SH、—OR、—SR等，能使该化合物的最大吸收峰的波长λ_max向长波长的方向移动，这种现象称之为红移效应（bathochromic effect），或称红移（red shift）。与红移效应相反，某些化合物的生色基团的碳原子一端引入了某些取代基以后，如=C=O基，能使该化合物的最大吸收峰的波长λ_max向短波长的方向移动，这种现象称之为蓝移效应（hypsochromic effect），或称蓝移（blue shift）。

7.增色效应和减色效应

由于化合物分子结构中引入取代基或受溶剂的影响，使吸收带的强度即摩尔吸光系数增大或减少的现象称为增色效应（hyperchromic effect）或减色效应（hypochromic effect）（图2-2）。例如，双链DNA发生变性时，原子磷摩尔消光系数ε（P）值升高，复性后ε（P）值降低，分别发生增色效应和减色效应。

（三）朗伯-比耳定律

朗伯-比耳定律（Lambert-Beer law）也称为光吸收定律。在一定的条件下，一束单色光通过吸收介质的溶液后，因吸收介质吸收部分光能，引起该单束光的强度降低。吸收介质的厚度和吸光物质的浓度与光降低的程度成正比。

用公式表示：A=εbc

式中A——吸光值；ε——常数；c——溶液浓度；b——光程。

朗伯-比耳定律同时反映了溶液厚度和浓度对光吸收的关系，其数值随光的波长、溶液浓度和溶液的性质变化而变化。

二、光谱法

根据光谱谱系的特征不同，可把光谱分析技术分为吸收光谱法、发射光谱法和散射光谱法三大类。不同光谱分析技术都有不同特点的仪器，虽然它们在构造上各有不同，但是不同类型的光谱仪相同部件的功能都大体相同，主要包括光源（辐射源）、单色器、样品池、检测器和信号显示系统。

（一）吸收光谱法

利用物质特征吸收光谱进行分析的方法称为吸收光谱法。根据吸收光谱所在光谱区不同，吸收光谱可分为莫斯鲍尔光谱法、X射线吸收光谱法、原子吸收光谱法、紫外-可见吸收光谱法、红外吸收光谱法和磁共振波谱法。下面介绍在临床生化检验中常用的几种技术：

1.紫外-可见吸收光谱法

紫外-可见吸收光谱法（ultraviolet-visible absorption spectrometry，UVVIS）是利用某些物质的分子吸收200~800nm光谱区的辐射来进行分析测定的方法。这种分子吸收光谱产生于价电子和分子轨道上的电子在电子能级间的跃迁，广泛用于有机和无机物质的定性和定量测定。

（1）基本构造：

紫外可见吸收光谱仪由光源、单色器、吸收池、检测器以及显示器等五部分组成。

光源：一般采用钨灯和氢灯（或氘灯），在可见光区、近紫外区、近红外区常用钨灯，其发射连续波长范围在320~2 500nm之间。在紫外区用氢灯或氘灯，氢灯发射连续辐射光谱波长在190~360nm，而氘灯在180~500nm之间。氘灯的辐射强度比氢灯大3~5倍，使用寿命也长，因此氘灯更好。

单色器：由色散元件、狭缝及准直镜组成。分光光度法根据单色器和样品池的位置可分为前分光和后分光。一般的紫外-可见分光光度计大多采用前分光，而自动生化分析仪多采用后分光，即光源光线先通过样品池，再通过单色器（图2-3）。其优点在于同一体系中检测多种成分。

色散元件主要有棱镜和光栅。棱镜是根据光的折射原理进行的分光系统。光栅是利用光的衍射和干涉原理进行分光的元件，常用的光栅单色器元件有透射光栅和反射光栅，使用较多的是反射光栅。反射光栅又分为平面和凹面反射光栅。反射光栅是在抛物线玻璃或镀铝金属表面刻制平行线而制成的（600~1 200条/mm）。由于刻线处不透光，通过光的干涉和衍射使较长的光波偏折角度大，较短的光波偏折角度小，因而形成光谱（图2-4）。

吸收池：亦称比色池或样品池，是盛装空白和样品溶液的器皿。它由透明材料组成，在可见光区或近红外光波区一般用光学玻璃或有机玻璃，在紫外光波区应该用石英玻璃。

检测器：一种光电换能器，将光信号转变为电信号，再通过放大器将信号输送到显示器。常用的有光电管和光电倍增管。

（2）类型：

按照仪器使用的光学系统，可将其分为单光束紫外-可见分光光度计、双光束紫外-可见分光光度计、双波长紫外-可见分光光度计、双波长-双光束紫外-可见分光光度计、动力学分光光度计。

单光束紫外-可见分光光度计：这类仪器的波长范围通常在190~800nm。光源在低波段用的是氘灯或氢灯，高波段用的是钨灯或碘钨灯。单色器一般用棱镜或光栅。其原理图2-5。

双光束紫外-可见分光光度计：其设计与单光束紫外-可见分光光度计区别在于出射狭缝的光路中增加了一个斩波器，将一束光分为两束，一次测量即可得到样液的吸光值（图2-6）。

双波长紫外-可见分光光度计：具有两个独立的单色器，可以任意选择各自不同的波长，经斩波器使两种波长的光交替通过溶液（图2-7）。

双波长-双光束紫外-可见分光光度计：将两个单色器产生的单色光，通过斩波器以一定的频率交替通过样品池，然后由检测器接受峰顶和峰谷信号（图2-8）。

动力学分光光度计：利用时间分辨的能力，对分子吸收光谱进行扫描，测定生物化学瞬间反应产物的吸收光谱和随时间变化值，常应用于酶催化反应的动力学分析等方面。

2.原子吸收光谱法

原子吸收光谱（atomic absorption spectroscopy，AAS）是基于气态的基态原子外层电子对紫外光和可见光范围的相对应原子共振辐射线的吸收强度来定量被测元素含量的分析方法，每一种元素的原子不仅可以发射一系列特征谱线，也可以吸收与发射线波长相同的特征谱线。当光源发射的某一特征波长的光通过原子蒸气时，即入射辐射的频率等于原子中的电子由基态跃迁到较高能态（一般情况下都是第一激发态）所需要的能量频率时，原子中的外层电子将选择性地吸收其同种元素所发射的特征谱线，使入射光减弱。特征谱线因吸收而减弱的程度称吸光度A，与被测元素的含量成正比，是一种测量特定气态原子对光辐射吸收的方法。此法是20世纪50年代中期出现并在以后逐渐发展起来的一种新型的仪器分析方法，它在生物医药等领域有广泛的应用。该法主要适用样品中微量及痕量组分分析。

原子吸收光谱仪主要由光源、原子化器、分光系统和检测系统四个部分组成。一般采用空心阴极灯作为光源，发射被测元素的特征共振辐射。原子化器的作用是提供能量将液态试样中的待测元素干燥蒸发使之转化为原子态的蒸气，如火焰原子化器、石墨炉原子化器、氢化物原子化器。分光系统有入射狭缝、反射镜、色散元件、出射狭缝组成，其作用是将所需要的共振吸收线分离出来。检测系统由检测器（光电倍增管）、放大器、对数转换器和电脑组成。（图2-9）

原子吸收光谱仪可测定多种元素，火焰原子吸收光谱法可测到10-9g/mL数量级，石墨炉原子吸收法可测到10-13g/mL数量级。氢化物原子化器可对易形成氢化物的元素如汞、砷、铅、硒、锡、碲、锑、锗等进行微痕量测定。

（二）发射光谱法

通过测量原子或分子的特征发射光谱来研究物质结构和测定其化学组成的方法称为发射光谱法。根据发射光谱所在的光谱区和激发方式的不同，发射光谱法可分为荧光光谱法、原子发射光谱法、γ射线光谱法。

1.荧光光谱法（fluorescence spectrometry）

某些物质被一定波长的光照射时，会在较短时间内发射出波长比入射光长的光，这种光称为荧光（fluorescence）。物质吸收的光，称为激发光；物质受激发后所发射的光，称为发射光或荧光。荧光光谱包括激发光谱（excitation spectrum）和发射光谱（emission spectrum）两种。如果将激发光用单色器分光后，连续改变激发光波长，固定荧光发射波长，测定不同波长的激发光照射下物质溶液发射的荧光强度的变化曲线，称为该荧光物质的激发光谱。从激发光谱图中，可以找到发生荧光强度最强的激发波长λ_ex。在激发光谱中最大吸收处的波长处，固定强度，检测物质所发射的荧光的波长和强度，所得到的曲线称为该物质的荧光发射光谱，简称荧光光谱。荧光光谱中荧光强度最强的波长λ_em。激发光谱和荧光光谱是荧光物质定性的依据。激发光谱与发射光谱呈镜像对称关系。

按照荧光的来源不同，可分为分子荧光和原子荧光。原子荧光光谱法（atomic fluorescence spectrometry，AFS）是利用原子荧光谱线的波长和强度进行物质定性和定量分析的方法。原子荧光光谱仪由激发光源、原子化器、光学系统和检测器组成。原子荧光光谱仪是我国少数几个具有自主知识产权的分析仪器。它可进行多种元素分析，如砷、汞、硒、铅、镉等。分子荧光应用较多，包括荧光计或荧光分光光度计、时间分辨荧光，此外流式细胞仪和血液荧光计也利用荧光进行检测。

（1）荧光计或荧光分光光度计：

分子荧光光谱法又称分子发光光谱法或荧光分光光度法，即通常所谓的荧光分析法，采用荧光计或荧光分光光度计进行分析。荧光计（fluorometer）或荧光分光光度计（spectrofluorometer）由激发光源、激发单色器、样品池、发射单色器、检测器和记录显示系统组成（图2-10）。前者使用滤光片，不能连续改变波长，后者可以连续改变波长。

荧光分析法近年来取得飞速发展，除了经典的荧光分光光度法外，还有免疫荧光分析法、时间分辨荧光法等应用于临床生物化学检验。可用于氨基酸、蛋白质、酶和辅酶、嘌呤、嘧啶、核酸、维生素、无机元素和药物等检测。

（2）时间分辨荧光分析（time resolved fluorescence,TRF）：

是利用稀土配合物（由稀土金属离子如Sm3+、Eu3+等与有机配位形成）长寿命的特点，在样品被脉冲光激发后、荧光信号采集前，根据样品中所包含的荧光物质的荧光寿命的不同引入一定的延迟时间，待短寿命的背景荧光完全淬灭后，再对长寿命的特异性荧光信号进行检测。此方法可以有效消除来自样品、试剂、仪器等的短寿命非特异性荧光的干扰，从而大大提高检测的灵敏度。临床检验中用的时间分辨免疫荧光分析法就是采用了此技术，还用于时间分辨荧光显微镜生物成像技术。

2.原子发射光谱法（atomic emission spectrometry,AES）

根据处于激发态的待测元素原子回到基态时发射的特征谱线对待测元素进行分析的方法。利用试样中原子或离子所发射的特征谱线的波长或强度来检测元素的存在和含量的仪器称为原子发射光谱仪。主要有火焰光度计（flame photometer）、火焰分光光度计（flame spectrophotometer）、摄谱仪（spectrograph）、光电直读光谱仪（photo-electric direct reading spectrometer）等。它们的基本原理相同，结构上稍有差别。

火焰光度计由气体和火焰燃烧部分、光学部分、光电转换器及检测记录部分组成，其原理是利用火焰的热能使某元素的原子激发发光，并用仪器检测其光谱能量的强弱，进而判断物质中某元素含量的高低。可用于钠、钾、锂、钙、钡等金属元素的含量测定。

（三）散射光谱法

用单色光照射透明试样时，大部分按原来方向透射，而一小部分则按不同的角度散射开来，该现象称为光的散射。散射是光子和试样分子相互作用的结果。如果在相互作用时，光子和分子之间发生能量交换，光子把一部分能量给予分子，或者从分子获得一部分能量，光子的能量就会减少或增加，这就是拉曼散射（Ramanspectra）；反之，就是瑞利散射。

根据分子的特征拉曼散射光谱来研究物质的结构和测定化学成分的方法，称为拉曼散射光谱法。临床上常用的无创测定血糖就是采用拉曼散射分析技术。

三、非光谱法

非光谱法在临床生化检测中常应用的是比浊法和化学发光法。

（一）比浊法

悬浮颗粒在液体中造成透过溶液的光减弱，减弱的程度与悬浮颗粒的量相关，据此定量测定物质在溶液中呈悬浮状态时浓度的方法称为比浊法（turbidimetry）。根据形成浊度的原理不同，比浊法可分为免疫比浊法、散射比浊法、光扫描比浊法、乳胶比浊法、光电比浊法、微生物比浊法等十余类。免疫比浊法（immunonephelometry）在临床生化检验中最常用，它是在一定量的抗体中分别加入递增量的抗原，经一定时间后形成抗原抗体复合物，用浊度计测量反映液体的浊度，并由此推算样品中的抗原含量。它又可分为免疫透射比浊法、免疫散射比浊法和免疫胶乳比浊法。

1.免疫透射比浊法和免疫散射比浊法

免疫浊度法按照仪器设计的不同可以分为两种，即透射比浊仪（turbidimetry）和散射比浊仪（nephelometry）。透射比浊仪是测量由于反射、吸收或散射引起的入射光衰减，其读数以吸光度A表示。A反映了入射光与透射光的比率。散射比浊仪是测量入射光遇到质点（复合物）后呈一定角度散射的光量，该散射光经放大后以散射值表示（图2-11）。

2.免疫胶乳比浊法

免疫胶乳比浊法（latex immunoturbidimetry）是一种带载体的免疫比浊法。其基本原理是选择一种大小适中（15~60nm）、均匀一致的胶乳颗粒（常用聚苯乙烯），吸附抗体后，当遇到相应抗原时，则发生凝集，单个胶乳颗粒在入射光波长之内，光线可透过，当两个胶乳凝集时，则使透过光减少。这种减少的程度与胶乳凝集成正比，也就是与抗原量成正比。它可使免疫比浊法速度更快、检测更敏感。

免疫比浊法具有高敏感、高特异等特点，现主要用于临床微量蛋白的测定和治疗性药物检测。

（二）化学发光法

化学发光（chemiluminescence，CL）是化学发光物质在特定化学反应中产生的光辐射。通过高能中间体的分解在化学反应中激发单态分子形成，分子被激发后是不稳定的，它要释放出多余的能量而回复到基态，其中部分能量以发光的形式释放出来。CL与荧光不同，后者能源来自入射的辐射能。

化学发光需要发光剂。化学发光剂是指在化学反应中参与能量转移并最终以发射光子的形式释放能量的化合物。常用的化学发光剂有三种：直接化学发光剂、酶促反应的发光底物的发光剂和电化学发光剂。根据化学发光剂的种类不同将化学发光分析分为三种类型，即直接化学发光分析、酶化学发光分析法和电化学发光分析法。在临床生化检验中，它们常与免疫反应结合，分别形成了化学发光免疫分析、化学发光酶免疫测定和电化学发光酶免疫测定方法，可用于药物、代谢物、激素、微量蛋白等的检测。具体见免疫化学分析技术。

此外，它还与其他技术的联用，尤其是流动注射技术、传感器技术、HPLC技术及各种固定化试剂技术的联用，更显示出化学发光分析快速、灵敏、简便等优点。

（徐克前）