第三节　鼠疫耶尔森菌及噬菌体生态基因组学

鼠疫耶尔森菌是属于肠杆菌科耶尔森菌属的一种革兰氏阴性菌，并由假结核耶尔森菌O：1b假结核耶尔森菌在1500~20000年前演化而来的。耶尔森菌属包括三种致病菌，分别是鼠疫耶尔森菌、假结核耶尔森菌和小肠炎耶尔森菌，他们基因组各自在适应其独特的生态位（ecological niches）进化过程中发生了相应的变化，从而导致了这些细菌宿主范围和引起的疾病谱上的不同。鼠疫耶尔森菌和假结核耶尔森菌的基因组非常接近，但是它们致病性和生活周期完全不同。鼠疫菌是鼠疫的病原体，通过跳蚤叮咬而传播，引发致死性腺鼠疫。而小肠结肠炎耶尔森菌和假结核耶尔森菌在基因组学上具有一定的相似性，均为水源性和食源性的致病菌，都只能导致轻微的肠道感染。鼠疫耶尔森菌基因组大小约为4.6Mb，GC%含量为46~47mol%，他含有三种质粒，分别为pPCP1（编码鼠疫菌毒素、凝固酶、血浆酶原活化因）、pCD1（钙依赖性）和pMT1（编码编鼠毒素和F1荚膜蛋白鼠毒素）。pCD1质粒为三种致病菌共有，负责编码毒力因子；pMT1和pPCP1质粒为鼠疫菌独有，编码毒力因子，是致病性所必需。pMT1质粒编码鼠毒素（Ymt）和F1荚膜蛋白。pPCP1质粒编码血浆酶原激活因子（Pla），鼠疫巴氏杆菌素（Pst）和一种鼠疫巴氏杆菌素免疫蛋白（Pim）。这两个外源性毒力质粒的获得，赋予了鼠疫菌新的致病特性，同时还导致了很多基因方面的变化，大大促进了鼠疫耶尔森菌的起源进化。

鼠疫菌和假结核分枝杆菌遗传进化研究显示，鼠疫菌携带的基因在假结核分枝杆菌中存在缺失或不可逆性突变，包括编码维生素B₁₂受体和昆虫毒素SepC的基因；高致病毒力岛、3个假基因的自发转座子、昆虫毒素及溶血素。研究报道，在鼠疫杆菌的进化中，inv和yadA的突变足以使假结核分枝杆菌的毒力提高到鼠疫杆菌的水平，鼠疫菌hms基因编码的蛋白能有效地堵塞跳蚤前脑室，从而增强跳蚤介导的宿主间传播；鼠疫杆菌Pla纤溶酶原激活因子，由9.5kb特异性质粒pPla编码，对菌株侵入宿主后在全身传播很重要；鼠疫耶尔森菌100kb pFra质粒上由ymt编码的磷脂酶D同源物能使鼠疫菌获得通过跳蚤传播的能力，使体外寄生虫更有效地转移到其他动物身上。这些都是导致假结核耶尔森菌进化为致病性鼠疫耶尔森菌属的关键因素。此外鼠疫耶尔森菌在进化的过程中O抗原基因的某些位点发生了突变，使编码O抗原的基因成为假基因，从而失去了表达O抗原的功能，并使其侵袭能力增加。因此不难看出，外源性基因质粒和基因组岛的获得以及部分基因的丢失导致由假结核耶尔森菌进化成鼠疫耶尔森菌，并使其适应新的生态位不是偶然发生的事件。在假结核耶尔森菌与蚤体和啮齿动物体内其他微生物共享生态位的情况下，基因水平转移事件由此发生。在自然选择压力的作用下，那些对进化有意义的基因水平事件（新质粒和基因组岛的逐步获得）稳定遗传下来，导致鼠疫耶尔森菌最终演化成了一种既可以经血传播引发啮齿动物与人致死性疾病的病原菌，又能寄生于媒介生物蚤体内完成生活史，同时还具有有限的宿主外生存能力的独立的新物种。

通过对鼠疫菌及噬菌体基因分布特征及其演变趋势分析、找出鼠疫基因组时空分布及演变受生态环境等可能的影响因素，必将有力推动空间流行病学和基因组流行病学在鼠疫防治的应用和研究。

一、鼠疫耶尔森菌基因组多样性

（一）世界鼠疫大流行的基因组特征

鼠疫是一种典型的自然疫源性疾病，动物间鼠疫的流行具有特定的地理区域、宿主、媒介和保存规律，并在一定条件下通过染疫的鼠、蚤或其他途径将细菌传给人，造成人间鼠疫。古基因组学数据表明，鼠疫在欧亚大陆已经影响了人类至少5000年，历史上总共导致了三场致命大流行。三次大流行中，每一次都是由不同的生物型引起的：包括古老型（Antiqua）、中世纪型（Medievalis）和东方型（Orientalis）。第一次大流行-查士丁尼瘟疫由Antiqua引起，大约发生在公元541—750年之间，从地中海盆地以连续波的形式扩散；其对人类、社会和经济的影响仍然存在争议。第二次大流行浪潮由Medievalis引起，称为“黑死病”，于1346年在卡法（Caffa）市开始，之后席卷欧洲直到19世纪，仅在1346—1353年期间就造成了30%~50%的人口死亡。第三次大流行由Orientalis引起，在中国云南省开始，1994年到达中国香港，并通过汽船和铁路传播到全世界随后很快波及美洲、大洋洲、非洲、欧洲和亚洲其他地区，一直持续到20世纪中叶，但这次由于控制有效并没有造成像前两次那样大的损失。

对古代瘟疫基因组的分析表明，过去流行病的传播来源、动态和起源已经在数千年间发生了很大的变化。例如，在青铜时代，鼠疫杆菌不能通过跳蚤叮咬传播给人类，因为缺乏允许细菌在跳蚤中肠中存活的ymt基因。细菌经过长期进化，其基因组在结构与功能上存在着明显的分化。鼠疫菌基因组在漫长的历史进化过程也在不断产生变化，是一个同环境、宿主、媒介之间不断互动促进的动态过程。这些动态过程对于鼠疫菌的进化研究，可以挖掘其变异形成的规律和机制，从而探究其功能、流行特点，在鼠疫防控和溯源具有重要意义。

1999年，Achtman采用插入序列ISl00为探针对49株鼠疫菌进行了进化分析，将鼠疫菌分为古典型、中世纪型和东方型三种。由于鼠疫菌十分保守，相对于其他细菌而言，其突变速率较为缓慢。这种高度保守的物种，并不适合使用MLST（Mutilocus sequence typing）作为分型的方法。2003—2004年，Hinchliffe和Zhou等先后采用差异区段（different region，DFR）方法，将鼠疫菌进一步分型。后者鉴定出了22个DFR，并将中国的鼠疫菌分离株分成了14个基因型，初步阐明了鼠疫菌在中国地区进化和在不同疫源地之间的扩散规律并重新定义和验证了一个新的鼠疫菌型——田鼠型。2004年，Girard和Powcel等先后使用多位点串联重复序列分析（multiple loci VNTR analysis，MLVA）方法，分别对美国和全球范围内的鼠疫菌进行了分析。2007年，Touchman等确定了CO92和FV-1鼠疫菌菌株19个SNPs，并利用这些SNP将北美22个不同的鼠疫菌菌株分成7个组。

2004年Achtman等首次对鼠疫菌全基因组SNP进行分析，在3个鼠疫菌（CO92、KIM10＋和91001）的基因组中鉴定出3250个同源编码序列（CDS）中的76个SNP。基于变性高效液相色谱（DHPLC）对105株不同的鼠疫菌进行筛选，发现另外4个SNP，为构建首个基于SNP的鼠疫菌系统发育奠定了基础。基于此提出鼠疫菌种系发生的命名方式，即“分支.生物学-群分支”。

2009年，对全球范围内500株鼠疫菌进行了MLVA的分析，确立了田鼠型在鼠疫菌系统发育关系处于最古老的分支之一的地位，同时还进一步将原来的四个大群进一步细化分类。2005年，Pollrcel使用区间规律聚积的短回文重复（clustered regularly interspaced short palindromic repeats，CRISPR）方法来对鼠疫菌分型，从为鼠疫菌进化研究又提供了一个新的工具。之后在2007—2008年，多篇使用该方法的文献发表，并且利用该方法对全球鼠疫菌建立了系统发育关系，提出鼠疫菌在全球的起源和传播路径的假设。随着越来越多的细菌全基因组测序的完成，根据全基因组来探讨细菌的进化，认识细菌系统发育展开了新的篇章。以比较基因组学研究为手段，从基因组水平上深入认识物种分化、生境适应、毒力进化、耐药性产生蔓延等表型进化。

2010年，Morelli等通过对来自世界各地的286株鼠疫菌进行SNP分型并构建系统发育图谱。总共发现了933个SNP位点，反映了从根部到顶端的单向克隆进化模式，并据此推断鼠疫菌的历史传播途径。来自中国的鼠疫菌分离株分布于所有四个系统发育分支，中国境内鼠疫菌分离株的平均系统发育多样性大于其他国家。自0分支起源以来，鼠疫菌已多次从中国传播到世界其他地区，推断出鼠疫菌的历史传播途径，得出鼠菌从中国通过多种途径传播到世界其他地区的结论。

2013年，Cui等人使用133株鼠疫菌全基因组序列鉴定出的2 326个SNP，发现了鼠疫菌在不同分支中SNP变异累计速率存在很大差异，并描绘了中国各疫区间的传播途径和进化关系。鼠疫进化领域目前最新的研究结果显示，鼠疫菌可分为5大种系分支，其中有4个年轻分支的形成可能与第二次鼠疫大流行有关。将全球鼠疫菌的系统发育关系同地理分布联系在一起后发现，第一、二两次鼠疫大流行分别与安哥拉菌株的分化时间点十分吻合。中国古代商路与鼠疫的地理分布一致性非常高，丝绸之路、唐蕃古道和茶马古道在鼠疫第二次鼠疫大流行的传播发挥了极其重要的作用，提示我们鼠疫菌在历史中的传播可能跟人类的商业贸易活动关系密切，而第一次大流行跟郑和下西洋有关。通过分子钟分析得出，不同种系间SNP数量变化很大，积累速度非常不均衡，基本上属于中性进化，可能是由于流行期和间歇期的交替导致。因此即使在没有自然选择的情况下，人口数量的变化也会影响鼠疫耶尔森菌的进化速度。

2014年，Wagner等从第一次大流行的死亡者遗骸宏基因组测序中检出鼠疫菌基因组。并将其与其他131个已知鼠疫菌基因组进行了比较，确定了导致这两个新的WGS的新分支，交织在两个现有的群体0.ANT1和0.ANT2之间，并得出结论，第一次大流行是由鼠疫菌从啮齿动物进入人类的独立出现引起的，与第二次和第三次大流行无关。2016年，Seifert等对德国出土的5具鼠疫菌阳性的人的骸骨进行SNP分型，发现了s12、s1431、s1195三个异常位点，证实了在德国长期存在一种独特的基因型。

2017年，Galina等发现天山山脉是吉尔吉斯斯坦所有高致病性菌株的源头。Mitchell等以马达加斯加菌株为试点研究了一种agarose-MAMAPCR的分型方法，增强了发展中国家实验室基于单核苷酸多态性的基因分型能力。Zhgenti等于2018年利用SNP芯片对格鲁地区和高加索地区的12株菌进行了分析，证实了高加索地区存在两个独立的、距离较远的发育群。

2020年，Zhou等发表了集成软件EnteroBase，可以利用宏基因组测序数据从短序列中直接组装鼠疫基因组。根据1 300多个鼠疫耶尔森菌基因组，总结了鼠疫菌在过去5000年中的微进化分析极大的扩充了鼠疫菌的谱系，为以后鼠疫菌的进化、溯源、分型提供可靠的数据支撑。

（二）鼠疫耶尔森菌在中国的传播与演化

我国15%的国土面积是鼠疫疫源地，拥有丰富且独特的鼠疫自然疫资源。总共可划分为12类疫源地，每一个都有不同的地理地貌和不同的景观，不同的宿主动物及媒介。鼠疫在自然疫源地的流行受到疫源地内气候环境和宿主媒介的影响，为了适应不同疫源地的生态位，鼠疫菌必须改变它们的遗传物质从而产生不同表型变化，因此不同类型鼠疫自然疫源地之间的菌株显示出了基因组多态性。不同宿主和媒介有其特定的生态景观，鼠疫菌在适应新的环境过程中，通过各种宿主-媒介-病原菌之间的相互作用，产生不同的基因组，以克服物种自然选择压力。为了明确鼠疫耶尔森菌的全球种群结构和中国鼠疫菌遗传进化规律，明确不同鼠疫自然疫源地内种群结构及遗传多样性，我们深入探讨了鼠疫菌的适应性进化以及鼠疫自然疫源生态之间的相互关系，为后续鼠疫防控和治疗提供相适应的理论依据。

我们构建了全球鼠疫耶尔森菌的基因组序列数据库以便了解宿主-媒介-病原体相互作用的不同疫源地中基因组谱的变化规律。其中包括1940—2021年间从中国14个省份分离到鼠疫耶尔森菌基因组序列381个（西藏、青海、新疆、甘肃、内蒙古、黑龙江、吉林、宁夏、陕西、云南、福建、广西、河北、四川）。每个疫源地都包含了一株以上的菌株。此外，还纳入Genbank数据库中其余国家已公布的鼠疫耶尔森菌基因组序列245个，以进一步明确中国菌株在国际鼠疫菌株中的进化关系及系统发育地位。

单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism，SNP）是一种稳定的遗传标记，能够用来推测物种进化方向，已经广泛应用于生物遗传关系的研究。为了能够重现系统发育关系，我们挑选了位于保守区的SNP，这样的位点大多数是能够稳定遗传的。以鼠疫菌CO92（NC 003143.1）菌株基因组作为参考序列，将上述鼠疫菌全基因组序列与参考基因组比对，鉴定每株菌中所有可能的SNP位点集合，通过SNP将种群中存在的亚群进一步区分，并进行种群结构和群体遗传学分析，以期重建中国鼠疫菌的系统发育关系。

在去除重组区域后，626个鼠疫全基因组中共鉴定了1 800个核心基因组SNP，为后续系统发育结构重建以及种群遗传学参数的定量化计算提供了基础数据。以Y. pseudotuberculosis IP 32953作为外群，使用邻接算法构建基于这些SNP位点的变异信息的系统发育树，根据系统发育结构能够直观地表征出物种或群体的进化路径和先后关系。两两菌株SNP距离频数分布直方图显示：菌株的SNP距离分布有两个较为集中的峰，一个位于100个SNP左右，一个位于400SNP左右。将中国菌株两两SNP距离按照疫源地分组后，我们发现青藏高原喜马拉雅旱獭鼠疫自然疫源地的菌株组内SNP距离最大（图1-2）。

根据基因组序列在群体中的存在情况不同，可以将基因组序列划分为核心基因组（coregenome）和泛基因组（pan-genome）。使用软件BLASTn将每一株菌的基因组序列与鼠疫耶尔森菌完成图菌株（CO92）的序列进行比对，对于比对的区域，若满足比对一致性不低于90%且blast比对e值低于1e-5，则认为该区域在参与比对的两株菌中都存在。综合所有菌株的比对结果，得到存在于所有菌株中的基因组片段，即为核心基因组区域。对于每一株菌，去掉核心基因组区域的序列称为菌株特有序列。我们区分了不同疫源地菌株的核心基因组和泛基因组分布情况，在626株鼠疫耶尔森中，共检测到3 509个核心基因（99%~100%菌株均有的基因）。特异性基因在各疫源地菌株之间分布差异很大，表明不同疫源地具有高度的遗传多样性。锡林郭勒草原布氏田鼠鼠疫自然疫源地菌株特异性基因数最少为40个，青藏高原喜马拉雅旱獭鼠疫自然疫源地菌株的特异性基因数最多，为1 206个（图1-2）。

通过系统发育图谱我们发现，来自中国的鼠疫菌分离株分布于所有四个系统发育分支，青藏高原喜马拉雅旱獭鼠疫疫源地分离株的平均系统发育多样性大于其他疫源地菌株。在地理分布上，中国鼠疫菌在发育树上与其余国家菌株交叉分布，可见鼠疫菌发生了多次从中国传播到世界其他地区的传播事件。青藏高原喜马拉雅旱獭鼠疫自然疫源地的两个古典型菌株形成了最早的谱系0.PE7，在第一次大流行之前首先从树的根部出现。紧随其后的是锡林郭勒草原布氏田鼠鼠疫自然疫源地和青藏高原青海田鼠鼠疫自然疫源地的人类非致病性谱系菌株0.PE4C。来自苏联的谱系0.PE2和谱系0.PE4B鼠疫耶尔森菌，分别从青藏高原喜马拉雅旱獭鼠疫自然疫源地的0.PE7和0.PE4A进化而来；俄罗斯的2MED.1与来自准噶尔盆地大沙鼠鼠疫自然疫源地的菌株2MED.2具有共同的祖先菌株：均为青藏高原喜马拉雅旱獭鼠疫自然疫源地菌株。谱系3.ANT1中的分离株仅限于青藏高原喜马拉雅旱獭鼠疫自然疫源地，代表一个不同的分支（图1-3）。

（三）鼠疫耶尔森菌种群结构分析

青藏高原喜马拉雅旱獭鼠疫自然疫源地的菌株特异性基因数量最多（1 206个），功能富集显示大部分为可移动元件：原噬菌体及转座子（10.36%）和碳水化合物运输和代谢（8.17%）；锡林郭勒草原布氏田鼠鼠疫自然疫源地的独特基因数量最少（40个）。天山山地灰旱獭长尾黄鼠鼠疫自然疫源地菌株基因组中可移动元件也较为富集。表明噬菌体和前原噬菌体在不同环境鼠疫耶尔森菌的进化和适应中发挥了显著的作用。青藏高原青海田鼠鼠疫自然疫源地菌株主要富集于氨基酸运输和代谢（19.7%）（图1-4）。

为探讨整个物种的种群结构特征，应用种群结构分析软件STRUCTURE对基因组SNP进行解析。STRUCTURE种群结构分析将全球鼠疫杆菌分成八个种群（K＝8时具有最大的ΔK值）（图1-4）。在第1个亚群中观察高度混合现象，说明这个亚群很有可能是从两个祖先亚群杂交而来。中国菌株主要分布在第6亚群（28.4%），但在第7亚群和第8亚群中没有发现。第2亚群有4个基因型（2.MED0、2.MED1、2.MED2、2.MED3）；第3亚群中的两个（2.ANT1和2.ANT2）；第4亚群中有六个（0.ANT2、0.ANT3、1.IN4、3.ANT1、3.ANT2和4.ANT1）；第5亚群12个（1.ANT、1.ANT1、1.IN1、1.IN2、1.IN3、1.IN4、1.ORI1、1.ORI2、1.ORI3、1.ORI4、1.ORI5和1.ORI6）；第6亚群中有5个（0.ANT1、0.PE4A、0.PE4B、0.PE4C和0.PE7）；第7和第8亚群中均只包含一个型别（0.ANT1及0.PE2），且全为国外菌株（图1-5）。

（四）不同鼠疫疫源地鼠疫菌的基因组变异及种群多样性分析

鼠疫自然疫源地就是在特定地理环境条件下，鼠疫菌与其所处的植被土壤、气候、宿主动物、媒介及噬菌体之间，经过漫长的生物进化，构成的一个独特的生态圈。鼠疫菌、宿主、媒介和自然地理条件是鼠疫自然疫源地形成的四大要素。我们对来自中国12类鼠疫自然疫源地的377株鼠疫菌株进行系统发育分析表明，不同疫源地都有其主要的基因型菌株，大部分疫源地的基因型之间分布没有交叉，每个基因型都局限在一个或几个特定的自然疫源地中。

除青藏高原喜马拉雅旱獭鼠疫自然疫源地外，其余疫源地菌株的基因组序列相对保守。每一个基因型都位于特定的地理区域。大多数不同鼠疫疫源地都有独特的基因型，对应着一组独特的自然景观和主要媒介。初步解释了鼠疫菌基因型与自然环境、宿主和媒介的关系。

准噶尔盆地大沙鼠鼠疫自然疫源地分离株100%为2.MED1；甘宁黄土高原阿拉善黄鼠鼠疫自然疫源地分离株100%为2.MED3；青藏高原青海田鼠鼠疫自然疫源地及锡林郭勒草原布氏田鼠鼠疫自然疫源地分离株100%为0.PE4C；呼伦贝尔高原蒙古旱獭鼠疫自然疫源地100%为4.ANT3；内蒙古高原长爪沙鼠鼠疫疫源地100%为2.MED3、天山山地灰旱獭长尾黄鼠鼠疫自然疫源地94.5%为0.ANT1；滇西山地齐氏姬鼠-大绒鼠鼠疫自然疫源地1.IN4占70%，滇西山地闽广沿海居民区黄胸鼠鼠疫自然疫源地64.29%为1.ORI2。

不同疫源地内的地理景观和自然生境决定了宿主和媒介的种类及其生态学特征的差别，耶尔森菌属的细菌在各自适应其独特的生态位（Ecologicalniches）进化过程中，基因组发生了相应的变化。宿主、媒介、鼠疫菌三者形成了一个相互作用的复合体（宿主生态位），影响着鼠疫菌型别，流行与静息。鼠疫菌传播到各自不同的地理区域后，在长期的进化过程中分别适应不同类型的宿主生态位，通过种内分化，并由此导致其在种以下形成不同的遗传型别，并最终在各个地理区域中形成稳定的自然疫源性。因此，不同自然疫源地来源的鼠疫耶尔森菌存在诸多差异。不同型别的鼠疫耶尔森菌对不同宿主动物的免疫原性和毒力具有明显差异，不同宿主动物对同一型别鼠疫耶尔森菌表现出不同的感受性和敏感性，不同遗传型别的鼠疫耶尔森菌将最终局限于特定地理区域，有效地避免了彼此间的生态位重叠。

青藏高原喜马拉雅旱獭鼠疫自然疫源地喜马拉雅旱獭疫源地地形复杂，分布于青海省、甘肃省、西藏自治区、新疆维吾尔自治区、四川省，主要宿主为喜马拉雅旱獭，主要传播媒介为斧形盖蚤、谢氏山蚤。该疫源地菌株多态性最大，包含了4大种系的鼠疫菌，且在系统发育中大部分菌株分布于进化树的根部以及其早期的亚分支中。目前已知的最古老的鼠疫菌种群（0.PE7）也属于该疫源地分离株。青藏高原喜马拉雅旱獭鼠疫自然疫源地内分离株的平均系统发育多样性大于其他疫源地：147个青藏高原喜马拉雅旱獭菌株散在分布于系统发育树中，共分为10个谱系，且大多数菌株都位于进化树的根部：其中3.ANT1占38.8%；1.IN2占27.2%，2.ANT2和2.ANT1占12.9%和12.2%，表明了不同种类的自然进化轨迹。青藏高原喜马拉雅旱獭鼠疫自然疫源地是中国面积最大的疫源地，也是世界上海拔最高的鼠疫自然疫源地，具有独特的地理地貌。该疫源地鼠疫染疫动物种类多，鼠疫菌毒力强，是中国动物和人间鼠疫疫情持续流行的活跃地区之一。此外，近年来该疫源地除了主要宿主旱獭外，不时有染疫的次要宿主出现。这些特征使青藏高原鼠疫在进化中发生了明显的基因组分化和演变，大量基因的获得和缺失，导致了该地区出现多样的鼠疫菌基因组型。我们推断青藏高原喜马拉雅早獭鼠疫自然疫源地很可能就是中国鼠疫流行的起源地，并以此为中心向其他地区扩散，这也与之前的研究报道结果一致。

甘肃省的阿尔金山喜马拉雅旱獭鼠疫自然疫源地（阿克塞）及祁连山喜马拉雅旱獭鼠疫自然疫源地（苏北），虽然都是属于青藏高原喜马拉雅旱獭鼠疫自然疫源地的亚疫源地，主要宿主和传播媒介基本相同，彼此之间在地理上相邻。但是由于他们被党金山这一地理屏障将其划分为两部分，自然景观区别明显，前者以荒漠、半荒漠草场为主，后者以高山草原草甸为主。导致这两块疫源地内鼠疫菌的基因组型差别较大。阿克塞县疫源地菌株中98.25%为3.ANT1型别，而肃北县100%为1.IN2型别。可见地理阻隔是影响鼠疫菌基因组的时空演变适应性的一个关键。鼠疫菌传播到各自不同的地理区域后，由于地理因素的阻隔，两者之间的基因交流较少，在长期的进化过程中分别适应不同类型的宿主生态位，最终在各个地理区域中形成稳定的各自然疫源性适应的基因型。

田鼠型鼠疫自然疫源地中，中国共有两种田鼠型鼠疫自然疫源地：即青藏高原青海田鼠鼠疫自然疫源地及锡林郭勒高原布氏田鼠鼠疫自然疫源地。前者位于青藏高原，后者位于内蒙古高原。尽管锡林郭勒高原布氏田鼠鼠疫自然疫源地和青藏高原青海田鼠鼠疫自然疫源地相距遥远，但来自两块疫源地的田鼠型鼠疫菌的致病性、生化特征以及分子生物学特征几乎完全相同，只引发有限的动物鼠疫，对人不致病。虽然将分离于这两块疫源地的田鼠型鼠疫菌株都分为同一基因型0.PE4C，但他们在系统发育树中占据两个不同的姊妹支，均由同一祖先株-青藏高原喜马拉雅旱獭鼠疫疫源地鼠疫菌平行分化而来。中国田鼠鼠疫自然疫源地菌株在毒力、生化表型和分子特征上与其他自然疫源地相差很大。基因组结构比较显示，田鼠型鼠疫菌株与其他型别鼠疫耶尔森菌差异较大，基因组内缺失了大片段的基因，他的许多基因由于点突变而失活或表达蛋白发生变异。这些点突变的积累可能导致相应基因功能的丧失或不正常，但是这些基因在其他型别鼠疫耶尔森菌中均是完整的。显示了一个新的生物型——田鼠型的出现。

内蒙古高原长爪沙鼠鼠疫疫源地，涉及河北省、陕西省和宁夏回族自治区与之相接壤的边缘地区。主要宿主为长爪沙鼠，该疫源地菌株主要型别为2.MED3，与甘宁黄土高原阿拉善黄鼠鼠疫自然疫源地菌株型别一致。松辽平原达乌尔黄鼠鼠疫自然疫源地及呼伦贝尔高原蒙古旱獭鼠疫自然疫源地均为4.ANT3。结合系统发育树我们可以看出，鼠疫菌经由呼伦贝尔高原、松辽平原的古典型菌株进化成内蒙古高原的中世纪型。地理位置上来看，松辽平原达乌尔黄鼠鼠疫自然疫源地与内蒙古高原长爪沙鼠鼠疫自然疫源地和甘宁黄土高原阿拉善黄鼠鼠疫自然疫源地在地理上相邻，我们推测来自内蒙古高原长爪沙鼠鼠疫自然疫源地和甘宁黄土高原阿拉善黄鼠鼠疫自然疫源地的中世纪型鼠疫菌可能从松辽平原达乌尔黄鼠鼠疫自然疫源地的古典型鼠疫菌直接进化而来。

大沙鼠疫源地位于新疆维吾尔自治区北部。东边为阿尔泰山，西部为准噶尔山地，南为天山山脉。主要宿主为大沙鼠，2.MED1分支为大沙鼠疫源地独有。同样位于天山山地的灰旱獭-长尾黄鼠疫源地，主要宿主为灰旱獭、长尾黄鼠，主要传播媒介为谢氏山蚤、方形黄鼠蚤。该疫源地分型为古典型，主要分支为0.ANT1。

帕米尔高原红旱獭疫源地位于主要宿主为长尾旱獭，主要传播媒介为谢氏山蚤，腹窦纤蚤，分离到的鼠疫菌为2.MED2。

滇西山地齐氏姬鼠-大绒鼠鼠疫自然疫源地位于滇西北，包括云南省剑川县、丽江市古城区古、玉龙纳西族自治县。鼠疫中国西南部野鼠鼠疫自然疫源地，主要宿主为齐氏姬鼠、大绒鼠，主要传播媒介为特新蚤指名亚种。该疫源地菌株分型与部分青藏高原喜马拉雅旱獭鼠疫疫源地鼠疫菌聚为一簇，为古典型，分支为1.IN2、IN31、IN4。基于菌株间传播事件和系统发育关系，我们推论出云南野鼠鼠疫自然疫源地可能由喜马拉雅旱獭疫源地传播而来。

处于第三次世界鼠疫大流行起源地云南省的家鼠鼠疫自然疫源地，鼠疫菌生物型由古典型经由滇西南山地演变为东方型。滇粤闽居民区黄胸鼠鼠疫自然疫源地包括西南山地、闵广沿海、东部丘陵平原三个亚区。主要宿主为黄胸鼠，主要传播媒介为印鼠客蚤。我们观察到有两株云南家鼠型菌株位于野鼠菌株的分支中，野鼠型鼠疫菌位于祖先位置，且两个支亲缘关系很近。与目前关于东方型鼠疫菌和中世纪型鼠疫菌分别起源于古典型鼠疫菌的观点相符。因此鼠疫菌沿着青藏高原向滇西横断山脉、滇西南山地及闽广沿海的传播规律得以证实。

（五）不同宿主间鼠疫菌的适应性微进化

鼠疫菌是一种多宿主多传播媒介的病原体，在自然界有多种野生动物感染鼠疫并作为它的宿主，80多种跳蚤和其他虫媒可以作为它的媒介。相近的疫源地间，如果主要宿主种类相同，鼠疫耶尔森菌的基因组型也相同或相近。有些疫源地内主要宿主种类相同，但是由于栖息地环境不同和或主要媒介不同，可能有若干个基因组型。例如来自喜马拉雅旱獭鼠疫疫源地的菌株。其基因组型就较为复杂。102个旱獭分离株共分为8种基因型，其中3.ANT1占比最多（46.1%），其余宿主中鼠疫菌型别均较单一。决定鼠疫耶尔森菌存在及其型别的因素是多方面的，但可看作是一个由自然环境，贮存宿主，传播媒介和病原体相互作用的复合体。宿主生态位在不同的地理区域中，这一复合体中起主要或决定性作用的因素各有不同。我们推测喜马拉雅疫源地型别较多可能与旱獭寿命较长，一般超过10年，鼠疫疫蚤可与之常年生存，旱獭入蛰冬眠后，动物间鼠疫也进入静息期，而出蛰后又重新活跃。其他啮齿动物的寿命较短，这意味着在鼠疫流行期间其他疫源地的鼠疫菌会频繁更新宿主，这导致在宿主与鼠疫菌之间的相互作用较少，他们之间建立的免疫屏障比旱獭要弱得多。因此鼠疫菌在长期与旱獭共存过程中容易因为自然选择的压力下，鼠疫菌随着宿主的迁徙，容易产生适应和演变，从而导致基因组的多态性。

喜马拉雅旱獭鼠疫疫源地及青海田鼠鼠疫自然疫源地均位于青藏高原，两类宿主生境基本一致，但是基因组差距甚远。位于云南省境的滇西山地齐氏姬鼠-大绒鼠鼠疫自然疫源地及滇粤闽居民区黄胸鼠鼠疫自然疫源地，两个疫源地菌株基本按照宿主的不同划分为两种不同型别，但是仍有个别交串现象。同时有些相距甚远的疫源地，如果主要宿主种类相似，鼠疫菌的基因组型也相近。例如黄鼠型鼠疫自然疫源地中，天山山地灰旱獭-长尾黄鼠鼠疫自然疫源地位于中国西北部地区，而松辽平原达乌尔黄鼠鼠疫自然疫源地为于中国东北部，两者宿主均为黄鼠属的不同种，虽然相距几千公里，他们基因组在进化关系上同属于一个大的进化分支。田鼠型鼠疫自然疫源地中，青藏高原青海田鼠鼠疫自然疫源地位于青藏高原，锡林郭勒高原布氏田鼠鼠疫自然疫源地位于内蒙古高原。两个自然疫源地相距遥远，但来两类田鼠型均属于同一基因型0.PE4C，均由同一祖先株-青藏高原喜马拉雅旱獭鼠疫疫源地鼠疫菌平行分化而来。两类沙鼠型的鼠疫自然疫源地，准噶尔盆地大沙鼠鼠疫自然疫源地及内蒙古高原长爪沙鼠鼠疫疫源地也是同样的情况。

二、鼠疫耶尔森菌噬菌体生物学特性及基因组分析

噬菌体（bacteriophage）是地球上分布最多的也可能是种类最多的微生物，在数目上超出细菌10倍左右。在20世纪早期，由Frederick Twort最早进行描述，接着Félix d′Herelle将噬菌体分离出来，并发现其可以杀死细菌，是寄生于细菌、真菌、放线菌或螺旋体等细胞内的病毒。噬菌体结构比细菌和真菌等要简单得多，有严格的宿主特异性，只寄居在易感宿主菌体内，因此在病原菌分型、疾病诊断和治疗方面发挥关键性作用。作为一种抗菌剂，噬菌体具有特异性强、繁殖迅速的特点。噬菌体治疗是控制细菌感染和污染的替代抗生素治疗的新策略。根据噬菌体对其宿主菌的作用方式，可将噬菌体分为烈性噬菌体和温和性噬菌体两种。烈性噬菌体（virulent phage）感染敏感细菌后，可在其细胞内快速增殖，通过裂解宿主细胞来释放子代噬菌体从而到达杀死细菌的目的，故又称毒性噬菌体。温和噬菌体（temperate phage）也称为溶源性噬菌体，在感染细菌后有两种途径：一是和烈性噬菌体一样裂解细菌，二是将其基因组整合到宿主染色体中，成为细菌DNA的一部分，不单独复制并能随细菌的繁殖传给下一代。此过程称为溶原性（lysogeny），带有噬菌体基因组的细菌称为溶原性细菌（lysogenic bacterium），而发生基因整合的噬菌体称为前噬菌体（prophage）。噬菌体特异性对细菌的裂解作用主要取决于两个因素：一是噬菌体配体对细菌细胞壁上特异性受体的结合；二是噬菌体在细菌细胞内的复制。

鼠疫噬菌体的研究对鼠疫菌的鉴定、保存机制及鼠疫的治疗具有重要意义。鼠疫噬菌体的使用最早追溯到1919年，d′Herelle报道了使用一种裂解性噬菌体（lytic phage）来治疗鼠疫，但是这些研究的效果并不确定。1927年Flu从荷兰Leyden运河河水中分离到一株噬菌体，可以裂解鼠疫菌、大肠杆菌和志贺菌。1929年Pokrovskaya从花金鼠感染组织中分离到一株特异性作用于鼠疫菌的裂解性噬菌体。日本的Sugino和塞内加尔的Advier同样报道了鼠疫菌特异性的噬菌体。

常见的耶尔森菌属噬菌体包括，小肠结肠炎耶尔森菌O：3血清型特异性噬菌体ΦYeO3-12和phiYe-F10；被用作鼠疫诊断噬菌体PhiA1122和Yep-phi；YpsP-G和YpP-R已被报道用于诊断假结核耶尔森菌感染。鼠疫杆菌噬菌体的许多基因组已被完全测序，包括短尾噬菌体科（Podoviridae）噬菌体phiA1122、Yep-phi、Berlin、Yepe2、YpP-R、YpP-G、YpsP-G、Yps-Y和肌尾科（Myoviridae）噬菌体L-413C、PY100、YpsP-PST和phiD1。国际上已经测序的鼠疫菌噬菌体包括：8株属于T7噬菌体家族短尾噬菌体科，C1形态型鼠疫噬菌体，它们分别为Berlin、Yep E2、YpsP-G、PhiA1122、YpP-Y、YpP-R、YpsP-G、Yep-phi；另外三株为肌尾科L-413C、PY100、YpsP-PST分别来自于P2、T1、T4群；此外还有Ypf-phi为丝状噬菌体。

PhiA1122：烈性鼠疫诊断用噬菌体，由Advier在1933年从一个腺鼠疫患者血液中分离，在20℃能裂解鼠疫菌及37℃裂解假结核。Yep-phi为我国分离的鼠疫诊断用噬菌体，在不同温度下均可特异性裂解鼠疫菌，而不裂解其他菌。YepE2和YpP-G是从花金鼠组织中分离到的鼠疫耶尔森菌噬菌体，能裂解几乎全部的鼠疫耶尔森菌和20%左右的假结核耶尔森菌。YpP-Y、YpP-R是1964年分离到的鼠疫烈性噬菌体，能裂解鼠疫耶尔森菌和部分假结核耶尔森菌。L-413C属于温和噬菌体，分离自溶原菌413（中亚荒漠红尾沙鼠分离的鼠疫菌）。L-413C最显著的特点是其尾丝蛋白H的马赛克结构，这个马赛克结构使L-413C可以区分鼠疫菌和假结核分枝杆菌。因此其具有很高的特异性，只裂解鼠疫耶尔森菌，而不能裂解假结核耶尔森菌和大肠埃希菌。其噬菌体的受体是位于鼠疫菌表面的LPS。PY100噬菌体，是在2007年从一个德国养猪场的饲料中分离的，他在耶尔森菌属内具有广泛的宿主范围，可以裂解小肠结肠炎耶尔森菌、假结核分枝杆菌和鼠疫菌。YpfPhi属于丝状噬菌体，即前噬菌体，位于鼠疫菌CO92（Genbank：AL590842.1）基因组的YPO2271-2281bp。早期研究表明这种前噬菌体仅仅在东方型的菌株中感染并存在。但是研究结果表明鼠疫菌的祖先早已获得了YpfPhi。缺失YpfPhi基因组并不影响鼠疫菌形成菌落和蚤前胃阻塞的能力，但是会导致鼠疫菌在小鼠中的致病力发生改变。在古典型和中世纪型菌株中，YpfPhi基因组形成一个不稳定的游离体（episome），而在东方型菌株中它能稳定地整合成为串联重复序列。通过获得一个不稳定的丝状噬菌体，鼠疫菌可以从一个经典的肠道病原体转化成为一个高度致病性细菌。

2020年，我们首次从中国青藏高原喜马拉雅旱獭鼠疫自然疫源地内自毙旱鼠骨髓中分离到一株烈性鼠疫耶尔森菌噬菌体YepMm。该自毙旱獭中同时分离到一株鼠疫耶尔森菌。以往国内外报道的鼠疫噬菌体多为污水及土壤中分离，这是首次从鼠疫宿主动物的骨髓中分离到烈性噬菌体。青藏高原喜马拉雅旱獭鼠疫自然疫源地是发生动物间鼠疫流行和人间鼠疫病例最多的疫源地之一，从发现至今一直处于活动状态。而活动疫源地的主要宿主动物中分离到的烈性噬菌体更加具有重要的意义。电镜观察显示该噬菌体病毒粒子呈六角形轮廓，尾巴短而不收缩，呈圆锥状，属于短尾噬菌体。

（一）噬菌体YepMm与Yep-phi宿主特异性研究

噬菌体YepMm对假结核耶尔森菌裂解具有温度特异性：25℃和37℃时可裂解O：1b和O：14型假结核耶尔森菌；37℃时可裂解O：1a型假结核耶尔森菌，25℃时不裂解。噬菌体YepMm在两种温度下均能裂解鼠疫菌和高致病性小肠结肠炎杆菌生物血清型1B/O：8。而噬菌体Yep-phi只能裂解鼠疫菌和O：14型假结核分枝杆菌。YepMm在25℃时比在37℃时形成更大的裂解圈。除鼠疫杆菌外，还可裂解高致病性1B/O：8小肠结肠炎耶尔森菌和O：1B血清型假结核分枝杆菌，可作为防治致病性耶尔森菌感染的重要生物制剂（图1-6）。

与诊断噬菌体Yep-phi相比，YepMm感染鼠疫菌后OD值下降更快，YepMm噬菌体的一步生长曲线表明，其潜伏期约为10分钟、裂解期约80分钟，裂解期间每个被感染的细菌释放新的噬菌体的平均数约187PFU/细胞。PhiA1122在37℃条件下也可以裂解假结核分枝杆菌。而中国鼠疫菌诊断用噬菌体Yep-phi在20℃和37℃特异裂解鼠疫菌，对耶尔森菌属的其他种不裂解。因此噬菌体YepMm的裂解能力比Yep-phi更强，潜伏期短、裂解谱宽。

鼠疫噬菌体对宿主菌裂解的特异性方面有很大的不同。YpP-Y、YpP-R、YpsP-PST和YpsP-G可以裂解假结核耶尔森菌；而PhiA1122及YpP-G则不能裂解。此外YpP-Y、YpP-R、YpsP-PST、PhiA1122和YpsP-G还能裂解大肠埃希菌及志贺菌。噬菌体的宿主特异性主要是由于噬菌体的尾丝蛋白与宿主菌的受体特异性结合不同所导致的。

（二）耶尔森属噬菌体比较基因组学研究

在基因组方面，我们将分离的YepMm噬菌体纳入我们的耶尔森属噬菌体库进行了比较基因组学研究（包括所有已知的致病性耶尔森菌属噬菌体基因组）。进化树显示，耶尔森菌噬菌体总共分为五个大簇。与同属T7家族的烈性鼠疫菌噬菌体PhiA1122，Berlin，Yepe2，Yep-phi进行了比较基因组学分析。结果提示烈性鼠疫噬菌体可以明显分为两个亚群：Yepphi和PhiA1122亚群。而YepMm与Yep-phi亚群聚为一类（包括Yep-phi、Berlin和Yepe2）。YepMm与Yep-phi的核苷酸序列同源性为99.99%，而与phiA1122的核苷酸序列同源性仅为67.48%（图1-7）。

YepMm与诊断噬菌体Yep-phi基因组极其相似，43个ORF中41个与诊断噬菌体同源性为100%，但是通过基因组结构比较我们发现，YepMm与Yep-phi相比，在尾丝蛋白A（TTPA）上游的启动子区域（330bp）处产生了一个SNP变异。导致了一个新的ORF的出现。尾丝蛋白是噬菌体尾部的一种结构蛋白，噬菌体的尾部蛋白在噬菌体与宿主细菌的相互作用中起着重要作用。介导噬菌体尾丝专一吸附在寄主细胞表面受体上，从而介导感染。基因组SNP的出现可能引起噬菌体尾部蛋白的改变并导致两者对宿主菌的敏感性的差异。

（三）噬菌体尾丝蛋白差异导致噬菌体宿主特异性差异

噬菌体吸附到受体是感染的第一步，菌体裂解细菌的特异性主要取决于噬菌体与细菌细胞壁上特异性受体的相互识别与吸附。对于有尾噬菌体来讲，识别宿主的特异性是由尾丝蛋白决定的。它们吸附到宿主细胞表面后，尾丝识别受体并且与受体发生结合，继而发生不可逆的结合以及噬菌体DNA的注入。T7类噬菌体的尾丝蛋白在裂解过程中扮演着重要的角色，在T7类噬菌体中，人们普遍认为噬菌体的尾丝蛋白负责对受体的识别。将纯化的尾丝蛋白与鼠疫菌共同孵育后，尾丝蛋白在体外可能直接与鼠疫菌表面的受体相互识别，相互黏附，从而与噬菌体竞争吸附受体。鼠疫菌噬菌体在宿主范围上的这种变异是与尾丝蛋白序列紧密相关的。在T7类噬菌体中，尾丝蛋白的N端复制与尾部相互作用，C端与受体相互作用，我们推测YepMm有可能采用不同的识别机制，从而识别不同的受体（图1-8）。

细菌耐药性已成为全球性的公共卫生问题，特别是“超级细菌”成员的不断增加使针对细菌感染的抗生素疗法面临前所未有的挑战。耐药性的威胁急需噬菌体治疗技术的发展最近，因此噬菌体疗法重新受到人们的关注。烈性噬菌体对宿主菌高效特异的裂解作用不影响动物机体的生理功能，且不会受到细菌耐药性的限制，因此，烈性噬菌体有可能成为用于预防和治疗细菌性感染的抗生素替代品，从而解决目前临床普遍遇到的细菌耐药性问题。另一方面，噬菌体和细菌之间频繁地互相交换着核苷酸序列，已测序的细菌基因组中有很多前噬菌体，其数量甚至超过已测序的噬菌体基因组。研究鼠疫菌噬菌体基因组有助于我们了解鼠疫菌噬菌体的遗传背景，以及其在宿主菌生理学和进化中的作用，进而帮助我们认识噬菌体在人类疾病中扮演的角色。

（四）鼠疫噬菌体对鼠疫菌在自然界中长期保存的作用

我们在日常监测中对青藏高原旱獭鼠疫自然疫源地内近千份标本的筛查中发现自毙旱獭体内烈性噬菌体分离率高达10%，活体旱獭目前未分离出烈性噬菌体。是否噬菌体在动物体内感染并繁殖的同时，在大量裂解动物体内鼠疫菌的过程中还会导致其余毒素的释放或细胞因子风暴的产生还有待进一步研究。目前国内外学者对鼠疫菌在自然界中长期保存机制以及在流行期和间歇期循环往复提出了不少假说。在动物鼠疫流行过程中，特别是流行末期、鼠疫菌在毒力、形态乃至生化特性等方面均可产生改变。在监测中我们还发现了非典型性鼠疫菌，鼠疫诊断噬菌体不裂解，这种非典型鼠疫菌较正常鼠疫菌小，生长缓慢，光学显微镜观察菌落形态与正常鼠疫菌差别较大，在现行的鼠疫诊断标准中，很容易对其产生误判。动物间鼠疫的剧烈流行，伴随着鼠疫菌的增加，同时必然伴随着噬菌体数量的增加和动物体内大量抗体的产生，从而导致非典型鼠疫菌的产生。这些菌株毒力减弱，对噬菌体产生一定的抗性，在动物中容易形成慢性带菌过程。抗鼠疫噬菌体株的发现并证明鼠疫在一定条件下可以发生变异，在动物鼠疫流行末期及流行静息期，噬菌体感染造成抗噬菌体鼠疫菌，对动物无毒力或毒力减弱，有利于宿主动物的生存和繁衍，动物间的鼠疫可以弱毒的形式延续、循环或在一定范围内潜伏。这可能是再次引起动物间鼠疫猛烈流行的潜在原因。