第四节　基于分子和细胞的药物发现与高通量、高内涵筛选

随着分子生物学、人类基因组、蛋白质组等生命科学和技术方法的发展，药物靶点的发现和确证已经成为生命科学领域研究热点，而基于药物靶点的药物发现也成为发现新药的主要手段。在此条件下，高通量筛选（high throughput screening，HTS）技术和高内涵筛选（high content screening，HCS）技术也就应运而生，成为现代药物发现的重要技术。同时，伴随着高通量药物筛选技术的应用和发展，相应的研究策略和理论也在不断发展，推动了新药发现的技术进步和新药研发的进程。

一、高通量筛选技术

（一）高通量筛选技术的特点

高通量筛选技术产生于20世纪80年代后期，是生命科学、计算机科学、材料科学和自动化技术等多种技术发展的综合结果，是药物研发技术进步过程中的必然产物。

高通量筛选包含两个方面的内容：一是实施筛选的设备条件，即硬件条件；二是高通量筛选的管理和策略。实际上，高通量筛选并不仅仅是物理上的通量的提高，更重要的是改变了药物筛选的策略和指导思想。而后者才是真正的高通量筛选的核心内容。高通量筛选的概念提出之后，受到了广泛的关注，催生了自动化、微量化的集成仪器设备的更新换代，提高了药物研发的技术能力，目前已经成为药物筛选的普通技术方法，但实现高通量药物筛选发现新药的目的，还需要认真的研究和努力。

（二）高通量筛选的基本条件

1.高通量筛选的硬件条件

（1）操作设备

1）高通量全自动样品处理工作站：

适用于全自动、高通量应用，96孔板形式从细胞、组织和血液中全自动纯化RNA、从拭子、血液和法医样本中全自动纯化DNA。

2）全自动高通量药物配样系统：

药物配样系统是高产出固体形态和溶解度筛分的自动化平台。该系统可大量产出多晶体、盐和共晶体并进行药物活性成分的溶解度筛分。

3）高通量全自动移液稀释机器人：

移液加样是一项精准、费力的工作，采用自动移液器则可大大增加移液工作的精确性，有效避免人工移液的多种弊端，从而得到更准确、可重复的实验结果。

（2）检测设备

1）多功能酶标仪：

酶标仪是一种用途广泛的生物检验医疗设备，利用酶联免疫分析法，根据酶标记原理，根据呈色物的有无和呈色深浅进行定性或定量分析。该仪器适用于多种指标的检测，包括吸光度、荧光强度、化学发光、时间分辨荧光等。

2）高内涵筛选（HCS）检测仪器：

利用显微镜、图像处理技术及可视化工具从细胞或细胞群中提取数据，获得定量分析结果。HCS可用于高通量的荧光成像和荧光强度定量分析。目前，已开发出用于自动标定的细胞及细胞核染料，如蓝色荧光标记物DAPI用于细胞核染色；已开发出用于检测细胞健康的可靠的功能性探针；建立了可自动化处理的灵活检测流程，可实现多重检测的荧光探针和检测方法。

3）高通量全自动膜片钳系统：

Sophion QPatch系列全自动膜片钳产品是世界上最早出现的高通量全自动膜片钳。它采用平面电极芯片技术，极大地提高了膜片钳技术的通量，与单一细胞记录的传统膜片钳技术相比，更加适用于离子通道的基础研究以及高通量筛选。

（3）数据处理：

数据处理是高通量和高内涵筛选的重要环节，正确和高效地对由筛选获得的大量数据进行处理，是获得准确筛选结果的重要过程。HTS是一个基于信息的药物发现系统，因此，在药物筛选的各个环节需要准确记录和处理各种信息。

1）在样品信息方面，需要详细记录样品信息，收到样品要记录样品编号、送养人姓名、送养人单位、送样课题组负责人及其联系方式、测试目的。根据样品是粗体物还是单体化合物，需要分别记录详细信息。化合物纯品还要包括：样品序列号、化合物名称、结构式、分子式、相对分子质量及其他理化性质；粗提物包括：材料来源、原材料拉丁文名称、部位、提取方法等。

2）在HTS筛选模型方面，为便于对药物筛选活性数据进行科学分析，HTS的模型记录尽可能采用简洁的语言对模型原理、设计思路、药理作用机制等进行简要说明，并作为活性报告的一部分内容。筛选模型建立后，将模型代号、模型名称、阳性对照、阴性对照、分子靶点、操作人、负责人、实验日期、操作步骤等信息保存到HTS模型库。

3）在HTS数据的采集方面，HTS活性数据主要由测试样品的使用浓度和检测数据组成。检测数据随模型的不同而以不同的形式呈现，各种检测系统可以提供多种数据输出形式，以便于处理软件调用。

4）在HTS实验数据分析方面，成功的HTS可获得样品的生物活性检测数据，对这些检测数据进行分析将其转化成活性报告是生物活性数据分析的中心环节。对实验数据分析，除了计算每一个样品的活性数据外，还应分析大量样本数据的有效程度即对每一批次筛选质量进行评估。

5）在HTS活性数据库的管理与使用方面，生物活性数据库是HTS的主要成果，管理重点在于保证数据的真实性并保护送样人的利益，检查确证后加入活性数据库后，处于只读状态，不得对其更改。此外，样品数据库与生物活性数据库进行分开管理，以避免研究成果的泄密。总之，HTS生物活性数据的处理以生物活性数据的加工与处理为主体，综合利用化合物的结构信息资源，可以更好地设计药物，加快药物的发现速度。

2.高通量筛选的物质条件

（1）样品和样品库：

样品库是高通量筛选的重要物质基础和条件，根据样品来源主要分为三类：天然产物、化学合成、生物合成。

1）天然产物的分离纯化与合成：

天然产物的活性成分包括黄酮、多酚、甾体、生物碱、萜类等数百种，具有活性成分含量低、成分体系复杂、生命和非生命物质共存、其中许多成分对热敏感、易水解的特点。特别是许多活性成分存在结构相近的异构体而导致难以分离，因而天然产物活性成分的分离纯化是天然产物化学研究的重要领域。目前，天然产物提取分离纯化技术主要包括高速逆流色谱、膜分离技术、分子蒸馏技术、超临界流体萃取技术、分子印迹分离技术、半仿生提取法等新型技术。

天然产物作为动植物、微生物和海洋生物的次级代谢产物，具有结构及生物活性的多样性和独特性，但天然产物往往含量比较低，难以满足人类治病的需求，因此，多需要进行结构改造。天然产物的合成又分为全合成和半合成。全合成是确定复杂天然产物精确化学结构的直接和有力的方法，可以突破天然材料的限制，解决自然界没有的衍生物。以天然产物为先导物，经过结构修饰和改造，获得活性更强、毒性更低、理化性质更优越、成本更低的天然产物的衍生物或合成代用品。

2）化学合成与组合化学：

传统的有机合成方法反应速度慢，反应过程耗时长，很难满足高通量筛选过程对新化合物的需求。组合化学（combinatorial chemistry）可以在短时间内建立化合物库，很大程上度提高了新化合物的合成速度，增加化合物的数量和多样性，有利于新药发现。但是组合化学技术合成得到的化合物结构比较单一，难以建立结构多样性的优质化合物库。

近年来在组合化学基础上发展起来的微波促进组合化学（microwave-assisted combinatorial synthesis chemistry）技术可以弥补这一不足，将微波法与组合化学技术结合起来，可拓宽组合化学的应用范围。

3）生物合成：

天然来源的化合物，因其化学合成步骤繁杂、条件苛刻、成本高、收率低、环境污染等问题，实现工业化规模生产比较难。此外，植物资源生长周期长、难度大，药效物质丰度低，野生药材资源过度开发及环境破坏，导致生产成本居高不下。受限于药源种类、生长区域、采集季节、采收方法等多方面因素，药效物质收率、含量参差不齐，影响药品质量。因此，以植物内生真菌分离、发酵及其生物合成可能是解决药物资源的一条有效途径。随着分子生物学和代谢组学的发展，综合利用基因过表达或敲除、基因编辑、稳定同位素标记等方面技术剖析生物合成机制，同时构建高效的生物组织快速繁殖和遗传转化体系，为缓解药物供求矛盾，保护自然资源和生态环境奠定扎实基础。

（2）筛选模型和分析方法：

高通量筛选模型的设计应符合以下基本要求，包括①特异性：指该模型能够反映某种疾病的病理过程，筛选结果可以说明药物的作用原理，证明药物与靶点是否发生了特异性的相互作用。②灵敏性：能够灵敏地反映样品在该模型上的作用。③稳定性。④可操作性，可进行大规模实验。

3.常用高通量筛选模型

（1）分子水平药物筛选模型：

分子水平筛选模型是高通量筛选中使用最多的模型，根据生物分子的类型，主要分为酶、受体、离子通道和其他类型的模型。

1）以酶作为药物靶点：

生物酶在疾病进程中参与病理性代谢、信号转导、蛋白质加工或免疫反应等过程，酶活性的变化可以快速调节机体的生理功能或病理过程，因此，有些酶可以成为药物靶点。激酶、磷酸酶、蛋白酶和肽酶是最常见的靶点，荧光分析是最常用的检测方法。检测酶活性的方法很多，包括酶反应的底物、产物等都可用作检测指标，反应大多在均相的环境下进行。检测方法主要有比色法、荧光法、发光法、放射性核素法等。这些常用方法将在后文进行介绍。

2）以受体作为药物靶点：

受体与许多重要疾病的发生发展密切相关，占所有药物靶点的60%以上。筛选作用于受体的药物，通常使用放射标记竞争结合分析法，具有灵敏度高、特异性强等特点，适合于大规模筛选。近年来也有一些新的方法出现，如荧光偏振、反酵母双杂交技术等，检测的指标均为反映样品与受体分子的结合情况。

3）离子通道作为药物靶点：

离子通道一般位于细胞膜上，可以通过检测通过通道的速率，评价化合物对离子通道的影响，评价其药用价值。检测离子通道可以用细胞芯片与膜片钳技术相结合，实现大规模的筛选。

4）其他：

药物靶点有多种类型，基本上都是生物分子状态，在靶点的基础上建立评价化合物相互作用或活性的筛选方法，是高通量药物筛选的常用模型。

（2）细胞水平药物筛选模型：

细胞水平药物筛选模型能观察被筛选样品对细胞的作用，能够反映出药物对细胞生长过程、作用途径的综合作用。用于药物筛选的细胞水平模型包括动物细胞、植物细胞、微生物细胞或经过基因工程技术转基因的特殊细胞。

与分子水平药物筛选模型相比，细胞水平药物筛选模型的优点是：①为靶点分子提供一个类似于机体的环境和生理条件；②可以检测化合物分子是否能够进入细胞并达到靶点分子所在部位；③阳性化合物出现概率较低；④可筛选得到前体药物；⑤通过细胞水平筛选得到的活性物质，在动物水平有效的可能性相对较高。

与分子水平筛选模型相比，细胞水平筛选模型的缺点是：①有时灵敏度相对稍差；②操作相对复杂；③筛选成本相对较高。药物对细胞的作用可以有多种表现，如基因转录、离子通道开关、细胞毒性、细胞分泌、蛋白质表达、酶活性变化等。

细胞水平模型应用极为广泛，几乎涉及新药活性筛选的每一个领域。但是目前对细胞水平模型尚无明确分类，可进行如下分类。

1）按细胞来源分类：

可分为基于原代培养的原代细胞模型和基于永生的细胞株（系）的细胞模型。前者如以大鼠大脑皮质神经元、人脐静脉内皮细胞、小鼠腹腔巨噬细胞等建立细胞模型，后者多为以各种永生性细胞，如CHO细胞、293细胞尤其是种类繁多的肿瘤细胞株等建立细胞模型。

2）按构建模型的细胞种数分类：

可分为单种细胞模型和多种细胞模型。前者为模型中仅仅含一种细胞（目前的细胞模型绝大多数为此类）；后者为两种或以上不同种类细胞共同培养（目前以两种细胞共培养居多），如基于内皮细胞-平滑肌细胞共培养、免疫细胞和肿瘤细胞共培养等建立的细胞模型。

3）按细胞培养的维度分类：

可分为二维和三维细胞模型。前者为最为常见的细胞培养，培养容易，但其无法模拟体内细胞真正的组织结构。后者是采用立体培养模式，培养困难，但更能体现细胞的真实生存环境，目前在肿瘤药理学研究方面应用较多。

4）按模型的制备方法分类：

可分为生理性/病理性细胞模型、转基因细胞模型、条件培养模型等。

A.生理性/病理性细胞模型：是指采用生理性的（内源性活性成分）、物理性的（缺氧-复氧、高压力、流体力、牵张力、声音、振动等）、化学性的（如过氧化氢、鱼藤酮等）方法刺激细胞，产生生理性激活或者病理性损伤，用以评价药物的作用并探究机制。该类模型多数较为成熟，制备模型成功率高、重复性好、机制研究较为清楚、操作简单，是目前应用最为广泛的细胞模型。

B.转基因细胞模型：是采用分子生物学技术手段，尤其是基因的敲入和敲除技术，实现在细胞中对特定基因、蛋白质的高表达和低表达之后，观察药物的作用，以探讨药物作用机制、确定药物作用靶点为主要目的的模型。虽然该类模型操作较为复杂，技术要求较高，但因其在分子机制阐明方面的优势，应用越来越广泛。

C.条件培养模型：该模型在广泛意义上可归为生理性/病理性细胞模型。其主要是利用药物处理或不处理的培养A种细胞后的培养基（含有A细胞在培养过程中合成分泌的成分）去处理B种细胞，以阐明A种细胞或药物处理的A种细胞对B种细胞影响的模型。该类模型操作烦琐、干扰因素多、重复性低、机制阐明困难，目前较少应用。

（3）针对疾病的常用细胞模型：

鉴于新药发现和研究多以疾病分类进行，如下按照疾病领域介绍常用细胞模型。因针对疾病的细胞模型种类繁多，在此仅对重大疾病相关细胞模型作概括性总结。

1）心脑血管疾病相关细胞模型

A.内皮细胞损伤保护模型与内皮细胞炎症模型：常用原代培养的人脐静脉内皮细胞、人冠状动脉内皮细胞、人主动脉内皮细胞、人脑微动脉内皮细胞、大鼠主动脉内皮细胞以及细胞株、EAhy926等。常用的制备模型工具药物有过氧化氢、叔丁基过氧化氢、氧化型低密度脂蛋白、同型半胱氨酸、高糖、血管紧张素Ⅱ（angiotensin Ⅱ，AngⅡ）、晚期糖基化终末产物（advanced glycation end product，AGE）、鱼藤酮等。物理性的损伤可采用辐射、低氧等。检测指标主要有细胞活力、活性氧（reactive oxygen species，ROS）生成、细胞内三磷酸腺苷（ATP）含量、乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase，LDH）释放、锥虫蓝染色结果、碘化丙啶（propidium Iodide，PI）染色结果、细胞凋亡率等。内皮细胞炎症模型多采用细胞因子如肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、干扰素（interferon，IFN）以及细菌脂多糖刺激内皮细胞产生炎症，用于筛选抗内皮炎症药物。检测的指标和方法有炎症因子的表达和分泌，细胞黏附分子如细胞间黏附分子-1（intercellular adhesion molecule-1，ICAM-1）、血管细胞黏附分子-1（vascular cell adhesion molecular-1，VCAM-1）等表达、核因子 -κB（nuclear factor-κB，NF-κB）通路激活与抑制等。

B.平滑肌细胞增殖模型：用于增殖模型制备的平滑肌细胞主要来源于实验动物或人血管，如主动脉（鼠、兔、牛、人等）、兔髂动脉、人冠状动脉、支气管、脐动脉、脐静脉等。也有商品化的平滑肌细胞株，如A7r5大鼠主动脉平滑肌细胞、大鼠肺动脉血管平滑肌细胞株CS-54、胚胎大鼠主动脉平滑肌细胞A10等。用于制备增殖模型的工具药有血清、氧化修饰的低密度脂蛋白（ox-LDL）、AGE、Ang Ⅱ、葡萄糖、TNF-α等。检测的主要指标有细胞代谢活力、细胞DNA的合成量、细胞迁移能力及平滑肌细胞表型变化等。

C.泡沫细胞模型：可用巨噬细胞或平滑肌细胞制备泡沫细胞模型。巨噬细胞多采用RAW264.7细胞、J774a.1细胞、小鼠腹腔巨噬细胞以及由人急性单核白血病细胞（human acute monocytic leukemia cell，tohoku hospital pediatrics-1，THP-1）、人组织细胞淋巴瘤 U937细胞、人外周血单核细胞等诱导分化形成的巨噬细胞。诱导药物采用中度氧化型低密度脂蛋白（moderately oxidized low density lipoprotein，m-ox-LDL）。采用液相或试剂盒检测细胞内总胆固醇及胆固醇酯含量以确认模型成功。检测的指标和方法有细胞内胆固醇、胆固醇酯的含量测定，油红O染色、尼罗红染色、苏丹黑染色结果等。机制研究可测定胆固醇代谢和转运相关酶、蛋白质活性和表达。

D.血小板激活聚集模型：采用胶原、凝血酶、胰酶、A23187、血栓素A₂（thromboxane A₂，TXA₂）、腺苷二磷酸（adenosinediphosphate，ADP）、肾上腺素、去甲肾上腺素、血管升压素（vasopressin，VP）、血小板活化因子等进行诱导造模，其中前4种为强效诱导剂。

E.心律失常等心肌细胞模型：可用原代培养的大鼠乳鼠心肌细胞及H2C9心肌细胞等，以乌头碱为工具药建立心律失常模型，多柔比星诱导心肌细胞损伤模型，氯化钴、叠氮钠等诱导心肌细胞缺氧模型等。检测的指标有心肌细胞自发搏动频率、心肌细胞活力、细胞通透性以及细胞内钙等。

F.单核分化巨噬细胞模型：多以佛波酯（phorbol-12-myristate-13-acetate，PMA）、巨噬细胞集落刺激因子（macrophage colony stimulating factor，M-CSF）、白细胞介素（IL）-6等诱导THP-1细胞、U937细胞建立模型。检测指标有细胞黏附功能，细胞体积的变化以及巨噬细胞表面受体如清道夫受体、低密度脂蛋白质受体-1（low density lipoprotein receptor-1，LOX-1）、血小板反应蛋白-1（thrombospondin-1，TSP-1）及其受体CD36等表达变化。用于观察药物对单核细胞分化的影响。

G.单核-内皮细胞黏附模型：采用荧光探针标记的单核细胞株如U937、THP-1等与药物处理前后的内皮细胞共同孵育，观察药物对两种细胞黏附的影响。

2）神经退行性疾病相关细胞模型

A.神经元损伤保护模型：通常采用大鼠原代大脑皮质神经元、大鼠肾上腺髓质嗜铬细胞瘤PC12细胞、小鼠海马神经元HT22细胞、人神经母细胞瘤细胞株SH-SY5Y细胞、SK-N-SH细胞等，尤以PC12细胞应用较多。诱导细胞损伤的工具药物有6-羟基多巴胺（6-hydroxydopamine，6-OHDA）、β-淀粉样蛋白（β-amyloid，Aβ）、1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氢吡啶（MPTP）、H₂O₂、4-羟基壬烯醛（4-HNE）、乙醇、高葡萄糖、同型半胱氨酸、冈田酸、鱼藤酮等。物理的方法有糖/氧剥夺、缺氧-复氧等。检测指标多为细胞存活率（MTT法）、ATP水平、乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase，LDH）水平、活性氧自由基（reactive oxygen species，ROS）水平等。注意商品化的Aβ有Aβ_1-42、Aβ_25-35等多种，用前需要活化。

B.小胶质细胞活化/炎症模型：采用BV-2细胞株、原代培养的小胶质细胞等，以脂多糖（LPS）、Aβ1-42、棕榈酸、TNF-α 等。检测指标有 IL-1β、IL-6、TNF-α、前列腺素 E2（PGE₂）、诱导型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS）、NO、NF-κB通路等。

C.神经血管单元细胞模型：以大鼠脑皮质神经元细胞、鼠脑皮质微血管内皮细胞、大鼠脑皮质星形胶质细胞三种细胞，采用Transwell培养小池共培养，建立神经血管单元模型。通过检测三细胞之间的整体协同生长效应、测定跨内皮细胞电阻值确证模型成功。

3）肿瘤相关细胞模型

A.细胞增殖模型：因目前抗肿瘤药物作用几乎全为直接杀伤肿瘤作用，而肿瘤细胞株在培养时可以无限增殖，无须额外制备模型。利用培养的肿瘤细胞株，直接检测药物的杀伤作用，测定的指标有细胞存活率、LDH水平、ATP含量、细胞凋亡率等。

B.细胞黏附模型：多采用胶原、纤维粘连蛋白、Matrigel等包被细胞孔板使细胞易于黏附，测定药物处理前后的肿瘤细胞的黏附。可直接在显微镜下细胞计数或结晶紫染色后计数。

C.细胞侵袭和迁移模型：肿瘤细胞贴壁后，进行划痕（划痕实验）或者采用Transwell小室，测定药物对细胞迁移能力的影响。亦可采用转化生长因子-β（TGF-β）等处理细胞，以增强模型组细胞侵袭和迁移能力。

D.肿瘤多药耐药（multi-drug resistance，MDR）细胞模型：是肿瘤耐药机制和耐药逆转方法研究的重要工具。肿瘤MDR细胞模型建立方法主要有药物浓度递增诱导法、高浓度反复间歇诱导法、高浓度反复间歇诱导与药物浓度递增相结合法、转基因结合药物筛选法和三维细胞培养法等。前三种模型通常用化疗药物持续处理细胞，诱导肿瘤细胞耐药，以耐药倍数确证模型成功，用于测定药物对耐药的逆转。常用检测指标和方法有耐药指数的变化、生长曲线的测定、相关耐药蛋白如P糖蛋白（P-glucose transporter，P-gp）、多药耐药蛋白 -1（multi-drug resistance related protein 1，MRP1）、肺耐药相关蛋白（lung resistance-related protein，LRP）、乳腺癌耐药相关蛋白（breast cancer resistance protein，BCRP）等的表达等。而三维细胞培养法建立的MDR细胞模型，在生物学活性与在体肿瘤更接近且能模拟体内微环境，弥补其他方法的不足，但培养系统较复杂、实验周期长。

4）糖尿病相关细胞模型

A.胰岛细胞分泌模型：通常采用大鼠原代胰岛细胞、胰岛β细胞系。后者有胰岛素瘤衍生的β细胞系，如RIN细胞、INS-1细胞，转基因建立的胰岛β细胞系，如HIT-T15、MIN-6细胞等。其中，因INS-1细胞含较高胰岛素和对葡萄糖刺激反应良好而广泛应用。常用高糖进行刺激，测定药物对胰岛素分泌的影响。

B.胰岛细胞损伤模型：采用上述细胞，以高糖、H₂O₂等诱导细胞死亡，观察药物对细胞死亡的影响。

C.内皮炎症损伤模型：通常采用高糖、AGE等糖尿病密切相关危险因子进行刺激制备模型。

5）炎症相关疾病细胞模型

A.巨噬细胞炎症模型：可用小鼠巨噬细胞株RAW264.7、小鼠腹腔巨噬细胞、THP-1和U937细胞诱导分化的巨噬细胞。以脂多糖（Lipopolysaccharide，LPS）为刺激工具药建立模型，测定药物的抗炎作用。测定指标有细胞因子如TNF-α、IL-6、IL-1β等表达和分泌，iNOS和COX-2表达，细胞上清PGE₂、NO含量，NF-κB和丝裂原激活的蛋白激酶（mitogen activated protein kinase，MAPK）通路蛋白表达以及 Toll样受体（Toll-like receptor，TLR）-髓样分化因子（myeloid diff erentiation factor 88，MyD88）通路等。

B.脂肪细胞炎症模型：采用3T3-L1分化的脂肪细胞，以LPS刺激，测定指标同上。

目前针对疾病的细胞模型在新药活性筛选及机制研究中被广泛应用。与以动物、器官、组织模型相比，具有需药量低、一致性好、重复性高、操作简单、费用低等优点，尤其是避免牺牲大量动物。但也存在结果不能直接外推至动物、需要整体动物模型确认的缺点。细胞是组成多细胞生物体的基本构件单元，与分子模型相比，细胞模型的结果更容易外推到动物。

当然，在揭示药物作用的分子靶点方面，分子模型具有一定的优势。为扬长避短，目前的分子生物学技术使得越来越多的分子模型与细胞模型整合，利用基因编辑技术，以细胞为平台，实现特定基因的敲入和敲除，研究药物作用机制和确定药物作用的分子靶点。

4.高通量筛选中使用的检测方法

常用的方法主要有比色检测法、荧光检测法、化学发光检测法、放射性核素检测法、形态学方法、核磁共振检测法等。

（1）比色检测法：

通过检测反应的底物或产物在紫外或可见光下最大吸收值的变化，间接地反映体系中酶的活性。优点是操作简便，对仪器要求简单，普通酶标仪即可满足一般高通量筛选的要求。缺点是灵敏度相对较低，需要较大的酶量和底物浓度。

（2）荧光检测法：

荧光检测法具有灵敏度高、使用方便的特点。荧光检测法的技术关键在于荧光物质的标记和荧光物质（指示剂）的获得。目前常用的荧光检测法主要包括荧光强度（fluorescence intensity，FI）法、荧光偏振（fluorescence polarization，FP）法、均相时间分辨荧光（homogeneous time-resolved fluorescence，HTRF）分析法、荧光共振能量转移（fl uorescence resonance energy transfer，FRET）、荧光寿命（fl uorescence lifetime，FLT）等。

1）荧光强度法：

该方法一般需要底物或产物有荧光特性，利用物质激发波长和发射波长的变化，进行物质的选择性测量。

2）荧光偏振法：

该方法是根据荧光发射的方向性原理设计的分析方法，在检测酶催化反应、研究蛋白质相互作用等方面使用较为广泛。在酶抑制剂筛选方面，测定原理是以荧光素标记的底物作为抗原，经过酶反应后加入相应的抗体，底物和抗体结合形成的大分子物质旋转慢，发出的偏振光强，没有和抗体结合的小分子物质旋转快，偏振光弱，由此可以通过荧光偏振的强弱反映酶在体系中的浓度。该方法优点是所需样品量少、灵敏度高、重复性好、操作简便。

3）均相时间分辨荧光分析法：

该方法是一种多参数荧光测定技术，利用激发波长和发射波长的变化，进行各种物质的选择性测量。该方法具有专一性好、灵敏度高、无放射性危害、标记物稳定、线性范围宽、分析速度快和操作简便等优点。

4）荧光共振能量转移：

该方法是指在合适的能量供体和受体分子之间非放射性的能量转移，主要用于受体-配基结合分析，如抗原-抗体反应、受体-配体结合或蛋白质-蛋白质相互作用分析。荧光共振能量转移分析法采用两种荧光物质标记，一是以接受能量后可以产生长时间衰减荧光的螯合物作为标记物质，二是以短时间衰减的共振荧光物质标记，前者在检测中作为能量供体，而后者作为前者能量的受体，后者产生的荧光是检测的信号。当标记物由于结合反应而被带到非常接近的位置，并且能量供体和受体之间波长符合共振条件时，两者之间发生能量转移。荧光共振能量转移分析法的最终检测是记录接收者的时间分辨荧光强度。由于这种反应需要存在共振条件，因此受到的干扰因素就相对减少，提高了分析方法的特异性。

（3）化学发光检测法：

化学发光检测法是一种新型的分析方法，主要是依据化学检测体系中待测物浓度与体系的化学发光强度在一定条件下呈线性定量关系的原理，利用仪器检测体系化学发光强度，具有灵敏度高、选择性较好、仪器简单、分析速度快（多在1分钟之内）、线性范围宽可达几个数量级等优点。

（4）放射性核素检测法：

放射性核素检测法是检测受体配体结合程度以及酶活性变化的常用方法之一。一般是用放射性核素标记底物，测定放射性产物的生成情况。该方法最大的优点是灵敏度高、干扰少、假阳性少。缺点是可产生环境污染，成本相对较高。该方法包括临近闪烁分析法（scintillation proximity assay，SPA）和FLASHPLATESTM技术。

SPA法的反应体系无须分离步骤，可连续观测，适用于自动化操作和高通量筛选。该技术的原理是把药物靶点分子（如受体、酶）固定于特制的含有闪烁液的微球上，与放射性核素标记的配体孵育一段时间，使标记的配体与固定在微球上的受体分子结合。当受体和配基结合以后，核素标记的配基与微球表面距离缩小，标记配基产生的放射活性（通常为β粒子）与闪烁液之间通过能量传递导致微球光闪烁，即可检测与受体结合标记配基量。FLASHPLATESTM技术与SPA技术相似，但固体表面是微板而不是微球。采用这种方法，直接将受体固定在具有闪烁液的微板表面，可有效地降低干扰，效果比微球法更为优越。

（5）形态学方法：

细胞水平的高通量筛选方法可以反映出药物对整体细胞的作用，筛选结果能够提供更多的关于样品的生物活性信息。以细胞为观察对象，除一般常用的检测指标外，细胞形态学的变化具有重要的意义。近年来，高内涵仪器检测可以同时对微板每个孔中的细胞形态进行成像分析，提高了形态学分析的效率。

（6）核磁共振检测法：

应用核磁共振技术可进行药物作用机制研究，主要用于研究小分子化合物与生物大分子的相互作用，可以提供比其他生物活性检测方法更多的信息。电喷雾电离质谱法（electrospray ionization mass spectrometry）和核磁共振光谱（NMR spectrometry）可以用作化合物的筛选，在化合物质谱中可以观察到化合物与一个靶点分子（如受体或酶）紧密结合组成的非共价复合体。改变碰撞能（collision energy），测定复合体解离时的能量，就能测得配体的亲和力。

（三）高通量筛选的基本过程

1.筛选模型的建立及评价

对高通量筛选系统的正确评价可以判断整个药物筛选实验的质量，以及由此所获得的结果的可靠性。为了使模型能够达到筛选要求，需要对筛选模型进行定量评价，评价药物筛选模型常用的定量技术参数有：

（1）信背比（signal background ratio，S/B）：

信背比反映的是筛选模型获得的数据与本底数据之间的差距。一般来讲，S/B越大，信号与本底的距离越大，筛选模型对被测样品的区分度越大。信背比可以按照下式计算：

S/B=M_signal/M_background

式中，S/B为信背比；M_signal为测得的信号数据平均值；M_background为测得的本底数据平均值。一般情况下，信背比的数值应大于3。

（2）信噪比（signal to noise ratio，S/N）：

信噪比是仪器分析中常用的方法评价参数，噪声通常是指在同样测定条件下，本底所产生的记录信号。下式是经过改良用于高通量筛选模型评价的信噪比计算式：

式中，SD为标准差。通常情况下，按照该式计算的信噪比大于10才能认为是可以应用的方法。

（3）信背比的变异系数（coefficient of variation，CV）：

相对变异值可以反映信号的变异情况（变异性），计算时很少用本底值，因为获得的值接近于0时，就不能反映CV的实际情况。变异性可以评价方法的稳定性、溶液操作的准确性和仪器测定的精确性。

CV（%）=100×SD/M

（4）Z’因子（Z’factor）：

在评价高通量筛选模型的方法中，Z’因子是广泛接受的评价指标。它将评价模型质量的主要参数信号窗和信号变异相结合，达到了良好的评价效果。

Z’=1-3×（M_signal+SD_background）/（M_signal-M_background）

Z’因子与S/B、CV有直接而密切的关系。经过推导，可以得出下式：

Z’=1-0.03×（S/B×CV_signal+CV_background）/（S/B-1）

Z’因子是没有单位的参数，其值在0～1。当Z’因子为1时，信号与本底无限分离；当Z’=0时，信号与本底开始交叉。一般要求Z’＞0.4的模型方可用于筛选。

2.初筛和复筛

药物的初筛（primary screening）和复筛均是在分子、细胞水平检测某一样品对某一靶点是否具有药理活性（或亲和力）。初筛中发现的具有一定活性的样品，可以进入复筛程序。复筛时，将样品稀释成系列浓度，采用同一模型，阐明样品对靶点的作用特点、作用强度和量效关系，由此确定为活性化合物（active compound）。

3.深入筛选

深入筛选（secondary screening）是在初筛和复筛的基础上，采用与初筛不同但密切相关的分子和细胞模型，对活性化合物进行深入的药理作用评价，阐明活性化合物的选择性、细胞毒性以及其他性质。根据获得的实验资料，结合活性化合物化学结构的性质特点，进行综合分析，确定化合物的药用价值，选择结构新颖、作用确切的化合物作为先导化合物（leading compound）。

获得先导化合物后，可以直接作为药物候选化合物进行开发，也可借助化学方法或计算机分子设计技术进行结构修饰和优化，以便得到活性更高、缺点更少的先导化合物。

4.确证筛选

确证筛选（confirmatory screening）是对先导化合物进行更为深入的研究，包括药理作用、代谢过程、一般毒性等多方面的内容，以确定其开发前景。对符合药物要求的样品，确定为药物候选化合物（candidate compound），进入开发研究程序，即临床前研究，为临床研究准备必要的资料。

二、高内涵筛选技术

（一）高内涵筛选简介

1999年，Cellomics公司研制开发并生产了世界第一台高内涵细胞分析仪，该项技术的问世揭开了药物筛选研究崭新的一页。高内涵筛选（high content screening，HCS）是指在保持细胞结构和功能完整性的前提下，同时检测被筛样品对细胞形态、生长、分化、迁移、凋亡、代谢途径及信号转导各个环节的影响，在单一实验中获取大量相关信息，确定其生物活性和潜在毒性。从技术层面而言，HCS是一种应用高分辨率的荧光数码影像系统，在细胞水平上检测多个指标的多元化、多层次的筛选技术，旨在获得被筛样品对细胞产生的多维立体和实时快速的生物效应信息。

（二）高内涵筛选的特点及优势

与目前广泛使用的HTS技术相比，HCS的优势体现在以下三个方面：

1.以细胞为单位，实时、动态观测，适用于进行多成分物质的评价和研究 传统的HTS主要是分子水平的筛选，以微孔为单位，获得的信息是微孔板中的平均反应数值。HCS通过实时荧光显微成像和定量图像分析同步反映出样品与单一靶点或多个靶点作用后的细胞生物学功能和结构的变化，从单个或细胞群体的反应中获取定量数据，解析活细胞中复杂的生物语言。相对于HTS分子水平的筛选，HCS不受复合物筛选样品对靶点分子的干扰，能全面反映样品的动态作用与最终综合效应。

2.实现“一药多筛”多靶点检测　HTS可快速发现活性化合物，但其检测模型均建立在单个药物作用靶点的基础上，无法全面反映样品的生物活性特征。HCS通过同步应用报告基因、荧光标记、酶学反应和细胞可视化等常规检测技术，实行多靶点、多指标平行检测，满足一个组分具有多个作用靶点的药理学基本要求，可以获得包括细胞毒性、代谢调节和对其他靶点的非特异性作用等多重效应数据。

3.信息可信度高　首先，HCS获取信息是以细胞为单位，克服了模型细胞数量不一所造成的误差；其次，根据筛选结果，对于效应差异的细胞可以进一步区分，有利于发现活性物质对细胞个体差异影响的复杂机制。

（三）高内涵筛选的技术和应用

1.细胞形态观测

HCS技术可以从三个层面来研究细胞的形态改变。

（1）全细胞形态：

包括形状、大小、突起的数量、长短和方向。

（2）亚细胞形态：

包括细胞内颗粒、纤维或细胞器的位置、走向、数量。

（3）多细胞或细胞间形态：

包括细胞群落或多核细胞的外形、细胞或细胞核的分布情况等。

2.细胞毒性研究

早期、快速和体外毒性评价是提高药物发现效率和准确度的关键所在。当前已经实现高通量化的细胞毒性检测技术主要分为两类：①基于线粒体活性的方法，如MTT法、ATP生物发光法等；②基于细胞膜通透性的荧光染色法，如碘化丙啶（propidium iodide，PI）等。

3.受体功能检测

G蛋白偶联受体是最大的细胞表面受体家族，这类受体的功能性实验大多是基于细胞内钙流测定、报告基因表达或受体内化检测。

大多数G蛋白偶联受体被激动后，可以从细胞表面内吞进入细胞内，即发生受体内吞。根据这一现象，在研究的受体C-末端连接绿色荧光蛋白，并通过融合蛋白转染技术构建各种工程细胞株，可动态观察受体的激活过程，同时寻找目标受体的激活剂。

4.信号通路分析

HCS技术通过转录因子报告基因构建、细胞水平基因重组、荧光标记等技术，实现了对信号通路高通量化、可视化和实时动态的检测和研究。

5.动态分析检测

应用HCS技术进行活细胞动态可视化研究主要体现在：①应用有机小分子染料，测定细胞内离子浓度、线粒体膜电位、细胞器定位和功能等；②采用绿色荧光蛋白、pDsRed及两者变异体的融合蛋白标记技术，可视、定量检测生物大分子的表达、分布、活化和位移。表2-1中列举了部分活细胞动态研究中常用的荧光标记技术。

HCS Studio细胞分析软件通过直观的界面、智能设计和图像分析工具，对高通量和高内涵筛选获得的数据进行科学分析。HCS Studio细胞分析软件以实验流程模块化设计，可使用直观工具访问所有仪器配置和控制功能。通过视觉反馈引导实验流程、进行实验方案设定、图像采集、分析和扫描。同时进行采集和分析，有助于节省时间。确保只采集具有统计学意义的细胞数，节省不必要的扫描时间。HCS Studio细胞分析软件的优势主要有：分析多种图像格式、同时进行两种生物学特性的比较和优化、针对复杂实验进行放大分析、有效降低复杂实验的开发流程和时间投入。

HCS已在新药发现的多个方面开始应用，但它仍然处于发展阶段，在新药研究领域仍面临许多挑战。例如，在仪器运转速效、图像分析处理等方面有待进一步提高，标记靶点分子的技术更需超越现有的荧光染料。总之，随着操作系统、应用工具和实验技术的不断开发，它将成为基于细胞的靶点优化、先导化合物确立以及药物结构与功能关系研究的重要技术手段。