第二节　基于动物模型的药物发现与药物筛选

在现代药物发现过程中，整体动物实验一直是重要的筛选方法。随着分子生物学、细胞生物学的快速发展，逐渐形成以分子和细胞水平为主的高通量和高内涵的筛选技术，但动物模型的药物筛选和评价依然是不可或缺的技术。相对于分子和细胞水平的筛选，整体动物水平的筛选具有直观、全面的优点，对预测被筛选样品的临床效果和应用前景具有十分重要的价值。因此，整体动物水平筛选在新药研发过程中具有不可替代的作用和地位。

整体动物筛选技术的关键是建立更接近于人类疾病的动物疾病模型。因此，研究和制备适当的动物疾病模型，成为药物研究领域的重要课题。理想的整体动物模型应具备与人类疾病的相似性、病理表现的稳定性和药物作用的可观察性。根据动物来源不同，整体动物水平筛选技术可分为以哺乳动物疾病模型为研究对象的传统动物水平药物筛选技术，以及以小型模式动物模型为研究对象的新型动物水平药物筛选技术。

一、传统动物模型的药物筛选

应用小鼠、大鼠、家兔、犬等哺乳动物，通过自身遗传、手术或化学诱导，或运用转基因技术建立相应的模拟人类的疾病模型，进而观察药物的作用。

（一）传统整体动物水平药物筛选模型

1.自发性疾病动物模型

自发性疾病动物模型是在自然情况下实验动物所发生的疾病模型，包括突变系的遗传疾病和近交系的肿瘤模型。突变系的遗传疾病很多，可分为代谢性疾病、分子疾病和特种蛋白质合成异常性疾病等。如无胸腺裸鼠、自发性乳腺癌小鼠、肌肉萎缩症小鼠、肥胖症小鼠、癫痫大鼠、自发性高血压大鼠、自发性糖尿病小鼠和青光眼兔等。自发性疾病动物模型由于是在自然条件下发生的疾病，对于研究人类相应的疾病自发性很有意义。但自发性疾病动物模型通常来源困难，价格较昂贵。

2.诱发性疾病动物模型

诱发性疾病动物模型是通过物理的、化学的和生物的致病因素作用于动物，造成动物组织、器官或全身发生一定的损害，出现某些类似于人类疾病的功能、代谢或形态结构方面的病变。例如用化学致癌剂、放射线、病毒诱发的肿瘤等，采用手术方法诱发的脑卒中、心肌缺血模型等。实验或诱发性疾病动物模型在短时间内可大量复制，并能严格控制各种条件使复制出的疾病模型适合研究目的需要，是最常用的动物水平药物筛选模型。但诱发性疾病动物模型和自然发生的疾病模型仍会存在一定的差异。

3.转基因疾病动物模型

转基因疾病动物模型是通过基因操作方法将已发现的疾病相关基因导入动物的基因组内或从动物基因组中敲除，建立与人类疾病相同的并能遗传给后代的一类动物模型。转基因疾病动物模型避免了诱发性疾病动物模型与人类疾病在病原体、机制方面不尽相同的缺点，能够准确模拟基因缺陷所导致的疾病，模型制备后可以连续使用，大大缩短了研究周期。目前已开发出大量的转基因疾病动物模型用于药物筛选研究，特别是在抗肿瘤、抗病毒、抗阿尔茨海默病、抗帕金森病的药物筛选中取得了突破性进展。但转基因的动物存在动物种属差异、性别不均衡、转基因产物并不一定能长期表达、目的基因能否准确地定位于等位基因上等技术性问题。

（二）传统整体动物水平药物筛选技术特点

传统整体动物水平药物筛选通常是将受试样品对模型动物处理一定时间后，比较受试药物组与正常或模型对照组检测指标变化的差异来判断受试药物的作用。在传统整体动物水平进行药物筛选检测的指标范围较广，生理、生化、血液、免疫、组织病理学、行为学或生长发育等均可作为检测指标反映药物活性。如抗肿瘤药物筛选，可根据药物对肿瘤模型动物的生存率、生命延长时间、肿瘤体积、肿瘤重量等生存状况的影响判断其是否具有抗肿瘤活性。抗糖尿病药物筛选则主要根据动物血糖、糖化血红蛋白等生化指标反映药物的作用。

另外，相对于体外药物筛选技术，体内药物筛选给药剂量较大，给药方式多样，包括口服、腹腔注射、静脉注射、皮肤给药等多种方式。由于所采用的动物的特殊性，决定了传统整体动物水平药物筛选过程主要依赖于手工操作，而且只能对有限数量的受试药物进行筛选，在筛选新药中表现出明显的局限性，即效率低、成本高、时间长、劳动强度大、操作技术要求高等缺点。

二、小型模式动物的药物筛选

近十年来，随着分子生物学技术、自动化成像技术的发展，线虫、果蝇、斑马鱼等小型模式动物，开始广泛用于药物筛选。

（一）小型模式动物分类

1.线虫

秀丽新小杆线虫（Caenorhabditis elegans，C.elegans）与人类基因高同源性，体积较小，组织透明，容易培养，生命周期较短。采用转基因技术在秀丽新小杆线虫中表达荧光标记的特定疾病的相关蛋白质，利用自动化荧光成像平台整合成像采集和数据分析模块定性检测秀丽新小杆的不同生物过程，包括生长、组织形成、细胞活力和自噬。目前，秀丽新小杆线虫主要用于筛选防治衰老、感染、神经退行性疾病等的药物。

2.果蝇

果蝇（drosophila）与线虫类似，与人类基因有高度同源性，同时具有体积小、易于操作、饲养简单、成本低廉、生命周期短（约2周）、繁殖力强、子代数量多以及便于进行表型分析等多种特点。果蝇具有复杂的神经系统与脑组织，阻止药物到达中枢神经系统的屏障作用很弱。但因其培养环境为固体培养，故无法在微孔板中进行，自动化操作困难。利用果蝇建立的疾病模型涉及较多的是神经退行性疾病，包括帕金森病、阿尔茨海默病、多聚谷氨酰胺疾病及脆性X综合征等，以及肿瘤、心血管疾病、线粒体病等。

3.斑马鱼

斑马鱼（zebrafish）是脊椎动物，其心血管系统、视觉系统、免疫系统等与人类相应的系统有许多共同特点，斑马鱼的基因与人类的基因相似度达到85%。斑马鱼个体小，体长3～5cm，饲养简单、成本低。胚胎透明，从完整的活体即可多角度、动态观察到所有内部器官和结构，而且胚胎生长发育快，受精后24小时主要器官基本形成，便于研究组织器官的发育和功能。研究人员已在斑马鱼上模拟多种人类疾病，并用于抗血管生成、凋亡和增殖、抗炎、抗肿瘤等药物筛选。果蝇、线虫表皮坚硬，药物吸收困难，斑马鱼胚胎则可通过扩散来吸收药物，因此斑马鱼是非常合适的小分子药物筛选模型。

（二）小型模式动物药物筛选技术特点

由于线虫、果蝇及斑马鱼等小型模式动物具有饲养容易、个体小、繁殖快等优点，已有研究人员将其用于高通量或高内涵筛选，操作流程可在96孔或384孔微板中进行。

小型模式动物筛选模型检测指标相对传统动物筛选模型简单，主要包括存活率、生长状况、局部组织病理改变等。如壳多糖酶与受精卵孵化成幼体的行为密切相关，而神经退行性疾病常导致行为或移动缺陷，据此建立果蝇神经退行性疾病的模型，根据自动化定量方式监控果蝇受精卵孵化幼体的过程或幼体的行为和移动情况，通过检测撞击频率等指标考察药物的作用。SYTOX荧光染料可与受损细胞的DNA结合，荧光强度的变化可反映小型模式动物死亡率。

近年发展的个体自动分析系统技术为小型模式动物进行高通量筛选提供了巨大支持，如复杂对象参数分析器和分类器（complex object parametric analyzer and sorter，COPAS），流式分选系统，可根据长度、光密度、荧光信号强度等对药物作用小型模式动物后进行分选。斑马鱼的胚胎和幼体是透明的，这个特点对于利用活体成像技术实时的观测相关蛋白质的表达和特定表型的（神经）细胞分布等有利，是啮齿类或其他模式脊椎动物无法比拟的。结合绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）标记技术，可以观察分析药物影响神经生长或突触发育的各个因素是如何发挥作用的，了解突触的生长和突触发育调节的细胞分子机制。通过对斑马鱼心肌细胞进行荧光标记，建立一种新的迅速评价新药对心律影响的方法，将斑马鱼放入96孔板后，自动监测心律，用于评价抗心律失常类药物的药效。也有利用自动成像技术和血管内皮细胞表达绿色荧光蛋白的斑马鱼胚胎，筛选抑制血管形成的小分子。即能在血管形成过程中特异性表达绿色荧光蛋白，呈现带有绿色荧光的血管，借助于共聚焦显微镜，便能直观、精细地观察到血管形成的全过程，通过抑制血管生成活性进行评价，筛选药物抗肿瘤血管生成的作用。

小型模式动物模型是整体动物水平药物筛选新技术的发展趋势，对于提高新药研发速度和效率将起到重要作用，将来有可能取代部分体外模型，如血管生成模型等，但其目前仍然主要是作为传统整体动物水平药物筛选模型的补充。与传统整体动物水平药物筛选模型相比，小型模式动物和人类基因的同源性低，给药方式主要为液体给药，因此在哺乳动物模型上进行药物确证研究依然不可替代。