第三节 常用高通量筛选技术——质谱技术
一、蛋白质组学技术及其应用
蛋白质组学的研究对象是细胞、组织或有机体中存在的全部蛋白质。采用蛋白质组学技术可以实现对蛋白质的定性和定量分析，获得蛋白质在不同病理生理条件下的表达水平、结构变化、功能、相互作用和修饰等信息。利用这些信息可以了解基因表达水平变化，认识细胞和有机体的生物学状态。蛋白质组学技术在疾病诊断、预后和疾病分子机制研究方面正在发挥着重要作用。目前，常用的蛋白质组学技术可分为非靶向的蛋白质标志物发现技术和靶向的蛋白质标志物验证和定量技术。
（一）非靶向的蛋白质标志物发现技术
非靶向的蛋白质组学技术主要用于疾病标志物的筛选和分子机制研究。常用的有两种标记试剂：①iTRAQ（isobaric tag for relative and absolute quantitation）是一种多肽定量分析的体外标记试剂，该试剂由报告基团（reporter group）、平衡基团（balance group）和氨基反应基团（amino reactive group）组成，标记试剂的氨基反应基团与多肽的氨基基团发生化学反应，实现对多肽的标记。目前该试剂盒最多可分别标记8个样品中的多肽。具体实施步骤是将来自多个样品的蛋白质进行胰蛋白酶酶解，按照试剂公司提供的标记方法分别标记每个酶解液中的多肽的氨基基团，标记后的多肽样品等量混匀后，经液相色谱-串联质谱分析，可以获得被标记多肽的碎片离子及其报告离子的信号强度，利用生物信息学方法可以鉴定这些多肽对应的蛋白质及其在这些样品间的表达水平差异，这些差异表达的蛋白质可能是潜在的标志物。②TMT（tandem mass tag）是另外一种多肽定量分析的体外标记试剂，该试剂由质量基团（mass reporter）、质量归一化者（mass normalizer）和氨基反应基团（amino reactive group）组成，标记试剂的氨基反应基团与多肽的氨基基团发生化学反应，实现对多肽的标记。目前该试剂盒最多可分别标记11个样品中的多肽。具体的实施步骤同iTRAQ试剂的实施步骤，详细的标记试剂反应条件参见试剂盒的说明书。上述两种多肽的体外标记试剂也可用于药物作用靶点、动植物抗病/抗胁迫机制和动植物发育分化机制等领域的研究。
（二）靶向的蛋白质标志物验证和定量技术
在基于质谱技术的蛋白质标志物验证及其后续的应用中靶向的蛋白质定量分子技术发挥重要作用。但由于蛋白质分子较大，目前的蛋白质定量分析主要是基于对其对应多肽的定量分析。利用液相色谱将多肽分离，采用串联质谱技术实现MRM（multiple reaction monitoring）检测，该质谱技术是利用串联质谱仪中的第一个质量分析器选择目标多肽的离子，碰撞碎裂这些目标离子，利用第二个质量分析器采集目标多肽的特征碎片离子。MRM质谱技术是一种高精度的蛋白定量技术，可以在一次实验中精准定量复杂样品中的多个目标多肽，实现对多个目标蛋白质的定量分析。通过添加放射性核素标记的目标多肽作为内参，可实现对目标蛋白的绝对定量分析。PRM（parallel reaction monitoring）是一种基于高分辨和高精度质谱仪开发的蛋白质定量分析技术。该技术是利用串联质谱仪中的第一个质量分析器选择目标多肽离子，碰撞碎裂这些目标离子，利用第二个具有高质量分辨和高质量精度的分析器采集所选择的目标多肽离子的所有碎片信息，实现对复杂样本中的目标蛋白质进行准确定量分析。
二、代谢组学技术及其应用
代谢组学是继基因组和蛋白质组学之后发展起来的新兴的组学技术，是系统生物学的重要组成部分。其研究对象是分子量1000Da以下的小分子物质，如糖、有机酸、脂质、维生素、氨基酸、芳香烃之类的化合物。研究代谢物的表达变化，代谢物与病理生理变化的关系，能够帮助寻找新的标志物，发现新的代谢途径，以及更进一步深入了解目前已知的代谢途径，应用于疾病的早期诊断、药物靶点的发现，疾病的机制研究及疾病诊断等方面。
代谢组学的分析目标是对生物体系中尽可能多的内源性代谢组分进行无偏差的定性、定量测定，分析过程应尽量保留生物样品中代谢物的整体信息。完整的代谢组学流程包括样品采集、预处理、数据采集和数据分析及解释。
对于代谢组这样复杂的研究体系，理想的检测方法应该具备无偏向、良好的分辨率和重现性、高敏感性和系统性、样品制备的简易性和高通量分析可操作性等。现阶段的分析技术主要包括核磁共振波谱、质谱、色谱等。目前以核磁共振波谱法和质谱法以及色谱质谱联用的方法应用最为广泛。
（一）核磁共振波谱技术
核磁共振波谱技术是代谢组学研究中最常见的分析方法。核磁共振波谱技术能够实现对样品的非破坏性、非选择性分析，满足代谢组学中对尽可能多的化合物进行检测的目标。样品只需要简单预处理，且样品可回收用于其他分析；无损伤性，不会破坏样品的结构和性质，可在一定温度和缓冲范围内进行生理条件或接近生理条件的实验。并且可与外界特定干预相结合，研究动态系统中机体化学交换等代谢产物的变化规律，可以进行实时和动态检测，没有偏向性。
（二）色谱质谱联用
质谱具有较高敏感性和专属性，可以实现对多个化合物的同时快速分析与鉴定。气相色谱质谱联用（GC-MS）、液相色谱质谱联用（LC-MS）等技术，是对代谢物逐一定性定量时不可或缺的手段，而且在进行相对分子质量测定及分子推算时，质谱是无可取代的。采用GC-MS可以同时测定几百个化学性质不同的化合物，该分析技术是代谢组学研究常用的、经典的分析手段。另外，GC-MS最大的优势是有大量可检索的质谱库。GC-MS在植物和微生物代谢指纹分析上应用较广。LC-MS的优势是，在大多数情况下不需要对非挥发性代谢物进行化学衍生。相对于GC-MS，LC-MS能分析更高极性和更高相对分子质量的化合物。
三、小结
近年来，已有多种形式的非靶向和靶向的蛋白质组学技术报道。非靶向的蛋白质组学分析技术可以同时对多达11个样品中的多种蛋白质定量分析，靶向的蛋白质定量分析技术为蛋白质标志物的验证和应用提供了新的技术手段。但利用上述技术发现的肿瘤诊断和预后蛋白质标志物难以在大样本量的验证中表现出高敏感性和特异性。因此，在蛋白质标志物发现和验证过程中以下方面需要特别注意：临床样本的化学成分极其复杂，研发合理的临床样品前处理方法对获得可靠的实验结果至关重要，是筛选和验证蛋白质标志物要解决的关键技术之一；蛋白质翻译后修饰极其复杂，结构决定蛋白质的功能，获得肿瘤特异的蛋白质是筛选和验证蛋白质标志物的关键技术之二；准确鉴定蛋白质结构（一级结构）是筛选和验证蛋白质标志物的关键技术之三。因此，基于目前的蛋白质组学技术筛选高敏感性和高特异性的蛋白质标志物仍面临严峻挑战。
（李智立，林树海）