第一节 肿瘤标志物的发展简史

肿瘤标志物的发展史可以追溯到1846年，Henrey Bence-Jones在多发性骨髓瘤患者的尿液和血清中发现了本周蛋白（Bence-Jones protein，BJP）。然而，在此之后的很长一段时间里，受限于当时的实验技术，并没有很多肿瘤标志物被发现。直到20世纪60至70年代免疫学技术的发展，特别是20世纪70年代后期单克隆抗体技术的出现，大量肿瘤标志物被发现并进入临床应用。到了20世纪80年代，随着分子生物学理论和技术的迅速发展，肿瘤标志物的发现和研究进入了基因层面。人类基因组测序完成后，伴随基因组学和蛋白组学等基础研究快速发展，分析和鉴定新基因和蛋白的技术不断涌现，如双向电泳、蛋白质谱、微流控技术、高通量测序、基因/蛋白芯片等，肿瘤标志物的研究步入了全面创新和发展的阶段。肿瘤标志物的定义也不再局限于基因和蛋白层面，循环肿瘤细胞（circulating tumor cell，CTC）、循环肿瘤DNA（circulating tumor DNA，ctDNA）和外泌体等已被证实能够较目前临床上广泛使用的部分肿瘤标志物更早期、更精准地预测肿瘤的发生和进展。

回顾肿瘤标志物的发展历史，我们可以将其分为4个阶段（表1-1-1）。

下文将从这四个阶段分别论述肿瘤标志物的发展史。

一、初步探索阶段（1846—1962）

1846年，Henrey Bence-Jones在一例骨髓瘤患者尿液中发现一种具有特殊凝溶性质的蛋白质。将多发性骨髓瘤患者的尿液加热至60℃左右时，尿液中出现絮状沉淀，继续加热至100℃时，絮状沉淀溶解。当尿液冷却至60℃左右时，絮状沉淀再次出现。后经证实这是由患者的浆细胞产生、经尿液排泄的蛋白质，并被命名为本周蛋白，作为多发性骨髓瘤的生物学标志物。但是限于当时的实验技术，直至1962年，Edelmann才阐明本周蛋白实为免疫球蛋白的轻链（主要以轻链的二聚体形式存在）。本周蛋白的发现，开创了肿瘤标志物的新时期。

1930年，Zondek、Aschheim等人从孕妇尿液中发现一种具有生物活性，与促黄体生成激素类似的促性腺激素，早期文献称之为促生殖性腺激素，现称人绒毛膜促性腺激素（human chorionic gonadotropin，HCG）。HCG与滋养细胞肿瘤、生殖细胞瘤和非滋养细胞肿瘤存在关联。HCG的α链与促黄体激素、促卵泡激素、促甲状腺激素等激素近似，有免疫交叉反应；β链是HCG所特有的。β-HCG是滋养细胞肿瘤的重要标志物。血清中HCG和β-HCG的表达水平与绒毛膜癌及其他滋养细胞肿瘤的预后相关，高浓度HCG和β-HCG的绒毛膜癌患者预后较差。目前的研究证实HCG的表达与多种肿瘤的发展密切相关，除上述肿瘤外，还HCG在睾丸肿瘤的诊断中起着重要的作用。

1959年，Markert发现牛心乳酸脱氢酶结晶经电泳，可分成五条区带，首次提出了同工酶的概念。同时他发现某些酶及同工酶活性的增高与特定的肿瘤发生发展相关，如乳酸脱氢酶在转移性结直肠癌、肺癌、乳腺癌和淋巴细胞与粒细胞白血病患者中升高；碱性磷酸酶的升高多见于前列腺癌，特别是当肿瘤侵及腺体外或发生骨转移时；γ-谷氨酰转肽酶在原发性或转移性肝脏肿瘤、胰头癌、肝外胆管癌中活性升高，且不受妊娠的影响；其他酶类，如肌酸激酶、5＇-核苷酸酶和组胺酶等由于缺乏特异性或敏感性低，已不再被临床使用。

继Brown描述了第一例由小细胞肺癌引起的库欣综合征后，在1962年，Meador首次提出异位促肾上腺皮质激素分泌瘤。研究者发现切除肿瘤可使这类患者的库欣综合征得到缓解，同时，研究者们还在切除的肿瘤组织中分离出促肾上腺皮质激素，证明这类库欣综合征是由垂体外的肿瘤分泌促肾上腺皮质激素（adrenocorticotrophic hormone，ACTH）引起的。随后，Azzoparid和Wiliams指出，伴有全部或部分皮质醇增高症的肿瘤，多数为肺燕麦细胞癌，其次为胸腺瘤，再次为胰岛细胞瘤、支气管癌和甲状腺髓样癌，较少见的为胃肠道肿瘤、前列腺癌、卵巢类癌、卵巢腺瘤、甲状腺癌和嗜铬细胞瘤等。这些肿瘤产生一种类ACTH物质或类ACTH释放因子，刺激肾上腺皮质释放激素引起满月脸、妇女多毛症、向心性肥胖、多血质和紫纹等临床症状。

1846—1962年，研究人员发现了与肿瘤相关的标志物，包括激素、同工酶、蛋白质等，虽然这些标志物被广泛应用，但是经过相当长的时间后，这些标志物的理化特性才被人们逐渐认识。以上时期被称为肿瘤标志物的开创期或初步探索阶段。

二、临床应用阶段（1963—1979）

肿瘤标志物发展的第二阶段即肿瘤标志物的临床应用阶段，开始于1963年Abelev通过琼脂凝胶沉淀法发现小鼠接种肝癌可合成甲胎蛋白（α-fetal protein，AFP）。随后Tatarinov在原发性肝癌患者血清中检测到AFP并证实肝癌细胞能够产生AFP促进肿瘤细胞增殖，由此广泛地应用于临床诊断和筛查。AFP是胎儿肝脏和卵黄囊在个体发育中合成的主要蛋白，AFP的合成也存在于肝脏再生过程中。

1970年前后，大型研究证实了AFP诊断原发性肝癌的有效性：在参与研究的中国香港和美国东部地区的肝细胞癌患者血清中AFP检出率分别为65%、50%，而在健康成人血清中均未检出AFP。另外，在这些研究中，研究者并未在患有其他肝脏疾病（通常可能与AFP产生相关的疾病）的患者血清中检测到AFP的表达。虽然睾丸胚胎细胞癌也可出现血清AFP表达增高，但是在参与这些研究的6例睾丸胚胎细胞癌患者的血清中未检测到AFP的表达。此外，研究者在1/2的原发性肝癌患者的肝癌组织提取物和1/3的睾丸胚胎细胞癌患者的睾丸提取物中检测到AFP，而在其他肿瘤中没有检测到AFP表达。

1965年，Gold和Freeman发现在肝转移的结直肠癌及胎儿结肠黏膜中具有一种共同抗原，称之为癌胚抗原（carcinoembryonic antigen，CEA），随后又在内胚叶发生的胃及胰腺中查到这种抗原。故当时认为这种抗原可应用于消化道肿瘤的诊断及肿瘤的细胞学分析。1971年，Paul Lo Gerfo通过放射免疫法（该检测方法能够使CEA在低离子强度下暴露其抗原位点）测定了674例住院患者的血清或血浆中CEA的表达情况。在299例非肿瘤性疾病住院患者中，有11例患者血清标本中的CEA水平升高。随后，研究者发现在这11例患者中有2例发生了先前未诊断出的内胚层来源的腺癌。在已确诊肿瘤的患者中，101例结肠腺癌患者中的87例、45例乳腺癌患者中的30例、35例肺癌患者中的26例、51例前列腺癌患者中的20例血清CEA表达水平升高。因此，CEA可能在多种肿瘤患者血清中表达升高，而不具有癌种特异性。

三、深度探索阶段（1980—2004）

（一）癌基因、抑癌基因的发现

病毒癌基因（viral oncogene）是指存在于病毒（大多是反转录病毒）基因组中能使受病毒感染的宿主细胞发生恶性转化的基因，它不编码病毒结构成分，对病毒复制不起调控作用，但是当受到外界条件激活时可产生诱导肿瘤发生的作用。src基因（sarcoma gene）是在鸡肉瘤病毒（SRV）基因组中发现的第一个病毒癌基因，实验证明缺失src病毒癌基因的病毒突变体能够感染细胞并进行复制，但是不能致癌。后续研究发现人、动物细胞内存在病毒癌基因的同源基因，且该癌基因编码蛋白促进细胞生长。据此推测基因是导致癌变的原因。

细胞癌基因（cellular oncogene）是在正常细胞基因组中对细胞正常生命活动起主要调控作用（正调控，抑癌基因为负调控）的基因，一旦发生突变或特异激活可使细胞发生恶性转化。1981年，Robert Weinberg和Geoffrey Cooper分别在转基因实验中发现了ras癌基因，他们用从人肿瘤中提取的DNA转染培养小鼠NIH/3T3成纤维细胞，成功地诱发其转化，证明人肿瘤细胞中含有癌基因。这是第一次在人肿瘤中发现有生物学活性的细胞癌基因。至今先后分离了一百多种癌基因，常见的有C-myc、kras、BRCA1、HER2、EGFR等。相反，抑癌基因（tumor suppressor genes）是指抑制细胞过度生长、增殖，从而遏制肿瘤形成的基因。在正常组织中正常表达，在肿瘤组织中，往往有DNA片段缺失、点突变或表达缺陷等。1986年人类第一个抑癌基因Rb基因（retinoblastoma gene）成功被克隆出来。迄今为止，已有三十余种抑癌基因被鉴定或克隆出来，常见的有Rb、p53、p16、APC、WT1等。

在癌基因、抑癌基因的研究基础上，人们发现在恶性肿瘤演化进程中，常常积累一系列的基因突变，包括原癌基因、抑癌基因、细胞周期调节基因、细胞凋亡基因及维持细胞基因组稳定性基因等。这些基因都可能被选作肿瘤诊断标志物。

（二）血清学肿瘤标志物的广泛应用

随着免疫学技术的发展，越来越多的血清学肿瘤标志物被发现，肿瘤标志物与临床更紧密地联系了起来。George Kohler和Cesar Milstein在Nature上发表文章，第一次描述应用杂交瘤技术获得单克隆抗体的方法，在生产和使用抗体方面开创了新纪元，同时给免疫学乃至整个生物医学带来了一次巨大的革命。基于此，研究人员发现了大量新的肿瘤抗原性肿瘤标志物，如糖类抗原（CA）125、CA19-9、CA15-3、前列腺特异性抗原（prostate-specific antigen，PSA）等。例如，1981年，Bast Jr对一名卵巢癌患者的癌组织进行了体外培养，通过杂交瘤技术获得了166种单克隆抗体，并依次编号为OC1～OC166。后续筛查发现，第125号抗体（即OC125）对卵巢癌的敏感性、特异性都很高，是一种理想的检测卵巢癌的单克隆抗体。随后，Bast Jr将OC125这种单抗所识别的抗原物质称为“癌抗原125”，即CA125。CA125对卵巢上皮癌、输卵管癌、子宫内膜癌、宫颈癌及间质细胞癌等有较高的诊断价值，且目前仍在临床上广泛应用。研究人员又相继发现了CA19-9和CA15-3，分别被用于结直肠癌、胰腺癌和乳腺癌的诊断。

由于这些肿瘤标志物在健康人血清中存在，在肿瘤患者中的表达显著升高，因此它们被认为是诊断早期肿瘤的重要标志物。但是，这些肿瘤标志物缺乏癌种特异性，如CA125也可以在非女性生殖系统肿瘤以外的肿瘤中高表达。

在这些肿瘤标志物中，最值得我们注意的是PSA。由于PSA对前列腺癌具有较高的特异性和敏感性，已被广泛应用于前列腺癌的筛查。得益于PSA在临床的广泛应用，越来越多的前列腺癌患者在疾病早期被诊断出来，并得到了治疗。因此，在1989—1996年，虽然美国前列腺癌发病率一直在升高，但是前列腺癌的死亡率却以每年2.5%的速度稳步下降。此外，PSA还是监测前列腺癌复发转移的重要标志物：在接受过治疗（前列腺切除或放疗）的患者血清中PSA的表达处于非常低的水平，血清中PSA水平的再次升高提示肿瘤复发和/或转移。然而，PSA也存在一定的弊端：前列腺癌的诊断仍然依赖于临床组织病理学，单纯血清PSA升高并不能诊断前列腺癌。

随着自动化技术及计算机的广泛应用，免疫学检测技术也出现质的飞越，出现自动化、快速、敏感、稳定、能定量分析、无放射危害的检测技术和仪器，比如时间分辨免疫荧光分析及电化学发光免疫分析。标志物数量增多、检测质量提高，这使得血清学肿瘤标志物大规模、广泛应用于临床。

四、创新发展阶段（2005—）

（一）高通量测序在肿瘤基因检测中的应用

21世纪初，随着人类基因组测序的完成，肿瘤标志物的发现和应用进入后基因时代。第一代测序Sanger sequencing在人类基因组测序过程中发挥了重要作用，但是其通量小、成本高、速度慢、敏感度低等缺点限制了肿瘤基因检测的临床应用。2005年第一台高通量测序仪（Genome Sequencer 20 System）的诞生给测序界带来变革，该测序仪是第一个基于焦磷酸测序原理的高通量基因组测序系统。这是核酸测序技术发展史上里程碑式的事件。高通量测序（high-throughput sequencing）又称新一代测序（nextgeneration sequencing，NGS）、二代测序，其一次性对几百万到十亿条DNA分子进行并行测序，可对一个物种的转录组或基因组进行深入、细致、全貌地分析。高通量测序与第一代测序技术相比具有成本低、速度快、通量高的特点。这使得高通量测序技术在肿瘤的临床和基础研究中广泛应用。高通量测序不仅能检测已知基因的核苷酸序列和表达量，还能发现新的与肿瘤相关的基因。目前基因检测主要用于肿瘤风险预测、肿瘤预防、肿瘤诊断、指导靶向治疗、预测疗效和预后。如BRCA1突变基因可预测乳腺癌、卵巢癌，有癌症家族史的女性可以借助NGS技术进行BRCA检测，预防乳腺癌、卵巢癌。检测表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor，EGFR）突变情况可指导酪氨酸激酶抑制剂的临床使用。

除二代测序外，第三代单分子测序技术也在不断涌现。目前最具代表性的包括Heliscope单分子实时合成测序法和纳米孔测序技术。相信随着硬件和软件的不断发展、数据处理能力的增强、实验经验的积累，测序技术会逐渐成为肿瘤主要的、常规的检查项目。

（二）液体活检日新月异

液体活检利用血液等体液（通过非侵入性取样降低活检危害）中的成分作为生物标志对疾病进行的检测、诊断和监控。液体活检技术主要包括外泌体检测、循环肿瘤细胞检测、循环肿瘤DNA检测等。

2016年1月，世界首款外泌体肿瘤诊断产品ExoDx Lung（ALK）上市。ALK分析血液外泌体中EML4-ALK融合基因，可用于非小细胞肺癌的诊断及筛选非小细胞肺癌患者采用ALK抑制剂靶向治疗。

2018年1月，艾德生物研发的血浆DNA样本中EGFR基因突变检测试剂盒，通过国家市场监督管理总局审批上市，用于临床检测晚期非小细胞肺癌患者血液循环肿瘤DNA中EGFR基因突变状态，以及筛选适合接受一至三代EGFR靶向药物治疗的患者。

2018年2月，我国自主研发的“CellRich”循环肿瘤细胞检测系统及配套试剂获国家市场监督管理总局批准，其通过免疫纳米磁微粒并结合微流体芯片技术捕获循环肿瘤细胞，进行肿瘤诊断和肿瘤病情监测。且其捕获的循环肿瘤细胞可做后续个性化用药基因检测，取代穿刺，实现精准治疗。

（三）“精准医学”背景下肿瘤标志物的发展

2011年，美国科学院、美国国立卫生研究院、美国工程院及美国科学委员会共同发出“迈向精准医学”的倡议。精准医学是根据每位患者的个体差异来调整疾病的预防和治疗方法，是一种根据患者的不同，进行量身定制医疗方法的医疗模式。在此背景下，肿瘤标志物的研究已经从当初局限于少数蛋白质扩展到基因组、转录组、蛋白质组、代谢组、表观基因组、微生物生态组信息来分型，实现肿瘤防治的精准医学。基于基因分型的个体化治疗是未来的发展方向，临床上期望针对肿瘤不同临床分期的“分子分型”或“基因分型”来制订个体化治疗方案。分子靶向治疗是指针对参与肿瘤发生发展过程的细胞信号转导通路和其他生物学途径的治疗手段，其特异性强、疗效好。治疗的靶点有Ras/Raf/MEK/ERK、PDK/AKT/mTOR等信号转导通路，以及表皮生长因子受体、血管内皮细胞生长因子受体、血小板衍生生长因子受体等靶向位点。

基于分子靶点的抗肿瘤药物的研发成为肿瘤治疗的新趋势，相信未来会有更多的肿瘤标志物应用于临床，如肿瘤特异性甲基化基因、循环肿瘤细胞、循环肿瘤DNA、肿瘤外泌体、微小RNA（microRNA，miRNA）等，以满足肿瘤的早期筛查、精确诊断、预后判断、疗效观察、复发监测和靶向治疗。

（罗迪贤，姚煜，傅潇，朱乐攀）