第一节　组织培养的诞生与发展简史

19世纪初，研究神经系统发生的生物学家们对于神经细胞轴突最初在胚胎中形成的方式存在着不同的看法，这种争论一直持续了很久。1886年，瑞士解剖学家和胚胎学家Wilhelm His提出假说，认为原始的胚胎神经元或成神经细胞的细胞质向外突起而形成轴突，它不断地延伸，直至其前端与周围感觉器官或肌肉纤维接触时为止。1890年，西班牙组织学家Santiago Ramony Cajal应用胚胎神经组织切片的银渍染色技术研究神经元的发生，所得结果支持了His的学说。然而，反对His和Cajal的学者却坚持“细胞链”的理论（“cellchain”theory），此理论认为，从神经细胞到某种受神经支配的周围组织之间有许多原为分散的细胞，这些连贯的链细胞融合起来便形成了轴突。

1907年，美国动物学家Ross Granville Harrison根据其研究结果，发表了多篇有关鱼类和两栖类胚胎外周神经组织的科学论文，并得出结论认为His和Cajal的假说可能是正确的。用他自己的话来说是“用普通组织学方法尚不能肯定地回答神经纤维的起源问题”。他认为要解决此问题，最好设计出一种能在生活状态下直接观察正在生长的神经末端的方法，以便得到关于胚胎发育期间神经纤维从神经中枢延伸到外周所发生变化的正确概念。

抱着这个目的，Harrison首先解剖出蛙胚原始脊髓的节段，将它们放入生理盐水，然而组织块未能存活下来，并最终崩溃解体。以后他又试用过半固体明胶培养基，但仍然以失败告终。1907年春，他设计出一种很有效的方法，即哈里森悬滴培养法，成功地观察到神经纤维的外长。下面是他在同一年发表的有关这个方法的原始描述：“使用的方法是分离已知能产生神经纤维的胚胎组织小块，……并观察它们进一步的发育。从长约3mm的、神经褶闭合不久的蛙胚取出小块，此时尚未有肉眼可见的分化的神经成分。小心切下一片组织后，即用精细的小吸管将此组织小块移至一块事先滴有从成体蛙淋巴囊吸取的新鲜淋巴液的盖片上。淋巴液很快凝固，使组织小块固定在一定的位置上。然后将盖片倒置于一块中间凹陷的厚载片上，盖片的周缘用蜡封固（图1-1）。只要采取严格的无菌操作技术，在此条件下，组织能够存活一周，在某些情况下这个标本还可以存活近四周。这些标本用高倍显微镜能很容易地每天进行观察”。

毫无疑问，Harrison必须解决的一个首要问题是防止培养物被细菌污染。这曾使他多次尝试归于失败，虽然他发现“准备仪器要花费许多时间，谨慎的繁琐操作令人疲惫，每天能完成的实验却寥寥无几”，但他持之以恒，最后终于建立起一套合理的无菌操作技术程序。

Harrison的耐性与恒心得到了应有的报偿。他首次成功地在体外培养基（凝结的淋巴液）中培养了神经元，从而排除了所有其他活组织参与的可能性，并且能够按小时观察轴突从成神经细胞长出来，有力地证实了His和Cajal理论的正确性。

事实上，Harrison并非是使细胞在体外存活的第一个人。早在1885年，Wilhelm Roux已把一小片鸡胚组织培养于温盐水中，它们存活了好几天。此外，Arrold于1885年，Jolly于1903年曾把青蛙和蝾螈的白细胞输注于生理盐水或血清中，观察到活细胞的运动及分裂。但是，现在一般皆公认Harrison为组织培养之父，因为他的实验表明，细菌学家早已应用的凹玻片悬滴制备培养技术不仅可以维持组织体外生长数周，而且是一种能对生物学知识作出十分重要贡献的研究方法。

由于Harrison的聪明才智和持之以恒，他成功地建立了能解决当时培养物易污染与脱落等问题的技术。他还通过发表文章和做学术报告，间接地吸引了许多其他科学家注意到组织培养的潜在重要性，从而作出有意义的贡献。然而遗憾的是，他本人没有使这项技术得到进一步完善。实际上，最初对本方法作出重大改进的是一位美国临床医生M.T.Burrows，他于1910年在Harrison实验室工作了数月，学习了这种技术。当时Burrows对培养温血动物的组织很感兴趣，他发现青蛙淋巴作为培养基有很多待改进之处，部分原因是它不能形成很坚实的凝块，此外，要得到足够的数量颇为困难。Burrows决定在悬滴培养法中用鸡血浆作为鸡胚组织的支持和营养物质。实验证明，它比淋巴液要好得多，能使神经组织、心脏组织及皮肤生长良好。

于是，Burrows继续与他的法国同事Alexis Carrel合作，致力于培养哺乳动物组织。不久，他们成功地培养了成年犬、猫、小鼠、豚鼠，以至恶性组织的外植物。此外，他们证明体外培养细胞的寿命可以因传代而延长，即可把活细胞转移至新鲜的培养基中。1912年，Burrows和Carrel证明，若把胚胎提取液（鸡胚匀浆离心得到的半透明液体）与血浆混合使用，培养物可存活与生长得更好一些。甚至，心肌细胞的收缩可达2～3个月。

Carrel原是外科医生，他把严格的外科无菌操作引进到组织培养技术中来，对改进组织培养技术方面也作出了很大贡献。他所发展的方法给其他生物学家留下的印象是：组织培养是一项十分费力而昂贵的工作。然而，他指出，用反复传代的方法使细胞系存活34年之久是可行的。他的这一成就在很大程度上归功于他所发明的卡氏培养瓶（Carrel flask，图1-2）。使用这种瓶能容易地避免组织的偶然性污染，同时也简化了许多维持长期培养所需的操作。至今，卡氏培养瓶还不时被实验室采用。此外，马克西莫（Maximow）于1925年对Harrison的悬滴培养法作了改进，创造了“马克西莫双盖玻片培养法”（图1-3），可以更好地防止污染，也更适用于神经组织的培养。

两位美国科学家W.H.Lewis和M.R.Lewis从另一个角度研究了培养技术。他们最先试用已知成分的合成培养基取代不能正确确定其成分的天然培养基（血浆及胚胎提取液）。由于他们以及其他许多科学家在此后30年的努力，最终发展出许多合成培养基。现在这些培养基都已定型，可现成购得（参阅第二章及附录）。由于有了人工合成的培养基，可以大量减少天然培养基的比重，甚至在一定程度上细胞可以在已知成分的合成培养基中生长，也就是在无血清培养基（serum-free medium，SFM）中生长。

培养方法的另一个主要进展是器官培养方法的建立，它使人们有可能用一种十分不同的方法进行组织培养，其目的在于维持小块组织，以至整个胚胎器官的体外生长，借此保持它们正常的组织学结构，并防止外植物新长出的细胞生长紊乱。英国剑桥Strangeways研究室的Honor Fell使此方法更臻完善。她在1929年发表的论文中是这样描述这个方法的：事先准备好置有小鸡血浆与胚胎提取液混合形凝块的表玻皿，把鸡胚器官原基置于凝块上，再将表玻皿置于培养皿内，同时在培养皿内备有湿润的棉花。外植物从下面的血浆凝块中吸取营养，同时从与之接触的空气中吸取氧气。这样的细胞从外植物中迁移出去的倾向极小（图1-4）。Fell及其同事使用这种技术培养骨和关节组织，极大地丰富了我们有关这些组织发育的知识。英国格拉斯哥大学Ian Freshney研究员编写的Culture of Animal Cells：A Manual of Basic Technique and Specialized Applications在推动细胞培养的近代发展起着不可磨灭的作用，该书迄今已推出第七版，成为最权威、最经典的著作。

进入20世纪50年代，细胞培养技术得到快速发展。1952年Dulbecco发明了胰蛋白酶消化细胞传代技术，同年Gey等建立了第一个人宫颈癌HeLa细胞系。1963年，Todaro和Green证明培养细胞可发生自发性转化。1964年，Kleinsmith和Piece证明胚胎干细胞（embryonic stem cell，ESC）具有多能性。1975年，Köhler和Milstein利用细胞融合方法制备了单克隆抗体。1998年，J.A.Thomason等首次成功培养了人胚胎干细胞系。J.Geahart从人胚胎生殖嵴原始生殖细胞培养了胚胎生殖干细胞（EG cell）。2006年，Takahashi和Yamanaka将Oct3/4、SOX2［Y染色体性别决定区（sex-determing region of Y chromosome，SRY）-盒转录因子2（SRY-box transcription factor 2）］、C-myc和KLF4四个基因导入小鼠成体细胞，建立了具有胚胎干细胞相似特征的诱导多能干细胞（induced pluripotent stem cell，iPS细胞），从而为组织工程与再生医学奠定了基础，更加彰显出细胞培养技术的无限生命力。如今，细胞培养已成为全世界有关生命科学与医学实验广为应用的技术之一。

1927年发表的组织培养相关的参考文献目录只有400篇，而1947年一年的医学索引中有关组织培养的论文便已超过3万篇。至目前，几乎无法统计每年有关组织培养的文献究竟有多少（图1-5）。此外，还有专门的杂志出版，如In Vitro、Cell and Development Biology、Tissue Culture Research Communications等。至于Cell、Science、Nature、Nature Cell Biology、EMBO J、J Cell Biol、Cancer Res等世界著名杂志涉及组织培养的论文也比比皆是。我国的《分子细胞生物学报》《细胞生物学杂志》《解剖学报》、Cell Research，以及相关的《中华医学杂志》《基础医学与临床》等也不乏细胞培养的文章。现在组织培养已被应用于生物医学的各个领域，例如，建立了细胞培养技术后，人们才能于1956年确认人染色体正确数目是46条。以后又发现唐氏综合征（Down syndrome）是由于出现额外染色体所致（21-三体）。在病毒学领域里，细胞培养的应用使得病毒培养更加简化。由于在细胞培养的研究中应用了电子显微镜以及核素技术，人们对于细胞运动机制、细胞超微结构以及代谢活动有了更深入的了解。事实上，单克隆抗体的问世也是细胞培养技术与免疫学技术相结合的硕果。20世纪末，人们提出与实施“人类基因组计划（Human Genome Project，HGP）”以及近年来再次兴起的干细胞（stem cell）、iPS细胞及其在生物工程与再生医学（regenerative medicine）中的应用以及基因组学革命（gnomic revolution）更是离不开组织和细胞培养技术。

细胞培养技术最早传入我国是在20世纪30年代。李继侗、沈同、罗宗洛、王伏雄、罗士韦、崔瀓等是植物组织培养的先驱者，我国已故的著名解剖学家张鋆、细胞学家鲍鉴清和杨敷海等则最早将动物组织培养技术引进国内。早在1933年，张鋆开始从事软骨鱼血细胞培养，1934年发表《培养组织之创伤治疗》，主张将组织培养用于医疗实践；1940年，他又将组织培养技术用于脂肪细胞发生的研究。鲍鉴清于1951年最早在我国建立较完善的组织培养室，1955年出版我国第一部《组织培养技术》专著。杨敷海于1934年发明杨氏培养基，对黑热病病原体培养与检测作出巨大贡献；此外，他还试用鹿血清替代牛血清进行细胞培养的研究。至20世纪50年代，组织培养已在我国逐步开展起来，不少著名科学家为我国及世界的组织培养研究及应用作出巨大贡献，唐仲平、王潜渊、汤飞凡、张晓楼、黄祯祥、郭辉玉和向近敏等在微生物，尤其在病毒的细胞培养；黎尚豪在单细胞绿藻大量培养；高尚荫、刘年翠在昆虫组织培养；魏曦利用鸡胚作为饲养物培养牛胸膜肺炎支原体或用人组织细胞碎片涂于琼脂表面培养回归热螺旋体或斑疹伤寒立克次体螺旋体；陈瑞铭在器官培养；吴旻、曾毅、何申、潘琼婧、鄂征、姚开泰等在肿瘤细胞培养；姚錱、吴祖泽等在干细胞培养；鲍璿、邵文钊、郭畹华在神经组织培养等各个方面均作出令人瞩目的成绩。顾方舟运用组织病毒培养生产脊髓灰质炎疫苗为我国脊髓灰质炎的防治作出巨大贡献。薛庆善对我国19世纪前的组织培养研究及技术方法做了全面的总结。