第十节　凝血酶生成试验

机体凝血系统包括凝血和抗凝两个部分。凝血和抗凝保持平衡，使得血液在血管内保持流体状态，当这一平衡被破坏则发生出血或血栓形成。凝血酶是人体凝血功能的核心，机体凝血机制一旦启动很快有少量凝血酶形成，随之凝血酶通过对凝血因子、血小板的反馈激活迅速形成大量凝血酶，凝血酶使纤维蛋白原转化成纤维蛋白，引起血栓形成达到止血目的。凝血酶生成量的降低，增加出血风险；凝血酶生成量的升高，增加血栓风险。近年来，凝血酶生成试验（thrombin generation test，TGT）的半自动化检测方法已有了很大的发展。该试验是一个评估机体凝血状态的良好指标，主要检测血浆标本凝血酶生成的趋势。尽管目前已经有很多研究显示了凝血酶生成和出血或者静脉血栓形成之间的相互关系，但是用于临床诊断仍然受标准化的限制。目前采用自动校正凝血酶曲线（calibrated automated thrombogram，CAT）法对凝血酶进行监测。

一、检测原理

CAT法能完整地记录体外凝血酶的生成。其主要原理为乏血小板血浆（platelet-poor plasma，PPP）试剂或富血小板血浆（platelet-rich plasma，PRP）试剂作用于待测血浆，激活凝血系统，最终使凝血酶原活化成凝血酶。逐渐生成的凝血酶作用于荧光底物ZGGR-AMC（z-Gly-Gly-Arg-Amino-Mehtyl Coumarin），使之裂解并释放荧光基团AMC，AMC在390nm波长激发光的作用下发出460nm波长的荧光。荧光读数仪实时检测产生的荧光强度，同时荧光读数仪与装有Thrombinoscope软件的电脑连接，软件自动描绘凝血酶生成的曲线，并自动计算曲线下面积、峰值、延迟时间、达峰时间。主要步骤为在检测孔中加入80μl乏血小板血浆和20μl PPP 5pM，校正孔中加入80μl乏血小板血浆和20μl 校准品。上机后仪器自动向每个孔内加入20μl FluCa（含荧光底物和Ca2+），通过Thrombinoscope软件动态检测凝血酶生成量。

二、检测结果

CAT能全面地反映机体的凝血状态，该法主要有5个参数①延迟时间（Lag Time）即从反应开始到凝血酶开始生成所经历的时间，以分钟（min）为单位；②峰值（peak）即生成凝血酶的最大量，以nM（nmol/L）为单位；③达峰时间（time to peak）即从反应开始到凝血酶达最大量所需要的时间，以分钟为单位；④凝血酶生成潜力（endogenous thrombin potential，ETP）即凝血酶生成曲线下的微积分面积，其反映凝血酶生成的量，以nM·min为单位；⑤ETP比值，即患者ETP与正常人ETP的比值，以百分率（%）为单位。曲线及各参数具体见图6-9。

三、临床应用

有研究显示，凝血酶生成试验可作为预测血友病患者出血风险的有效方法。ETP比值作为全面反映机体凝血状态的指标，可有效评估患者的出血风险。对于血友病患者，建议进行FⅥ：C/FⅨ：C和TGT联合检测。

凝血酶生成试验可以用来监测口服华法林的抗凝治疗，ETP和PT-INR的联合监测能更好地控制口服华法林药物的剂量，反应机体的凝血状态，从而有效地防止出血的发生。凝血酶生成试验的各项参数与凝血因子FⅤ、FⅩ活性及出血症状的发生及严重程度具有相关性，结合APTT、PT及凝血因子活性可以作为评估遗传性凝血因子缺陷症患者出血倾向的有效手段，能对临床预防和治疗起一定的指导作用。

血栓形成是在血管内皮细胞、血小板、凝血、抗凝、纤溶系统以及血液流变学等多种因素改变的综合作用下发生的，这些因素在血栓形成之前已发生不同程度的变化，即血栓前状态（prethrombotic state，PTS），此时凝血功能增强，纤溶功能减弱，有血栓形成倾向但尚未形成血栓，或者形成少量血栓正处于溶解状态。凝血酶的过量生成则是血栓形成的重要因素，凝血酶生成增高是体内血栓前状态的直接证据。妊娠期高血压疾病（HDP）患者凝血酶生成的异常其发生机制可能是由于患者胎盘缺血、缺氧及梗死，有不同程度数量的破碎绒毛滋养细胞进入孕妇体循环，经肺循环时绒毛滋养细胞溶解释放大量组织细胞，促进了内外凝血途径的激活，导致凝血酶生成的增高。有文献报道，凝血酶生成试验对于评估HDP患者病情的发展和预后有着重要的意义，可以作为预测HDP患者血栓形成及DIC发生的实验室检查方法。

四、质量控制

1.人员

检验人员应具有相应的专业技能和适当经验，在首次使用和操作前，需经培训人员系统培训；在试验进行前，检验人员应认真阅读使用说明书和操作规程，并了解该试验的基本特征。

2.试验所需要条件及所需空间

包括温度，湿度，通风，pH等；pH ＜ 5.0时，凝血酶生成受到抑制。

3.排除荧光仪影响因素

试验工作原理主要采用荧光法，要排除荧光仪的影响因素，要了解何种标本必须经过处理才能进行测量，才能得出准确的结果。

4.检测指标

要了解荧光仪及其软件所描绘的曲线能否满足本实验室的需要。

5.器材和试剂

所有仪器、器具维护应当按厂商提供的方法进行，使用试剂之前，应认真阅读说明书并严格按说明操作；应保证试剂批号、参考材料和血液采集装置的可能地点等正确和完整的记录；所有试剂应标有认可的有效日期和复溶日期。

6.排除凝血因子干扰

包括 FⅡ、FⅤ、FⅦ、FⅧ、FⅨ等。ETP、峰值与FⅡ呈线性关系，与FⅤ和FⅦ成双曲线关系，与FⅩ的关系取决于组织因子的多少。FⅧ和FⅨ的缺乏，导致峰值比正常人降低25%～30%，ETP比正常人降低60%～70%，延迟时间和达峰时间延长。纤维蛋白原含量影响凝血酶生成试验的峰值、ETP和延迟时间，随着含量的降低延迟时间缩短。

7.乏血小板血浆试剂中的组织因子（TF）

TF会极大地影响TGT的检测结果。组织因子含量较低时，除了FⅪ以外的其他凝血因子都可影响凝血酶生成试验；组织因子含量高时，仅外源性凝血因子对该试验有影响。

8.患者禁服任何抗凝药物

华法林通过抑制肝脏环氧化还原酶，使无活性的氧化型维生素K（vitK）无法还原为有活性的还原型vitK，使凝血因子Ⅱ、Ⅶ、Ⅸ、Ⅹ合成过程中的前体不能羧基化，从而使其合成减少，最终减少凝血酶的形成，发挥抗凝作用。目前常用的监测指标是凝血酶原时间——国际正常化比值（PT-INR）。研究表明，当PT-INR在1.51～3.0时，随着PT-INR值的递增，ETP逐渐降低；提高华法林剂量当PT-INR ＞ 3.0，ETP不再降低。肝素与抗凝血酶（AT）形成复合物，可灭活凝血过程中许多被激活的凝血因子，无论如何对任何一种凝血因子的抑制作用都将引起凝血酶生产减少。在乏血小板血浆中低肝素含量（0.1～0.3U/ml）几乎完全抑制凝血酶的生成。富血小板血浆上清液中，血小板被激活后，可有0.5U/ml的肝素被中和，但并不影响凝血酶的生成量，仅仅只是延缓其生成。

9.制备血浆不得混入血小板和白细胞

在制备PPP过程中，混入微量的血小板或白细胞都会使凝血酶生成延迟时间、达峰时间缩短；峰值、ETP及ETP比值升高。

10.其他因素

包括FⅤ Leiden突变在内的许多血栓高危因素均可引起凝血酶生成增加，使一些患者的低凝状态得到改善，从而减少患者出血。此外，影响凝血酶生成试验的体内因素还有抗凝血酶、肝素辅因子、蛋白C、蛋白S、组织因子途径抑制剂和α-巨球蛋白等，体外因素有温度及pH等。

（李　健　缪　琼　张利伟）