下篇　结核病临床

第一章　结核病细菌学诊断

【摘要】结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis，MTB）的病原学检查是诊断结核病的“金标准”，也是判断结核病活动性、传染性及治疗效果的重要手段。随着实验技术的进步和认识的提高，非结核分枝杆菌（nontuberculosis mycobacteria，NTM）的分离率呈上升趋势。我国结核病耐药形势依然严峻，NTM也不容忽视，诸多学者就相关主题进行了研究。

【关键词】结核分枝杆菌；涂片；培养；耐药；非结核分枝杆菌

病原学检查是诊断结核病的“金标准”，也是判断结核病活动性、传染性及治疗效果的重要手段。我国专家及学者在2021年就涂片、培养、菌种初步鉴定、药物敏感性试验、非结核分枝杆菌等领域进行研究，现将最新进展进行介绍。

一、涂片

杨眉等［1］尝试用巴氏染色涂片褪色行抗酸染色，探讨该方法对诊断结核病的实用价值。在134例疑似结核病患者中，53例检出抗酸杆菌，阳性率为39.6%。研究者认为巴氏染色着色于细胞核及胞质，抗酸染色着色于抗酸杆菌，两者着色对象不同，因此巴氏染色褪色后不影响抗酸染色。崔金霞［2］分析了肺结核患者痰涂片阳性（SSP）的性别差异及其相关因素，纳入2015年1月至2021年1月收治的肺结核患者，使用多元回归分析男性和女性患者SSP的相关因素。研究结果发现：SSP率男性为41.59%，女性为20.20%，性别差异显著（P ＜ 0.001）。对于男性，抽烟、艾滋病是 SSP 危险因素；对于女性，年龄 41～60 岁、年龄 61～80岁、糖尿病、医务工作者是SSP危险因素。可见男性SSP率更高，SSP相关因素因性别而异。因此，在制定SSP的预防控制计划时，应考虑性别因素进行制定。黄波等［3］比较了离心涂片法、Gene Xpert技术和改良抗酸染色法应用于早期结核性脑膜炎诊断中的临床价值，纳入2018年1月至2020年9月就诊的120例脑膜炎患者。以临床综合诊断结果为金标准，比较三种方法的诊断价值。研究结果：改良抗酸染色法对结核性脑膜炎诊断的灵敏度、特异度、准确度、阳性预测值、阴性预测值均显著高于离心涂片法、Gene Xpert技术，且Gene Xpert技术显著高于离心涂片法，差异具有统计学意义（P ＜ 0.05）。三种方法对结核性脑膜炎Ⅰ期的诊断符合率从高至低依次为改良抗酸染色法、Gene Xpert技术、离心涂片法，两两比较差异具有统计学意义（P ＜ 0.05）。三种方法对结核性脑膜炎Ⅱ期、Ⅲ期的诊断符合率比较，差异无统计学意义（P ＞ 0.05）。研究结论为改良抗酸染色法可更灵敏、准确地诊断早期结核性脑膜炎，值得在临床上推广。

二、培养

李昌锦等［4］评估了痰和支气管肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid，BALF）的MTB快速培养对肺结核患者的诊断价值。结果显示，痰和BALF的MTB快速培养的阳性率分别为25.6%和41.9%，差异有统计学意义（P ＜ 0.05）。以结核菌培养阳性为金标准，BALF培养的灵敏度、阴性预测值、约登指数（57.9%、75%、57.9%）明显优于痰培养（94.7%、88%、94.7%）。研究结论为BALF的MTB培养可明显提高结核分枝杆菌分离率。

三、菌种初步鉴定

赵国连等［5］分析了培养滤液MPT64抗原检测阴性MTB的MPT64基因多态性，纳入了2018年1月至2020年6月于西安市胸科医院经痰液、BALF、胸腹腔积液等标本分枝杆菌MGIT 960液体培养阳性且经分枝杆菌齐-内染色镜检确认为阳性，并有MPT64抗原检测、对硝基苯甲酸/噻吩-2-羧酸肼（PNB/TCH）生长试验和分枝杆菌菌种鉴定结果的1 962例患者的分枝杆菌临床分离株。对其中MPT64抗原检测与分枝杆菌菌种鉴定结果不一致的菌株行GeneXpert MTB/RIF和PNB培养检测，并对MPT64抗原检测阴性但菌种鉴定结果为MTB的14株菌株进行MPT64基因测序。结果显示，1 962株分枝杆菌临床分离株中88株（4.5%）为非结核分枝杆菌，1 874株（95.5%）为MTB，其中经MPT64抗原检测阴性菌株分别为87株（98.9%）和14株（0.7%）。MPT64基因测序结果显示，14株MPT64抗原检测阴性的MTB临床分离株发生MPT64基因第197～259位核苷酸缺失突变致第66～86位氨基酸缺失者达92.9%（13/14）；另1株MPT64基因在第587位点插入了1 361bp的IS6110基因片段。研究结论为MPT64基因第197～259位核苷酸缺失突变可能是导致MTB菌株MPT64抗原检测出现假阴性的主要原因，而IS6110片段的插入也可能导致MTB菌株MPT64抗原检测出现假阴性。

四、药物敏感性试验

（一）方法学评价

杨瑜等［6］研究了以检测MPT64为指标的进行MTB耐药性检测的快速方法，探讨MPT64在MTB利福平（RFP）和异烟肼（INH）耐药性检测中的应用。该方法应用结核分枝杆菌抗原检测试剂盒（胶体金法）（GICA）分别检测MTB敏感株和耐多药株在含（观察组）与不含（对照组）RFP、INH的Middlebrook 7H9液体培养基上培养3、7、10d的培养液中的MPT64，通过凝胶成像仪白光源拍照进行条带灰度分析，比较敏感株和耐多药株间的灰度比值的差异；以比例法检测结果为金标准，评价新建方法的准确度。结果发现，对照组中，随着培养时间的延长，12株MTB敏感株和11株耐多药株的灰度比值增大；观察组中，敏感株在不同的培养时间的灰度比值没有显著变化，而耐多药株则明显增大。3、7、10d敏感菌与耐多药菌在药物培养基中MPT64检测灰度比值差异均有统计学意义（P均 ＜ 0.05）。GICA检测MPT64用于34株MTB的RFP、INH耐药性鉴定的准确度分别为97%和94%，灵敏度分别为93%和86%，特异度均为100%，阳性预测值均为100%，阴性预测值分别为95%和91%。作者认为GICA检测MPT64于MTB培养7d时能准确检测抗结核药物RFP、INH耐药性，MPT64可作为MTB药物敏感性试验的有效检测指标。黄飞等［7］探讨了Xpert MTB/RIF与微量液体培养及药敏试验（微量MIC）在快速检测痰标本中RFP异质性耐药MTB价值。结果显示，Xpert MTB/RIF检出94例痰标本中MTB存在rpoB基因突变；微量MIC检测到76例痰标本中MTB对RFP耐药。以比例法药敏试验结果为判断标准，Xpert MTB/RIF检测结果同比例法药敏试验结果一致性好（Kappa=0.85），两组比较差异无统计学意义（χ2=1.17，P ＞ 0.05）；微量 MIC 检测结果同比例法药敏试验结果基本一致（Kappa=0.99），两组比较差异无统计学意义（χ2=0.25，P ＞ 0.05）。比例法药敏试验结果和微量MIC药敏报告时间分别为 52.5d 和 17.5d，差异有统计学意义（t=4.64，P ＜ 0.05）。研究结论为，微量 MIC 药敏结果与比例法药敏结果一致、但药敏报告时间明显缩短。利用Xpert MTB/RIF与微量MIC可能对快速精准检测痰标本中RFP异质性耐药MTB具有重要参考价值。余艳芳等［8］建立了以核酸飞行质谱（MassARRAY）方法检测结核耐药基因突变检测体系。纳入2016年1月至2019年6月肺结核患者的菌培养样本55例，其中药物敏感样本10例，耐多药样本45例。结果显示，与一代测序相比，核酸飞行质谱检测临床菌株异烟肼、氟喹诺酮类药物和二线注射类药物的灵敏度分别为 100%（37/37）、100%（34/34）和 100%（10/10），特异度分别为 100%（18/18）、100%（21/21）和 100%（45/45），总一致率 100%。MIC 为金标准，核酸飞行质谱检测临床菌株异烟肼、氟喹诺酮类药物和二线注射类药物的灵敏度分别为82.2%（37/45）、75.6%（34/45）和 45.5%（10/22），特异度分别为 100%（10/10）、100%（10/10）和 100%（33/33），两种方法的总一致率为89.1%，一致性检验Kappa值为0.703。可见质谱检测基因突变与最低抑菌浓度法检测结核菌耐药总体具有一定的一致性，可快速检测结核分枝杆菌的耐药性。尽管MTB的表型药敏试验（DST）需要长达6～8周，但大家对如此长的周期对MTB药物敏感性的影响知之甚少。Zhu J等［9］进行了一项前瞻性队列研究，以调查药敏周期（TAT）期间耐药的发展情况。研究结果发现，在DST进行期间，116名（32.3%）患者对四种一线药物（利福平、异烟肼、吡嗪酰胺、乙胺丁醇）发生耐药。在纳入全基因组测序的116对分离株中，21对被归类为获得性耐药，单核苷酸多态性（SNP）差异小于12。四对具有中间SNP差异的个体在相关基因型上表现出轻微差异，并被评估为混合感染。其余91对具有与外源性再感染一致的高SNP差异。结论：有必要采用快速DST方法和改进感染控制。Lin D等［10］利用16 rRNA测序技术检测和分析中国南方药物敏感（DS，n=55）、异烟肼单耐药（MRINH，n=33）、利福平单耐药（MR-RFP，n=12）、耐多药（MDR，n=26）和多耐药（PR，n=39）结核病患者的上呼吸道菌群。结果表明，肺结核患者的肺微环境更容易受到外来病原体的感染，不同耐药MTB的感染导致不同菌群的变化。通过16S rRNA测序鉴定出7种新型微生物，可作为不同耐药类型结核病的诊断标记。

（二）临床耐药情况

王璐等［11］通过对189例肺结核患者MTB临床分离株进行贝达喹啉（BDQ）的MIC测定，并从基因水平分析MTB对BDQ的耐药机制。结果显示，86.2%（163/189）的基线MTB分离株对BDQ的MIC值分布在0.06μg/ml以下，MIC₅₀和MIC₉₀分别为0.03μg/ml和0.12μg/ml；基线MTB分离株对BDQ的原发耐药率为2.1%（4/189）；患者在治疗过程中产生的BDQ获得性耐药率为1.6%（3/189）。结论为目前MTB临床分离株对BDQ的耐药率较低。Zhang J［12］等分析了北京市怀柔区监测点MTB的耐药性和突变情况。结果发现：235株MTB中，79株（33.6%）对一种或多种药物耐药。分离株包括18株单药耐药（7.7%）、19株多药耐药（8.1%）、28株 RIF耐药（11.9%）、24株 MDR（10.2%）、7株准广泛耐药（3.0%）和2株广泛耐药（0.9%）。复治患者的耐多药率高于初治患者（复治患者 34.5%，初治患者6.8%）。研究结果表明中国北京市怀柔区耐药结核病，尤其是耐多药结核病的发病率较高。Du等［13］分析了中国大连2012—2019年结核病患者的初始耐药率和获得性耐药率。卡方检验用于检验研究期间线性耐药趋势随时间的显著性。结果显示，在8年的研究期间，初始（从9.01%到4.82%）和获得性（从40.85%到9.09%）耐多药结核病例的百分比显著下降，平均年下降率分别为8.55%和19.32%。异烟肼（INH）、利福平（RFP）、氧氟沙星（OFX）和阿米卡星（AMK）耐药的个体百分比显著下降（P ＜ 0.05）。结论为，从 2012年到 2019年，初始和获得性多药耐药率呈显著下降趋势，表明中国大连市耐多药结核病流行得到了有效控制。Che Y等［14］分析了宁波市耐多药结核病分离株PZA耐药性的表型和分子特征。结果发现：宁波市耐多药结核病株中PZA耐药率为59.1%。综合耐多药结核病患者的治疗史和治疗结果，PZA耐药组中复治的耐多药结核病患者百分比高于其在PZA敏感组百分比（P = 0.027），PZA 敏感组中治疗成功患者的百分比高于 PZA 耐药组（P = 0.020）。与 PZA 敏感菌株相比，链霉素（67.7% vs 46.7%，P = 0.027）、乙胺丁醇（56.9% vs 33.3%，P = 0.015）、氧氟沙星（43.1% vs 11.1%，P = 0.000）、左氧氟沙星（43.1% vs 11.1%，P = 0.000）、准广泛耐药的百分比（38.5% vs 15.6%，P = 0.009），在 PZA 耐药菌株中出现耐药频率更高。65 株（83.1%）对PZA耐药的耐多药菌株中有54株存在位于pncA基因的突变，大多数（90.7%）为点突变。与表型鉴定相比，pncA的DNA测序灵敏度和特异度分别为83.1%和95.6%。He W等［15］分析了既往未接触新型抗结核药物的MTB对贝达喹啉、德拉马尼、利奈唑胺、氯法齐明以及广泛使用的一线和二线抗结核药物的药物敏感性。结果表明：结核分离株对德拉马尼、贝达喹啉、利奈唑胺和氯法齐明的耐药率分别为 0.7%（11/1 603）、0.4%（6/1 603）、0.4%（7/1 603）和 0.4%（6/1 603）。此外，1.0%（1/102）、2.9%（3/102）、3.9%（4/102）和 1.0%（1/102）的 MDR-TB分别对贝达喹啉、德拉马尼、利奈唑胺和氯法齐明耐药，而22.2%（2/9）的XDR-TB对德拉马尼和利奈唑胺均耐药，且无一株对贝达喹啉或氯法齐明耐药。未发现与德拉马尼耐药性相关的已知基因突变，对贝达喹啉和氯法齐明交叉耐药的4个分离株均检测到Rv0678基因突变，5株对利奈唑胺耐药的菌株中有3株在rplC基因中检测到基因突变。本研究强调了在新抗结核药物广泛使用之前对此类药物耐药性进行强化监测的迫切需要。

五、非结核分枝杆菌

周洪经等［16］总结了2018—2019年天津地区非结核分枝杆菌（NTM）菌种分布及耐药情况。282例NTM菌株分为8种，胞内分枝杆菌占比最大（29.08%），其次为龟/脓肿分枝杆菌（26.60%）和堪萨斯分枝杆菌（23.41%），鸟分枝杆菌占9.57%，偶然分枝杆菌占6.38%、戈登分枝杆菌占3.19%、瘰疬分枝杆菌占1.06%、浅黄分枝杆菌占0.71%。结论：2018—2019年天津地区NTM以胞内分枝杆菌、龟/脓肿分枝杆菌和堪萨斯分枝杆菌为主。陈华等［17］分析了广州市NTM的流行状况与菌种分布特征。结果显示，2018—2019年NTM分离率为30.3%，痰和纤维支气管镜灌洗液中分离到的NTM最多，NTM分离株中按构成比顺位依次为脓肿分枝杆菌［41.2%（1 113/2 701）］、鸟 -胞内分枝杆菌［40.5%（1 093/2 701）］、堪萨斯分枝杆菌［6.6%（179/2 701）］、偶然分枝杆菌［6.3%（169/2 701）］。另外，发现 146 株［5.4%（146/2 701）］混合感染类型。女性 NTM 感染者（n=932）多于男性（n=779），比例为 1.20：1，发病年龄主要集中于51～70岁。结论：广州市NTM分离率高于全国平均水平，感染人群多为中老年；分布种类多样，以脓肿分枝杆菌、鸟-胞内分枝杆菌和堪萨斯分枝杆菌为主。封彬彬等［18］选取2015年1月至2019年12月山东省胸科医院收治的354例NTM肺病患者的临床分离株进行菌种鉴定。结果显示，354株NTM临床分离株共鉴定出12种菌种，主要以胞内分枝杆菌（69.77%，247/354）、堪萨斯分枝杆菌（12.71%，45/354）及脓肿分枝杆菌（7.63%，27/354）为主。男性和 ≥ 45岁患者构成比［分别为 64.97%（230/354）和 84.75%（300/354）］明显高于女性和 ＜ 45 岁患者［分别为 35.03%（124/354）和 15.25%（54/354）］，差异均有统计学意义（P值均 ＜ 0.01）。朱春玲等［19］回顾性分析2016.01至2018.12徐州市传染病医院采用PCR和反向点杂交法相结合的基因芯片技术鉴定出的92株NTM的菌种类型。结果，92株NTM检出胞内分枝杆菌59株，堪萨斯分枝杆菌17株，脓肿分枝杆菌5株，龟分枝杆菌4株，戈登分枝杆菌3株，鸟分枝杆菌3株，浅黄分枝杆菌1株。可见徐州市NTM的感染以胞内分枝杆菌和堪萨斯分枝杆菌为主。柴晶晶等［20］回顾性分析2014年1月至2018年12月北京协和医院诊治的NTM病临床-影像-病原学资料，NTM培养阳性532例，这些NTM标本来自453例患者，符合诊断标准、有确切病历资料并进行菌种鉴定的有75例，男38例，女37例，年龄（50.8±16.2）岁。75例NTM病例中，鸟/胞内分枝杆菌43例（57.3%），龟/脓肿分枝杆菌18例（24.0%），堪萨斯分枝杆菌7例（9.3%）。64.0%患者存在合并症（48/75），最常见的是既往结核病史，占25.3%（19/75），其次是支气管扩张，占18.7%（14/75）。最常累及的器官是呼吸系统，占82.7%（62/75），其次是血流感染，占 25.3%（19/75）。除呼吸系统外，鸟/胞内分枝杆菌复合群（MAC）常常合并血流感染，而快速生长分枝杆菌（RGM）更常见淋巴结及皮肤软组织感染。咳嗽/咳痰是NTM肺病最常见的临床表现，占77.4%（48/62），其次是发热、呼吸困难。最常见的影像学表现为结节41.9%（26/62）、支气管扩张 37.1%（23/62）和纤维空洞 24.2%（15/62）。播散性 NTM 病中，94.7%（18/19）存在基础疾病，89.5%（17/19）合并长期免疫功能抑制。结论：NTM病最常见的菌种是鸟/胞内分枝杆菌，最常累及呼吸系统，既往结核病史可能增加NTM病风险。

（王桂荣　姜广路　唐神结）

参考文献

［1］杨眉 ，陈昱 ，唐源 .巴氏染色后的涂片褪色行抗酸染色在结核诊断中的应用［J］.临床与实验病理学杂志，2021，37（6）:745-746.

［2］崔金霞 .肺结核患者痰涂片阳性的性别差异及其相关因素分析［J］.医药前沿 ，2021，11（28）:39-40.

［3］黄波，周娜.离心涂片法、Gene Xpert技术和改良抗酸染色法用于早期结核性脑膜炎诊断中的临床价值［J］.临床医学研究与实践 ，2021，6（27）:110-112.

［4］李昌锦 ，张宝华 ，杨洁 ，等 .痰液和 BALF 的结核分枝杆菌培养对部队肺结核患者的诊断价值比较［J］.西南军医 ，2021，23（2）:105-107.

［5］赵国连 ，谈小文 ，崔晓利 ，等 .培养滤液 MPT64 抗原检测阴性结核分枝杆菌的基因多态性分析［J］.中国防痨杂志 ，2021，43（7）:659-663.

［6］杨瑜 ，李华 ，邓丽 ，等 .MPT64 在 MTB 利福平和异烟肼耐药性检测方法中的应用［J］.新医学 ，2021，52（3）:192-197.

［7］黄飞 ，陈俊林 ，瞿梅 ，等 .Xpert MTB/RIF 与微量 MIC 快速检测利福平异质性耐药的分析［J］.临床肺科杂志 ，2021，26（9）:1297-1303.

［8］余艳芳 ，赵开顺 ，屠春林 ，等 .核酸质谱检测结核分枝杆菌耐药方法的建立［J］.临床肺科杂志 ，2021，26（1）:74-81.

［9］Zhu J，Bao Z，Xie Y，et al.Additional drug resistance for Mycobacterium tuberculosis during turnaround time for drug-susceptibility testing in China:a multicenter observational cohort study［J］.Int J Infect Dis，2021，108:81-88.

［10］Lin D，Wang X，Li Y，et al.Sputum microbiota as a potential diagnostic marker for multidrug-resistant tuberculosis［J］.Int J Med Sci，2021，18（9）:1935-1945.

［11］王璐 ，薛仲探 ，王玉峰 ，等 .结核分枝杆菌对贝达喹啉药物敏感性动态监测及耐药机制研究［J］.中国防痨杂志 ，2021，43（5）:482-486.

［12］Zhang J，Ren Y，Pan L，et al.Analysis of drug resistance and mutation profiles in Mycobacterium tuberculosis isolates in a surveillance site in Beijing，China［J］.J Int Med Res，2021； 49（1）:300060520984 932.

［13］Du L，Zhang Y，Lv X，et al.Prevalence of multidrug-resistant tuberculosis in Dalian，China:a retrospective study［J］.Infect Drug Resist，2021，16； 14:1037-1047.

［14］Che Y，Bo D，Lin X，et al.Phenotypic and molecular characterization of pyrazinamide resistance among multidrug-resistant Mycobacterium tuberculosis isolates in Ningbo，China［J］.BMC Infect Dis，2021，21（1）:605.

［15］He W，Liu C，Liu D，et al.Prevalence of Mycobacterium tuberculosis resistant to bedaquiline and delamanid in China［J］.J Glob Antimicrob Resist，2021，26:241-248.

［16］周洪经 ，吴敏 ，郭明日 ，等 .2018-2019 年天津地区非结核分枝杆菌菌种分布及耐药性观察［J］.山东医药 ，2021，61（9）:77-79.

［17］陈华　，胡锦兴 ，陈品儒 ，等 .广州市非结核分枝杆菌流行状况与菌种分布特征:基于2018～2019年数据［J］.分子影像学杂志 ，2021，44（2）:378-382.

［18］封彬彬 ，金锋 ，景辉 ，等 .山东地区 439 株非结核分枝杆菌临床分离株菌种鉴定及耐药情况［J］.中国防痨杂志 ，2021，43（5）:516-520.

［19］朱春玲 ，魏素梅 ，侯远沛 ，等 .徐州市 92 株非结核分枝杆菌菌种鉴定及药敏结果分析［J］.实验与检验医学 ，2021，39（2）:278-280.

［20］柴晶晶 ，柳涛 ，孙宏莉 ，等 .某综合医院非结核分枝杆菌病临床特点分析及菌种分布研究［J］.中华结核和呼吸杂志 ，2021，44（8）:705-710.